精漿胞外囊泡對精子功能的作用研究進展

徐志謙，謝言射，蔡更元，吳珍芳，黃思秀*，洪林君*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣東廣州 510642；2.國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510642）

精子功能是衡量雄性生殖能力的重要指標，研究精子功能對雄性經(jīng)濟動物生產(chǎn)性能的發(fā)揮和男性生育能力的檢測診斷具有重大意義。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）資料顯示，不孕不育是影響人們生活質(zhì)量的重要疾病之一，在不育相關(guān)因素中，男性相關(guān)的原因占50%。據(jù)經(jīng)合組織-糧農(nóng)組織（OECD-FAO）預測，到2027 年，全球肉類需求量將增長15%，保證這種增長離不開利用生物技術(shù)來提高畜禽的生產(chǎn)性能，尤其提高畜禽的繁殖水平。精液中的精漿對精子功能具有重要作用，精漿可作為攜帶精子的介質(zhì)并為其提供營養(yǎng)，在精液凝固和液化以及精子運動和受精中起著重要作用，精漿還可以調(diào)節(jié)精子的功能及其在雌性生殖道中的生理活動，尤其是雌性生殖道免疫系統(tǒng)的相互作用。本文綜述了精漿中的胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）在精子功能中的研究進展，以期拓展精子功能調(diào)控相關(guān)的認識，為提高雄性動物繁殖力以及為男性不孕不育相關(guān)疾病治療提供參考。

1 精子受精能力形成的生理過程

精子一般由睪丸中未分化的精原細胞發(fā)育而成，睪丸中生成的精子由曲細精管進入附睪，在附睪中經(jīng)歷形態(tài)上的變化，從而成為初步成熟的精子。附睪不同區(qū)域具有不同的生理環(huán)境，它們在精子通過附睪的過程中與精子相互作用，逐漸使精子具備完全受精能力，一些生理或病理性疾病引起的附睪功能障礙會影響精子的質(zhì)量和功能，進而可能影響生育能力。當精子被射出后，精子與雄性生殖道性腺分泌的精漿混合在一起。精漿中含有大量的成分如無機離子、糖、有機鹽、電解質(zhì)和蛋白質(zhì)，這些成分會進一步重塑精子質(zhì)膜，改變精子的生理狀態(tài)，對精子受精能力產(chǎn)生影響；同時，精漿中的一些成分還可以結(jié)合到精子細胞膜上，對精子產(chǎn)生保護作用，如精漿中的蛋白質(zhì)在射精時可結(jié)合到精子表面，精子膜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域也會因此發(fā)生改變，從而影響精子的受精功能。當精子進入雌性生殖道后，便開始為精卵結(jié)合做準備。在這個過程中，精子中的凝集素和纖連蛋白等蛋白可將精子結(jié)合到子宮上皮細胞，一方面可使精子儲備在這個部位，另一方面也可使精子避免被雌性生殖道免疫細胞攻擊清除。當雌性排卵時，輸卵管上皮細胞釋放排卵相關(guān)信號，促使精子獲能和超激活，并游近卵母細胞然后穿透卵母卵丘細胞復合體。最后，精子與透明帶結(jié)合，發(fā)生頂體反應，最終進入卵母細胞完成受精過程。對于雄性動物來講，睪丸中精子發(fā)生、附睪精子成熟以及性腺分泌的精漿對精子的調(diào)控是影響精子功能的重要方面，也是研究雄性生育能力的幾個重要切入點。

2 EVs 概述

EVs 最早在網(wǎng)織紅細胞轉(zhuǎn)向成熟紅細胞發(fā)生的非特異性的細胞釋放囊泡到細胞外的生理過程中觀察到，被認為是細胞丟棄膜蛋白的一種機制。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)EVs 不僅只是細胞排出廢棄物的一個載體，還是細胞間通訊的重要介質(zhì)，比如EVs 參與核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)等物質(zhì)轉(zhuǎn)運，以及作為正常細胞間穩(wěn)態(tài)或非正常細胞病理情況的一個信號傳導載體。但目前學術(shù)界對于EVs 還沒形成統(tǒng)一的分類及命名方法，一般根據(jù)其囊泡直徑大小可大致分為外泌體（Exosome）、微囊泡（Microvesicle）和凋亡小體（Apoptotic Body），其中外泌體直徑一般在30～150 nm，微囊泡在100 nm～1 μm，凋亡小體1～5 μm。不同EVs 產(chǎn)生的方式不同，外泌體一般是由細胞通過向內(nèi)芽生方式形成有膜包被的內(nèi)體小泡，進而成為多囊泡體（Multivesicular Bodies，MVBs），多囊泡體再通過與細胞膜融合將其所含囊泡釋放至胞外，從而生成外泌體；而細胞膜直接通過向外芽生方式形成小泡則稱為微囊泡；凋亡小體則主要是一種細胞凋亡過程中向外釋放的一類EVs。EVs 在體內(nèi)主要參與介導細胞間的信息交流及調(diào)控作用。過去研究者認為細胞間交流通訊包括3 種機制：第一種是通過膜結(jié)合信號分子（如受體）或細胞間間隙連接的接觸依賴性信號傳導機制，第二種是通過分泌可溶性分子（如細胞因子和趨化因子）的短距離旁分泌形式的信號傳導機制，第三種是基于激素信號作用進行調(diào)節(jié)的長距離內(nèi)分泌信號傳導機制。近年來隨著對EVs研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)EVs 可攜帶miRNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等調(diào)節(jié)因子到達受體細胞，發(fā)揮細胞間的交流作用。由EVs 介導的細胞間交流主要通過激活細胞膜表面受體、囊泡內(nèi)吞或與細胞膜融合等形式發(fā)揮作用。

3 精漿胞外囊泡（Seminal Plasma Extracellular Vesicles，SP-EVs）的組分及功能

精子的成熟、獲能及受精是一個復雜的生理過程，需要體內(nèi)不同器官間以及細胞間的高度交流和協(xié)調(diào)。Χu 等在雄性生殖道及其附屬性腺腺體分泌物中證實了EVs 的存在。研究認為，精液中含有大量EVs，來自于精囊腺、附睪、前列腺和尿道球腺等雄性生殖系統(tǒng)腺體的分泌物，這些來源于雄性生殖道的各種EVs 統(tǒng)稱為SP-EVs。人SP-EVs 平均數(shù)量約為10個/mL精液，粒徑大小在50～250 nm；豬精液中的SP-EVs密度在1.7×10個/mL 左右，粒徑大小＜300 nm；牛精液中SP-EVs 密度在1.1×10～1.3×10個/mL，粒徑大小在120～200 nm。

研究者已經(jīng)認識到SP-EVs 在體內(nèi)參與精子的成熟過程，以及精子獲能、頂體反應和受精等過程，但對精漿中這些EVs 如何生成、不同物種間的生理功能及其作用方式仍未闡明，目前對SP-EVs 的研究主要針對來源于附睪和前列腺的EVs。其中附睪產(chǎn)生的EVs 一般被稱為附睪小體（Epididymosomes），主要由附睪上皮細胞的邊緣形成細胞質(zhì)凸起從細胞分離后再分解釋放附睪小體，然后進入附睪腔內(nèi)環(huán)境中。前列腺產(chǎn)生的EVs 一般稱為前列腺小體（Prostasomes），主要由MVB 與腺泡細胞質(zhì)膜融合后所釋放，是最早在精液中發(fā)現(xiàn)與精子成熟及功能相關(guān)的囊泡狀物質(zhì)，其直徑在50～500 nm，并且其中含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸等物質(zhì)。SP-EVs 的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。

圖1 SP-EVs 的結(jié)構(gòu)示意圖

3.1 附睪小體對精子功能的作用 在附睪中，附睪小體與精子細胞膜的生理變化有很大關(guān)系，如它與精子磷脂組成改變、膽固醇/磷脂比率變化、總負電荷的增加及膜表面蛋白的修飾都有關(guān)系，而這些變化與精子成熟有重要關(guān)系。1985 年，研究者對中國倉鼠附睪分泌的附睪小體進行研究，人們首次對這一物質(zhì)有了系統(tǒng)的認識。研究者在中國倉鼠中發(fā)現(xiàn)附睪頭部后側(cè)的精子上存在著直徑20～100 nm 的囊泡狀膜泡，這些膜泡富含膽固醇，它與精子的頂體區(qū)域結(jié)合，因此人們認為它與精子細胞膜膽固醇的轉(zhuǎn)移有關(guān)。

附睪小體攜帶去能相關(guān)因子，可以促進精子在附睪中的移動并防止精子過早獲能。目前研究者們已在附睪小體中發(fā)現(xiàn)了許多功能性物質(zhì)。其中研究者在小鼠中通過液相色譜并結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜標簽定量對小鼠SPEVs 進行蛋白質(zhì)組學分析，共發(fā)現(xiàn)1 640 個附睪小體蛋白，且蛋白在附睪不同區(qū)段間存在顯著差別。GO（Gene Ontology）注釋表明大部分附睪小體蛋白位于細胞外泌體中，并參與轉(zhuǎn)運、氧化還原、代謝等生理過程，并證實了附睪小體蛋白可轉(zhuǎn)運到精子，進而發(fā)揮相關(guān)作用；此外，通過GO 注釋新發(fā)現(xiàn)附睪小體蛋白參與精子受精和與透明帶結(jié)合相關(guān)的生理過程。巨噬細胞遷移抑制因子是附睪小體中的重要成分，它可通過調(diào)節(jié)精子鞭毛中的游離巰基而影響Zn流出，進而影響精子致密纖維，從而參與精子成熟過程。此外，附睪小體中的醛糖還原酶可抑制精子能量生成，使成熟的精子保持靜止狀態(tài)，然后在附睪尾部和輸精管再通過山梨醇脫氫酶活性將山梨醇氧化為果糖，從而為精子通過女性生殖道提供所需的能量。另外，谷胱甘肽過氧化物酶5 也是附睪小體的一種蛋白成分，它可保護精子免受氧化應激，同時保持DNA 的完整性。

附睪小體對精子產(chǎn)生作用可能與其轉(zhuǎn)運功能性調(diào)控物質(zhì)到精子有關(guān)。有研究表明精子在通過附睪的過程中會攝取不同蛋白質(zhì)尤其是GPI 錨定蛋白，以促進膜的完整性。人附睪蛋白CD52 是一個細胞表面高度糖基化的GPI 錨定小肽，被認為是負責轉(zhuǎn)移附睪分泌蛋白至精子，而富含GPI 錨定蛋白的附睪小體在這其中發(fā)揮重要作用。P26h 和P25b 是一對等位基因，它們編碼精子質(zhì)膜上的2 種錨定蛋白。研究發(fā)現(xiàn)倉鼠精子在經(jīng)過附睪時P26h 含量增加，而相應附睪小體相關(guān)的P26h 數(shù)量減少，這表明附睪小體可轉(zhuǎn)運該蛋白到精子；同時，在牛附睪中發(fā)現(xiàn)P25b 參與附睪小體向精子轉(zhuǎn)移蛋白的生理過程。附睪小體功能與其生成的部位也有關(guān)，每一段附睪生理作用不同，其細胞及細胞分泌物的生理功能也不相同。而且附睪小體-精子相互作用中存在相應的受體，如乳脂球EGF 因子8（Milk Fat Globule-EGF Factor 8，MFGE8），說明附睪小體可主動轉(zhuǎn)運其內(nèi)含物至精子，在牛上已證實附睪小體可將附睪分泌蛋白選擇性轉(zhuǎn)移到精子內(nèi)。這些都說明附睪小體在精子成熟過程中發(fā)揮重要作用。在小鼠和牛上的研究還證實了大部分附睪小體的miRNA 可在精子中檢測到，說明了二者間具有頻繁的物質(zhì)交流和相互作用，附睪小體可介導一些小RNA（small RNAs，sRNAs）如miRNA 的轉(zhuǎn)移，這些sRNAs 都與精子成熟過程具有重要關(guān)系。除了miRNA 外，Sharma 等通過sRNA測序發(fā)現(xiàn)在附睪腔液中存在大量來源于轉(zhuǎn)運RNA 的小片段（transfer RNA-derived RNA fragments，tRFs），其總量可占到sRNA 的80%，這些tRFs 可將遺傳信息傳遞到下一代小鼠?？傊?，附睪小體與附睪中精子的成熟具有重要關(guān)系，大量研究表明附睪腔內(nèi)的RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)可通過附睪小體轉(zhuǎn)運到精子中，進而對精子成熟產(chǎn)生影響。

3.2 前列腺小體對精子功能的作用 雄性動物SP-EVs還有一部分是來源于前列腺的前列腺小體，它最早在人類精液中被發(fā)現(xiàn)。前列腺小體屬于一種特殊的SPEVs，它具有很高的膽固醇/磷脂比例（接近2:1），其磷脂含量大部分為鞘磷脂，前列腺小體膜中的脂肪酸大多數(shù)是飽和脂肪酸（硬脂酸和棕櫚酸）或單不飽和脂肪酸（油酸），這種結(jié)構(gòu)有利于前列腺小體的穩(wěn)定，同時有利于前列腺小體與其他細胞融合，并將其內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到受體細胞。目前已有報道前列腺小體中含有二肽基肽酶IV 和氨基肽酶N，二者都可從前列腺小體轉(zhuǎn)移到精子中，說明前列腺小體具備將其內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到精子的能力，從而發(fā)揮調(diào)控功能。

為探索前列腺小體的生理功能，研究人員以輸精管結(jié)扎者的精液中EVs 為研究對象，確保不含睪丸或附睪分泌物，鑒定前列腺小體的特征，發(fā)現(xiàn)在這些前列腺小體中都含有前列腺干細胞抗原，這是一種前列腺特異的蛋白質(zhì)，說明鑒定到的囊泡來源于前列腺。而且這些前列腺小體可分為粒徑為（56±13）nm 和（105±25）nm的2 個群體，它們在密度、大小和表面蛋白標記物CD9的存在等方面都與外泌體特征一致。前列腺小體含有高含量的膽固醇，它可與精子結(jié)合抑制膽固醇流出，有利于抑制射出的精子過早獲能并維持精子頂體的完整性，從而延長精子在體外存活時間。精子進入雌性生殖道后需要穿過子宮頸和透明帶以完成受精，這需要精子具備強有力的前進動力。而前列腺小體富含不同的蛋白質(zhì)和二價陽離子，如鈣、鎂、鋅離子等，前列腺小體可通過調(diào)節(jié)這些離子濃度變化促進精子活力，幫助精子受精。除此之外，精子與前列腺小體融合可誘導持續(xù)Ca信號反應，從而影響精子運動。研究者也發(fā)現(xiàn)在前列腺小體中富含與無氧酵解相關(guān)的酶，以及參與ATP 轉(zhuǎn)換的腺苷酸激酶、ATP 酶、5-核苷酸酶和己糖轉(zhuǎn)運蛋白，這些酶都與ATP 生成有關(guān)，說明前列腺小體通過調(diào)節(jié)能量代謝從而調(diào)節(jié)精子活力。再者，前列腺小體還可能通過與白細胞的直接相互作用、與補體系統(tǒng)的相互作用或抗菌及抗病毒機制調(diào)節(jié)雌性生殖道免疫反應，維持精子在雌性生殖道中的活力。另外，前列腺小體還能參與NADPH 氧化酶抑制嗜中性粒細胞中過氧化物產(chǎn)生從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。精子質(zhì)膜因不飽和脂肪酸含量高，其本身體積小，細胞質(zhì)含量少，容易受氧化應激的影響，而精液中產(chǎn)生的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）被認為是造成先天性不育的重要原因之一，研究發(fā)現(xiàn)添加前列腺小體可減少精液整體ROS 水平，說明精液中前列腺小體具備抗氧化作用。在精液常溫保存和冷凍保存過程中會產(chǎn)生很多的ROS，這也意味著通過研究精液中SP-EVs相關(guān)作用機理可為提高精液常溫保存和冷凍保存的效率提供新的途徑。

研究前列腺小體的相關(guān)特征還可為前列腺癌早期診斷及轉(zhuǎn)移提供有價值的信息。前列腺小體通常從柱狀的前列腺上皮細胞頂端分泌到腺腔中，然后進入精液或尿液中，而惡性的前列腺上皮細胞變成長方體并失去極性，當這些細胞侵入正常組織后，它們分泌的前列腺小體可直接進入前列腺組織的空腔中，或直接分泌到血液循環(huán)中。通過對比正常和前列腺癌分泌的前列腺小體特征，找出其中的關(guān)鍵差異，就可為早期診斷提供便利。研究人員通過利用高效液相色譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜對人SPEVs 進行蛋白質(zhì)組學分析，共發(fā)現(xiàn)1 474 個蛋白，GO富集分析發(fā)現(xiàn)它們與外泌體、細胞質(zhì)和細胞液相關(guān)，它們主要參與細胞新成代謝、能量代謝、蛋白質(zhì)代謝、細胞生長、維持和運動等生理過程。而且人精液中分離出的SP-EVs 還攜帶microRNA、Y RNAs、tRNAs 等，它們都具有潛在的調(diào)節(jié)功能。綜上可知，SP-EVs 含有許多調(diào)控物質(zhì)，它們對精子的調(diào)控作用是多種多樣的。通過進一步挖掘精子發(fā)生及其受精過程的調(diào)控機制，可為精子的保存、精子相關(guān)疾病治療等相關(guān)研究提供更多翔實的資料。

3.3 目前SP-EVs 研究中存在的不足及挑戰(zhàn) 精漿由雄性生殖道分泌物組成，其來源構(gòu)成一般為睪丸2%～5%，附睪和前列腺20%～30%，精囊腺65%～75%，尿道球腺1%。目前文獻報道的SP-EVs 以附睪小體和前列腺小體為主，針對精囊腺來源的EVs 研究較少。實際上精囊腺也分泌EVs，且精囊腺EVs 的蛋白質(zhì)組成不同于附睪小體和前列腺小體，說明精囊腺EVs 可能是一類不同于附睪小體和前列腺小體的SP-EVs。精囊腺EVs 的功能是否與附睪小體和前列腺小體相似，是否是精漿功能的主要影響因素，仍需要繼續(xù)進行研究。

針對性的研究來自某一部位EVs 也有很多挑戰(zhàn)，一方面取樣比較困難，如手術(shù)或者解剖動物的成本較高，另一方面也無法保證取到的樣品不含有其他部位液體的污染。因此直接把人或者動物射出的精液中SP-EVs 作為一個整體研究值得探索，直接分離出SP-EVs，并鑒定出其中的關(guān)鍵分子作為影響精子功能調(diào)控物質(zhì)或雄性生殖相關(guān)疾病診斷的判斷依據(jù)，具有很高的應用價值。

此外，研究EVs 需要合適的分離和濃縮方法，不同分離方法對提取到的EVs 類型和細胞等污染物殘留有不同影響，從而對后續(xù)研究造成影響。目前分離EVs的常用方法包括超速離心、沉淀法、超濾法，基于尺寸排除和親和吸附的色譜法以及免疫親和捕獲法等。不同樣品適用不同的方法。SP-EVs 來源廣泛，成分復雜，要將其作為一個整體研究，必須要摸索出最適宜的分離方法，減少分離到的SP-EVs 異質(zhì)性和雜質(zhì)污染，同時，在得到EVs 后應根據(jù)公認的標準對其進行鑒定，只有滿足這些條件的EVs 才可以繼續(xù)進行下一步分析。

4 展 望

通過分析精漿對精子生理功能的重要作用以及闡明SP-EVs 作為一種潛在的有效調(diào)控物質(zhì)，有利于深入挖掘SP-EVs 的功能及其作用機制，拓展關(guān)于精子調(diào)控機制的認識。而且，深入理解精漿對精子功能的影響機制，可以為人類某些不孕不育疾病發(fā)病原因、診治以及目前輔助生殖技術(shù)提供有價值的參考信息，還可為畜牧生產(chǎn)中尋找高繁殖力公畜，提高公畜精液質(zhì)量及母畜繁殖力提供新的思路，同時也為精液的常溫及冷凍保存、人工輸精等生產(chǎn)過程提供參考。