高效液相色譜法測定黃瓜中雙炔酰菌胺殘留量

◎ 黎 東，張周莉，雍 萍，廖 蘭，易 達(dá)

（南充市食品藥品檢驗(yàn)所，四川 南充 637000）

隨著國內(nèi)外社會經(jīng)濟(jì)逐漸發(fā)展，食品安全備受人們關(guān)注，農(nóng)藥殘留已為食品安全問題的關(guān)注焦點(diǎn)之一。農(nóng)藥在防蟲、防害、保護(hù)及促進(jìn)農(nóng)作物生長的同時(shí)伴隨著超量使用甚至濫用，造成的農(nóng)藥殘留量超標(biāo)問題對人們的生活環(huán)境和身體健康造成嚴(yán)重的威脅。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國2020年農(nóng)藥行業(yè)規(guī)模以上企業(yè)化學(xué)農(nóng)藥原藥（100%）產(chǎn)量為225.4萬t，國內(nèi)農(nóng)藥使用量為145.6萬t，已躍居全球最大的農(nóng)藥生產(chǎn)使用國。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，每年全球由于農(nóng)藥殘留受到健康影響人數(shù)約為300萬人，其中中毒致死人數(shù)約為30萬人，農(nóng)藥殘留產(chǎn)生的食品安全問題頻頻發(fā)生[1]。

雙炔酰菌胺殺菌劑是近幾年國外公司開發(fā)的一種新型羧酸酰胺類卵菌病毒殺菌劑，針對黃瓜霜霉菌、葡萄霜霉病、辣椒疫霉病、馬鈴薯晚疫病和番茄晚疫病等靠氣流傳播、潛伏期長、發(fā)病迅猛、浸染速度快的病菌具有無交互抗性、效果好、活性高、持效期長、殺菌譜廣的特點(diǎn)[2]。近幾年市場成長性非常好，2009—2014年復(fù)合年增長率為58.5%。隨著雙炔酰菌胺的大量使用，雙炔酰菌胺農(nóng)藥殘留逐漸引起人們關(guān)注，國外發(fā)達(dá)國家及我國標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)對該類農(nóng)藥制定了最高殘留限量。我國最新頒布的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2021規(guī)定了黃瓜中雙炔酰菌胺殘留量，但未推薦相應(yīng)的檢測方法[3]。目前報(bào)道的果蔬中雙炔酰菌胺檢測方法主要為液質(zhì)法，具有設(shè)備昂貴、操作難度大、人員要求高等缺點(diǎn)，蔬菜中雙炔酰菌胺高效液相色譜檢測方法亦未見報(bào)道[4-5]。

本文采用乙腈提取樣品，分散固相萃取凈化提取液，高效液相色譜法為檢測方法，建立了黃瓜中雙炔酰菌胺殘留量的定性及定量分析方法，該方法具有操作簡便快捷、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，可以作為雙炔酰菌胺定性及定量檢測的參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：雙炔酰菌胺，純度99.28%，德國Dr.E；乙腈，色譜純，諾爾施；無水硫酸鎂，成都科隆，分析純；氯化鈉，分析純，成都科?。粰幟仕徕c二水合物（C6H5Na3O7·2H2O），分析純，國藥集團(tuán)；檸檬酸二鈉鹽倍半水合物（C6H5Na3O7·1.5H2O），分析純，國藥集團(tuán)；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA），粒徑：40～60 μm，逗點(diǎn)生物；十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18），粒徑：40～60 μm，逗點(diǎn)生物；石墨化炭黑（GCB），40～120 μm，逗點(diǎn)生物；陶瓷均質(zhì)子，2 cm（長）×1 cm（外徑），逗點(diǎn)生物；微孔濾膜，13 mm×0.45 μm，津騰。

1.2 儀器與設(shè)備

DIONEX UHPLC+Ultimate 3000型高效液相色譜儀，美國Thermo公司；Multi-Reax型渦旋振蕩器，德國heidolph；5810R型冷凍離心機(jī)，德國eppendorf公司；KQ-700DE型超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司；N1-50型氮吹濃縮儀，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取適量（精確至0.000 1 g）的雙炔酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈溶解配制濃度為290 0 μg·mL-1左右的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，保存于-18 ℃冰箱內(nèi)。進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，以50%乙腈水溶液作為稀釋劑，用標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制出濃度分別為 0 μg·mL-1、2.90 μg·mL-1、7.25 μg·mL-1、14.50 μg·mL-1、29.00 μg·mL-1、58.00 μg·mL-1、116.00 μg·mL-1、174.00 μg·mL-1、232.00 μg·mL-1和290.00 μg·mL-1的溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 試樣采集及制備

在農(nóng)貿(mào)市場隨機(jī)采集黃瓜樣品3份，每份1 kg，將采集后的樣品切碎，充分混勻，四分法取一部分后用組織搗碎機(jī)勻漿，放入聚乙烯瓶中，于18 ℃條件下保存。

1.3.3 樣品前處理步驟

稱取約10 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL塑料離心管中，加入10 mL乙腈，高速勻漿3 min，加入4 g無水硫酸鎂，1 g氯化鈉，1 g檸檬酸鈉二水化合物，0.5 g檸檬酸二鈉鹽倍半水化合物，劇烈振蕩1 min，4 200 r·min-1離心5 min。定量吸取5 mL上清液至內(nèi)含除水劑和凈化材料的塑料離心管中（每毫升提取液使用150 mg無水硫酸鎂、25 mg PSA、2.5 mg GCB），渦旋混勻1 min。4 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液過0.45 μm有機(jī)微孔濾膜，待測定。

1.3.4 液相色譜儀器條件

色譜柱：中譜紅RD-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動相：流動相A為水，流動相B為乙腈，A∶B=50∶50；檢測波長：223 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件選擇

通過DIONEX UHPLC+Ultimate 3000型高效液相色譜儀二極管陣列檢測器紫外波長全掃描功能，獲得雙炔酰菌胺的紫外全波長掃描圖1，從圖中可以看到雙炔酰菌胺紫外最大吸收波長在195 nm及223 nm附近，波長195 nm附近具有較大的溶劑干擾，將檢測波長定為223 nm可保障雙炔酰菌胺具有較大吸收峰同時(shí)基質(zhì)干擾較輕。色譜柱對比了中譜紅RD-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） 和 Ailent Eclipse Plus C8（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）2種色譜柱的分離效果和儀器響應(yīng)。結(jié)果表明，雙炔酰菌胺在中譜紅RD-C18柱子上具有較好的峰形和重現(xiàn)性，雙炔酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖2，而Ailent Eclipse Plus C8分離度低，出峰時(shí)間過快。因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇中譜紅RD-C18分離待測物質(zhì)。雙炔酰菌胺化學(xué)性質(zhì)為弱極性，用乙腈作為溶劑溶解樣品，并選擇乙腈和水作為流動相，為得到更好的分離效果和峰形，將流動相按不同比例在色譜柱上進(jìn)行試驗(yàn)，最終確定流動相為乙腈∶水=50∶50，在流速1.0 mL·min-1時(shí)，對雙炔酰菌胺目標(biāo)物質(zhì)及雜質(zhì)能夠進(jìn)行很好的分離，具有分離度高、峰形對稱因子高、基線平穩(wěn)及分析時(shí)間短等特點(diǎn)，提高了工作效率。

圖1 雙炔酰菌胺的紫外全波長掃描圖

圖2 雙炔酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.2 樣品提取及凈化

本實(shí)驗(yàn)以乙腈作為樣品提取溶劑，比較了勻漿3 min、陶瓷均質(zhì)子振蕩5 min及超聲20 min 3種樣品溶液提取方式，確定勻漿3 min加標(biāo)樣品可得到較高的回收率。利用便捷快速前處理方法對樣品進(jìn)行提取，在均質(zhì)機(jī)中將提取劑和樣品充分勻漿后，再加入硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉二水合物、檸檬酸二鈉鹽倍半水合物，提取時(shí)加入硫酸鎂脫除樣品溶液中的水分。加入氯化鈉、檸檬酸鈉二水合物、檸檬酸二鈉鹽倍半水合物可以通過鹽析作用提升提取效率，實(shí)驗(yàn)表明該方法可較好地將樣品中雙卻菌酰胺提取完全。QuEChERS法檢測農(nóng)殘的前處理過程中應(yīng)用廣泛，實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵點(diǎn)在于選擇分散固相萃取材料的品種和用量。通過考察GCB、C18、PSA 3種種常見的基質(zhì)分散萃取材料，實(shí)驗(yàn)表明，GCB凈化效果最明顯，但是對雙炔酰菌胺也會有一定程度的吸附，導(dǎo)致回收率較低，而PSA和C18對藥物的吸附不顯著，同時(shí)也有足夠的凈化能力，PSA對蔬菜水果樣品基質(zhì)凈化能力高于C18，最后選擇以PSA為主以GCB為輔作為萃取凈化試劑。使用不同用量的PSA和GCB處理提取液，最后確定凈化每毫升提取液時(shí)，以25 mg PSA、2.5 mg GCB作為萃取凈化試劑比較合適。

2.3 方法線性關(guān)系、線性范圍及檢出限

將配制的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液在上述色譜操作條件下進(jìn)行分析，以雙炔酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測方法線性方程式為Y=0.452 0X+0.321 3、相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9，線性范圍為 0.145 ～ 290.0 μg·mL-1。在樣品中按照 7.25 mg·kg-1濃度加標(biāo)，根據(jù)建立的檢測方法測得結(jié)果，檢出限LOD以信噪比3倍進(jìn)行計(jì)算，定量限以信噪比10倍進(jìn)行計(jì)算，得到馬鈴薯中3種農(nóng)藥檢出限為0.01 mg·kg-1及定量限為0.03 mg·kg-1.

2.4 方法回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取10.0 g陰性黃瓜于50 mL離心管中，分別添加一定量的雙炔酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加濃度 水 平 為 0.03 mg·kg-1、0.30 mg·kg-1、5.80 mg·kg-1、29.00 mg·kg-1于冰箱中冷藏過夜后按所建立方法處理測定。每個(gè)添加濃度重復(fù)6次，計(jì)算回收率和精密度，結(jié)果見表1。由表1可見，在0.03～29.00 mg·kg-1范圍內(nèi)，黃瓜中雙炔酰菌胺添加的回收率為82.5%～94.5%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.64%～4.80%，方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表1 方法回收率和精密度測定結(jié)果表（n=6）

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜法測定黃瓜中雙炔酰菌胺殺菌劑殘留量的分析方法，該方法采用QuEChERS法進(jìn)行樣品溶液提取，使用分散固相萃取法進(jìn)行凈化，本方法的準(zhǔn)確度和精密度高，線性關(guān)系良好，具有簡便、快速、準(zhǔn)確及分離效果好的優(yōu)點(diǎn)，為雙炔酰菌胺可行性分析方法。