小反芻獸疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白C和V基因突變的克隆與表達

和偉程，石曉玲，李 菊，張瀟文，劉方程，李瓊毅，柏家林,*

(1.西北民族大學生物醫(yī)學研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室， 甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學生命科學與工程學院；3.甘肅省醫(yī)學科學研究院)

小反芻獸疫 (PPR)是由小反芻獸疫病毒 (PPRV)引起的一種急性、主要感染小反芻動物綿、山羊的傳染病。PPR因其發(fā)病率、死亡率高，給養(yǎng)羊業(yè)帶來嚴重危害。PPRV屬于副粘病毒科、麻疹病毒屬病毒，已被列入世界動物衛(wèi)生組織應(yīng)報告的陸生動物疾病清單。根據(jù)國際病毒分類學委員會的最新病毒分類法，該病毒已更名為小反芻動物麻疹病毒 (SRMV)。麻疹病毒屬病毒有麻疹病毒(MeV)、牛瘟病毒(RPV)、小反芻獸疫病毒(PPRV)、犬瘟熱病毒(CDV)、海豹瘟熱病毒(PDV)、鯨類動物麻疹病毒(CeMV)和貓科動物麻疹病毒(FMV)7個成員，都有相似的基因組成。PPRV呈球形，有包膜，直徑為150～700 nm，病毒基因組約為16 kb的單股負鏈RNA?；蚪M從5'-3' 端由N、P、M、F、H和L 6個基因組成，分別編碼N、P、M、F、H和L 6個結(jié)構(gòu)蛋白，參與構(gòu)成病毒粒子。此外，P基因還額外編碼兩個非結(jié)構(gòu)蛋白C和V，在病毒誘導宿主免疫功能抑制與疾病發(fā)生中起重要作用。也有研究表明非結(jié)構(gòu)蛋白還與病毒毒力有。

C蛋白和V蛋白是P基因的產(chǎn)物，通過RNA編輯從P蛋白轉(zhuǎn)錄單元中獲得，C蛋白分子量約20 kD，不發(fā)生磷酸化修飾。前期同屬病毒相關(guān)研究表明C蛋白與L蛋白可在高分子量聚集體中相互結(jié)合，促進病毒RNA的合成，敲除C基因的重組麻疹病毒 (MV)不會在感染動物中繁殖。但由于V和C缺陷病毒都能誘導高水平的中和抗體和強烈的細胞免疫應(yīng)答，它們可以為免疫缺陷個體開發(fā)合適的疫苗。V蛋白分子量約32 kD，V蛋白需要磷酸化修飾，敲除V基因的MV可導致病毒RNA合成受阻和病毒效價降低，從而影響病毒毒力。研究表明C、V蛋白均參與I型干擾素應(yīng)答的初始階段，缺失C蛋白的重組MV在具有完整I型干擾素系統(tǒng)的細胞中復制緩慢，且突變型毒株感染細胞后I型干擾素的表達量顯著高于野生型，C蛋白缺失的仙臺病毒 (SeV)在感染期間可產(chǎn)生更多的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，進而激活I(lǐng)FN-β啟動子的轉(zhuǎn)錄促進IFN-β的產(chǎn)生。反之，野生型病毒不產(chǎn)生dsRNA，對IFN-β的產(chǎn)生有抑制作用，但PPRV C蛋白在IFN-β誘導中的作用機制仍需進一步探究。副粘病毒V蛋白能通過結(jié)合黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5(MDA-5)或視黃酸誘導基因I (RIG-I)抑制IFN-β啟動子的激活。PPRV V蛋白N端的110位酪氨酸能阻斷轉(zhuǎn)錄激活子1 (STAT1)的磷酸化并阻止其進入細胞核，在阻斷IFN-β誘導的STAT1的活化中發(fā)揮重要作用，富含半胱氨酸的C端可以通過結(jié)合κB激酶a抑制劑 (IKKα)抑制IRF7的活性從而下調(diào)IFN-β的產(chǎn)生。

迄今為止，小反芻獸疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白C和V的研究相對較少，為進一步研究其功能，本研究運用PCR技術(shù)克隆了點突變的C和V基因，構(gòu)建了兩種突變基因真核表達載體p3Flag-CMV-14-ΔC和p3Flag-CMV-14-ΔV，通過重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞檢測了突變基因的表達，為進一步C蛋白和V蛋白的功能提供了科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚胎腎細胞(HEK-293T)由甘肅省動物細胞技術(shù)創(chuàng)新中心提供；HEK-293T和Vero細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)；質(zhì)粒p3Flag-CMV-14-C、p3Flag-CMV-14-V及p3Flag-CMV-14由西北民族大學生物醫(yī)學研究中心提供。

1.2 試劑

Ex Taq DNA 聚合酶、Hind III、EcoR I、Kpn I購自大連寶生物公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司；RNA提取試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自廣州美基生物科技有限公司；凝膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；抗Flag標簽抗體，抗β-actin抗體，山羊抗鼠抗體購自Sigma公司；胎牛血清、新生牛血清購自北京賽澳美細胞技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自蘭州民海生物工程有限公司；Power up SYBR Green master mix購自Applied Biosystems公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，Pierce增強ECL蛋白印跡化學發(fā)光底物購自ThermoFisher Scientific公司。

1.3 PPRV病毒突變基因擴增

根據(jù)GeneBank登錄的PPRV Nigeria 75/1 C和V基因序列 (序列號為ADX95992.1和ADX95991)，設(shè)計C基因和V基因qPCR引物 (表1)。參照報道設(shè)計突變基因ΔC和ΔV的PCR引物序列，ΔC基因5’端引入Hind III酶切位點，3'引入Kpn I酶切位點；ΔV基因5'引入Hind III酶切位點，3'端引入EcoR I酶切位點(表1)。ΔC基因：起始密碼子AUG突變?yōu)锳CG，并在氨基酸序列的第9位、第12位引入終止密碼子(圖1A)。ΔV基因：在氨基酸序列的第7位、第285位、第294位引入三個終止密碼子(圖1B)。以p3Flag-CMV-14-C和p3Flag-CMV-14-V質(zhì)粒DNA為模板擴增ΔC和ΔV基因。引物由生工生物工程 (上海)有限公司合成。以p3Flag-CMV-14-C、p3Flag-CMV-14-V質(zhì)粒為模板擴增ΔC和ΔV基因，PCR反應(yīng)體系為50 μL：Ex Taq Buffer 5 μL，Ex Taq 0.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，上下游引物各 1 μL，模板 2 μL，補加 ddH2O 至 50 μL。PCR反應(yīng)程序：35 個循環(huán)，98 ℃ 5 min ，95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min。配制1.2%的核酸膠，并進行膠回收。

表1 PCR和qPCR引物的核苷酸序列

圖1 PPRV病毒ΔC基因 (A)和ΔV(B)基因突變策略

1.4 突變基因重組表達載體構(gòu)建

用Hind III和Kpn I，Hind III和EcoR I 分別雙酶切p3Flag-CMV-14和ΔC，p3Flag-CMV-14和ΔV基因片段，T4DNA連接酶將目的基因連于載體上，構(gòu)建重組表達載體p3Flag-CMV-14-ΔC和p3Flag-CMV-14-ΔV，進行雙酶切和測序驗證。

1.5 突變基因的表達

1.5.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞 將HEK-293T細胞 (2×105)接種于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)至70%～90%匯合時，按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明書每孔分別轉(zhuǎn)染p3Flag-CMV-14-ΔC (2.5 μg)、p3Flag-CMV-14-ΔV (2.5 μg)、p3Flag-CMV-14-C (2.5 μg)、p3Flag-CMV-14-V (2.5 μg)和p3Flag-CMV-14 (2.5 μg)。轉(zhuǎn)染后24 h收集細胞，分別提取RNA和蛋白質(zhì)進行RT-qPCR和Western blot檢測。

1.5.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 使用RNA提取試劑盒提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照實時熒光定量PCR試劑盒操作說明進行ΔC和ΔV基因表達測定。qPCR反應(yīng)體積20 μL：Power up SYBR Green master mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL, ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件為：95℃、30 s，95℃、5 s，60℃、34 s，72℃、1 min，40個循環(huán)，在熒光定量PCR儀(Life Technologies Holdings Pte Ltd, The United States of America)進行擴增并分析結(jié)果。

1.5.3 蛋白質(zhì)印跡(Western blot) 將轉(zhuǎn)染后的細胞用細胞裂解液(RIPA)與蛋白酶抑制劑(PMSF)進行裂解，加上樣緩沖液處理，然后進行SDS-PAGE電泳，將蛋白移到PVDF膜上，用2.5%脫脂奶粉液封閉1 h，加1∶2 000稀釋的鼠抗Flag抗體孵育2 h，PBST洗6次，加帶有HRP標記的羊抗鼠IgG孵育1 h，PBST洗滌5次，用去離子水終止反應(yīng)，Pierce增強ECL蛋白印跡化學發(fā)光底物觀察結(jié)果。使用β-Actin作為內(nèi)參蛋白。

1.6 統(tǒng)計學分析

運用Graphpad Prism 7 (San Diego, CA, USA)對結(jié)果進行Student’s t-test統(tǒng)計分析。每組數(shù)據(jù)用mean ± SEM表示，至少設(shè)置三個重復。兩組間P<0.05表示差異顯著用“*”表示，P< 0.01和P<0.001表示差異極顯著，分別用“**”和“***”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPRV突變基因ΔC和ΔV的擴增

根據(jù)設(shè)計的特異性引物ΔC-F和ΔC-R, ΔV-F和ΔV-R分別從p3Flag-CMV-14-C和p3Flag-CMV-14-V質(zhì)粒擴增獲得大小約為533 bp的PPRV病毒突變基因ΔC和896 bp的PPRV病毒突變基因ΔV片段，其大小與預(yù)期基因片段一致 (圖2)。

圖2 PPRV突變基因 ΔC和ΔV 片段PCR擴增電泳

2.2 突變基因重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將擴增獲得ΔC和ΔV的產(chǎn)物與p3Flag-CMV-14載體連接后得到重組質(zhì)粒p3Flag-CMV-14-ΔC和p3Flag-CMV-14-ΔV。經(jīng)Hind III與Kpn I、Hind III與EcoR I雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分別得到約533 bp的ΔC和896 bp的 ΔV基因條帶，以及約6 310 bp載體骨架條帶 (圖3)，其結(jié)果與預(yù)期大小一致。測序表明，重組表達質(zhì)粒中ΔC和ΔV基因序列與其設(shè)計模板序列 (包括突變堿基)同源性分別為99.8%和100%。除了引入的突變位點外，p3Flag-CMV-14-ΔC中ΔC序列的第123位發(fā)生單堿其突變A123G，但其編碼氨基酸未改變，均為精氨酸，對后期表達無影響(圖4)。

圖3 重組質(zhì)粒pFlag-CMV-ΔC和pFlag-CMV-ΔV

圖4 重組質(zhì)粒p3Flag-CMV-14-ΔC測序鑒定

2.3 突變基因表達檢測

6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)HEK-293T細胞至70%～90%匯合時，Lipofectamine 2000每孔分別轉(zhuǎn)染p3Flag-CMV-14-ΔC (2.5 μg)、p3Flag-CMV-14-ΔV (2.5 μg)和p3Flag-CMV-14 (2.5 μg)。轉(zhuǎn)染24 h后，轉(zhuǎn)染p3Flag-CMV-14和p3Flag-CMV-14-ΔC質(zhì)粒細胞C基因表達極顯著低于轉(zhuǎn)染p3Flag-CMV-14-C細胞(P<0.001)，p3Flag-CMV-14和p3Flag-CMV-14-ΔC轉(zhuǎn)染細胞中C基因幾乎無表達，差異不顯著(P>0.05)(圖5A)。Western blotting檢測表明轉(zhuǎn)染p3Flag-CMV-14-ΔC細胞中C蛋白也無表達(圖5B)。結(jié)果表明通過PCR突變技術(shù)獲得了表達沉默的C基因。同樣，轉(zhuǎn)染p3Flag-CMV-14和p3Flag-CMV-14-ΔV質(zhì)粒細胞V基因表達極顯著低于轉(zhuǎn)染p3Flag-CMV-14-V細胞(P<0.01)，p3Flag-CMV-14-ΔV轉(zhuǎn)染細胞中V基因雖然有表達，但表達量不高，與轉(zhuǎn)染p3Flag-CMV-14細胞V基因表達量差異不顯著(P>0.05)(圖6A)。Western blotting檢測表明轉(zhuǎn)染p3Flag-CMV-14-ΔV細胞中V蛋白也無表達(圖6B)。結(jié)果表明通過PCR突變技術(shù)獲得了表達沉默的V基因。

圖5 C基因和C蛋白在HEK-293T細胞中表達

圖6 V基因和V蛋白在HEK-293T細胞中表達

3 討論

在全球牛瘟根除計劃(GREP)成功實施后，國際獸疫局(OIE)已開始采取多種措施控制PPRV的傳播。自2007年我國西藏首次出現(xiàn)PPR病例以來，該病不斷向其他地區(qū)擴散，其發(fā)病率逐年上升，對我國養(yǎng)羊業(yè)和野生動物造成巨大的危害。目前該病治療方法有限，主要依靠接種疫苗進行預(yù)防。

與所有副粘病毒一樣，PPRV基因組編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白C是從P基因前半部分開放閱讀框的第二個ATG開始編碼的表達蛋白。C蛋白分子量約20 KDa，無磷酸化，與L蛋白結(jié)合，定位于細胞核或細胞質(zhì)。C蛋白在免疫逃逸和疾病發(fā)生中有不同的作用。副粘病毒科病毒中，C蛋白主要通過兩種機制抑制IFN產(chǎn)生，一種是C蛋白減少病毒復制，因此減少了PRRs可以識別的基因基序的數(shù)量，從而降低了IFNs的產(chǎn)生；另一種是C蛋白直接干擾PRRs信號通路，影響IFN基因的轉(zhuǎn)錄。PRRs信號中，MeV-C、RPV-C蛋白的靶標已被識別，但PPRV-C蛋白靶標未見報道。盡管確切機制仍不清楚，但MeV-C、RPV-C蛋白作用于細胞核中IRF3，干擾了IRF3的轉(zhuǎn)錄而不影響其磷酸化、二聚化或核積聚，從而阻斷IFN-I的生成，其作用機理是IRF3二聚體位阻了IFN-β啟動子。MeV-C蛋白還能阻斷NF-κB信號通路，但比V蛋白弱，表明副粘病毒C蛋白可能還存在其它機制抑制宿主免疫反應(yīng)。雖然V蛋白可能是MeV感染過程中IFN信號的主要拮抗劑，也有報道C蛋白也能阻斷IFN-I信號通路?？傊?，副粘病毒科病毒C蛋白抑制干擾素誘導的信號通路是天然免疫啟動上的一個必要組成部分，如MeV-、RPV-C蛋白一樣，PPRV C蛋白是否影響PRRs通路是將來研究重點，對闡明PPRV免疫抑制機理具有重要意義。

麻疹病毒屬病毒P基因通過其開放閱讀框移碼的特殊編輯策略，在保守的RNA編輯位點5'-TTAAAAGGGCACAG-3'插入一個G或兩個G產(chǎn)生V蛋白或W蛋白，該位點沒有堿基插入時合成P蛋白，V蛋白是麻疹病毒屬病毒的毒力因子。與其他病毒P、V、W蛋白一樣，PPRV V蛋白含有氨基端結(jié)構(gòu)域，但氨基酸序列同源性不高；羧基端有富含組氨酸和半胱氨酸的鋅指結(jié)構(gòu)，氨基酸序列同源性高。副粘病毒科呼吸病毒屬、亨尼病毒屬、輪狀病毒屬和麻疹病毒屬病毒編碼的V蛋白分子量28-32 KDa，被磷酸化后與N、L蛋白結(jié)合在一起，均可產(chǎn)生IFN信號逃逸。與其他副粘病毒科病毒一樣，麻疹病毒屬病毒V蛋白可在IFN-I信號轉(zhuǎn)導通路的不同階段均可產(chǎn)生干擾作用，阻斷干擾素信號，抑制細胞的抗病毒作用。PPRV V蛋白通過與STAT1和STAT2互作抑制IFN信號通路，介導天然免疫逃逸。PPRV V蛋白對ISRE和GAS啟動子表達的抑制作用比N和P蛋白強烈，其氨基端結(jié)構(gòu)域第101位酪氨酸突變?yōu)楸彼崮軠p弱IFN信號通路的抑制，表明這一結(jié)構(gòu)域的功能是拮抗IFN信號轉(zhuǎn)導，羧基端結(jié)構(gòu)域鋅指結(jié)構(gòu)中的保守半胱氨酸簇和色氨酸基序與STAT2也有互作，其中第275和第277兩個氨基酸發(fā)揮重要作用。麻疹病毒屬病毒V蛋白不僅與STAT1和STAT2作用，還能干擾其上游Jak家族蛋白質(zhì)的磷酸化，MeV、CDV、RPV和PPRV病毒的V蛋白能抑制Tyk2磷酸化，但只有強毒RPV的V蛋白才能破壞Jak1的磷酸化。在這些實驗中，所有V蛋白都能免疫共沉淀Jak1和Tyk2，而不影響其磷酸化，表明V蛋白可能結(jié)合于IFNR受體的Jak1/Tyk2復合體，然后破壞信號轉(zhuǎn)導。這種輔助的IFN-I抑制機制表明麻疹病毒可能有幾條途徑阻斷IFN-I和IFN-II信號通路，提示了這一途徑在該屬病毒致病性上具有重要作用。

很少有研究關(guān)注PPRV、RPV病毒V蛋白抑制IFN產(chǎn)生路徑或與RLR的互作。至少有13種副粘病毒V蛋白能與MDA5結(jié)合從而抑制IFN產(chǎn)生。已證實MeV-V蛋白羧基端結(jié)構(gòu)域與MDA-5結(jié)合，該結(jié)構(gòu)域還與LGP2相互作用，而不是與RIG-I直接作用抑制它的信號轉(zhuǎn)導。MeV-V蛋白還能干擾其他PRRs誘導的信號通路，如抑制漿細胞樣樹突狀細胞中TLR7/9誘導的IFN產(chǎn)生；與IKKɑ互作阻礙IRF7激活，進而影響IFN-β生成；抑制NF-κB活性等。雖然RPV、PPRV病毒V蛋白與RLR或TLR信號通路接頭蛋白的互作還沒有更多研究，但研究表明RPV病毒通過C蛋白抑制MDA-5信號而不是V蛋白。盡管如此，PPRV-V蛋白能夠抑制IFN-β啟動子活性，表明RPV-和PPRV-V蛋白作用不完全一樣。PPRV-V蛋白是否與MeV蛋白作用靶點相同仍有待研究。與其他麻疹病毒一樣，PPRV-V蛋白通過削弱IFN-I和IFN-II信號、阻止IFN產(chǎn)生而在抑制細胞的抗病毒作用中發(fā)揮必要作用。

本研究將PPRV C基因起始密碼子AUG突變?yōu)锳CG，并在氨基酸序列的第9位、第12位引入終止密碼子，在V基因編碼氨基酸序列的第7位、第285位、第294位引入三個終止密碼子，運用PCR技術(shù)擴增獲得了表達沉默的突變基因ΔC和ΔV，構(gòu)建了真核表達載體p3flag-CMV-14-ΔC和p3flag-CMV-14-ΔV。實時熒光定量PCR (RT-qPCR)檢測表明轉(zhuǎn)染突變基因質(zhì)粒HEK-293T細胞中C基因和V 基因表達均極顯著降低, 蛋白質(zhì)印跡檢測表明轉(zhuǎn)染突變基因質(zhì)粒細胞中C蛋白和V蛋白均無表達。研究結(jié)果為進一步研究PPRV病毒C和V蛋白的功能提供了科學依據(jù)。