青梅提取物抗菌效果研究

◎ 陳其欣，孟祝龍，談國(guó)聞，帥玉英

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，食品衛(wèi)生與營(yíng)養(yǎng)教研室，浙江 杭州 310053；2.江蘇梅都健康食品有限公司，江蘇 無(wú)錫 214200）

青梅是薔薇科杏屬植物梅（Prunus mumeSieb.et Zucc.）的未成熟果實(shí)，青梅果擁有較高的保健作用與藥用功能?，F(xiàn)代研究表明青梅提取物有抗菌抗病毒[1]、促進(jìn)血液循環(huán)[2]、抗疲勞[3]、護(hù)肝[4]、改善腸胃消化功能[5]和抗癌[6]等功效，臨床上常被用于治療痛風(fēng)和高尿酸血癥[7]，由此可見(jiàn)青梅具有可觀(guān)的潛在利用空間。其抗菌特性特別受學(xué)界關(guān)注，有研究發(fā)現(xiàn)含青梅有效成分的梅鹵具有廣譜抗菌作用，陳虹等人證實(shí)青梅汁對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有抑制作用。

幽門(mén)螺桿菌是常見(jiàn)的細(xì)菌病原體，感染后易引發(fā)癌前病變，而根除幽門(mén)螺桿菌往往需要3～4種藥物聯(lián)合使用，其中至少2種是抗生素，抗生素在殺死病菌的同時(shí)也可能帶來(lái)其他問(wèn)題，如胃部不適、肝功能損害以及腸道菌群紊亂等，尋找高效、無(wú)副作用的抗幽門(mén)螺桿菌藥物迫在眉睫。

本文研究了青梅提取物對(duì)常見(jiàn)的食源致病菌金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、痢疾志賀氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和單增李斯特菌的抑菌性能，并且研究了對(duì)幽門(mén)螺桿菌、大腸桿菌的殺菌效果，以期為開(kāi)發(fā)青梅抗菌消炎食品或保健產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

青梅提取物（江蘇梅都健康食品有限公司）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、幽門(mén)螺桿菌添加劑（HP抑菌劑），購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為分析純?cè)噭?，?gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

菌株：幽門(mén)螺桿菌（ATCC 43504）、大腸桿菌（ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、鼠傷寒沙門(mén)氏菌（CMCC 50115）、副溶血性弧菌（ATCC 17802）、單增李斯特菌（NICPBP 54002）和痢疾志賀氏菌（CMCC 51252）。

1.1.2 相關(guān)試劑的制備

（1）菌懸液的制備。取菌株第3～14代的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物（18～24 h），用5 mL 0.03 mol·L-1PBS洗下菌苔，使菌懸浮均勻稀釋至所需濃度。

（2）幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)基的制備。取牛腦浸粉4 g、牛心浸粉4 g、蛋白胨5 g、酪蛋白胨16 g、氯化鈉5 g、葡萄糖2 g、磷酸氫二鈉2.5 g和瓊脂13.5 g，除瓊脂外其他成分溶解于蒸餾水中，調(diào)pH至7.2～7.6，加入瓊脂加熱溶解，121 ℃壓力蒸汽滅菌20 min備用。冷卻至50～55 ℃時(shí)加入7 mL脫纖維羊血和1支HP抑菌劑，混勻，傾入無(wú)菌平皿備用。

（3）中和劑的配制。按3%吐溫-80、0.5%硫代硫酸鈉、0.5%L-組氨酸、0.5%蛋白胨、0.85%氯化鈉、1.43%卵磷脂和0.1%半胱氨酸的PBS配制，滅菌備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

青梅提取物來(lái)源于江蘇梅都健康食品有限公司提供的成品，濃度為10%，用無(wú)菌水稀釋至所需濃度。實(shí)驗(yàn)以殺菌率和抑菌率評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算方式如下：

式中：X為殺菌率/抑菌率，%；NC為對(duì)照樣品平均菌落數(shù)，CFU·mL-1；NS為加青梅提取物樣品平均菌落數(shù)，CFU·mL-1。

評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：殺菌率≥90%，產(chǎn)品有殺菌作用；抑菌率為50%～90%，產(chǎn)品有抑菌作用；抑菌率≥90%，抑菌性能較好。

1.2.1 殺菌實(shí)驗(yàn)

鑒于前人研究[9-10]，殺菌實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)幽門(mén)螺桿菌作用的青梅提取物濃度為0.9%，作用時(shí)間為5 min；對(duì)大腸桿菌作用的青梅提取物濃度為1%和5%，作用時(shí)間分別為5 min、10 min、20 min。①取青梅提取物樣液和對(duì)照樣液（等體積無(wú)菌水）各4管，分別在每管滴加菌懸液100 μL均勻混合。②計(jì)時(shí)作用時(shí)間后，將樣液0.5 mL分別滴入含5 mL相應(yīng)中和劑的試管內(nèi)。③用無(wú)菌水適當(dāng)稀釋后取其中2～3個(gè)稀釋度，分別吸取0.5 mL，置于2個(gè)平皿，15 mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（35±2）℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算殺菌率。

1.2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

抑菌實(shí)驗(yàn)設(shè)置青梅提取物濃度為1%、5%和10%，對(duì)常見(jiàn)致病菌副溶血性弧菌、痢疾志賀氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌作用20 min。①取青梅提取物樣液和對(duì)照樣液（等體積無(wú)菌水）各4管，分別在每管滴加菌懸液100 μL均勻混合。②計(jì)時(shí)作用時(shí)間后，將樣液0.5 mL分別滴入含5 mL PBS的試管內(nèi)。③用無(wú)菌水適當(dāng)稀釋后取其中2～3個(gè)稀釋度，分別吸取0.5 mL，置于2個(gè)平皿，15 mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（35±2）℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算抑菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 青梅提取物對(duì)幽門(mén)螺桿菌的殺菌效果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，幽門(mén)螺桿菌對(duì)青梅提取物非常敏感，0.9%濃度的青梅提取物僅作用5 min，對(duì)照組平均菌落數(shù)為1.2×104CFU/片，試驗(yàn)組平均菌落數(shù)＜54CFU/片，殺菌率＞99.95%。此前有研究表明服用青梅汁可以促進(jìn)胃腸活動(dòng)、抑制幽門(mén)螺桿菌生長(zhǎng)、降低黏膜炎癥水平以緩解改善胃炎的癥狀，以上研究提供了一種設(shè)想：將攝入青梅作為治療幽門(mén)螺桿菌感染、預(yù)防胃癌的輔助措施，降低幽門(mén)螺桿菌感染的癌變風(fēng)險(xiǎn)[11]。

2.2 青梅提取物對(duì)大腸桿菌的殺菌效果

由圖1可知，1%濃度的青梅提取物對(duì)于大腸桿菌的殺菌率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。1%濃度青梅提取物作用20 min殺菌率高達(dá)92.55%，5%濃度青梅提取物作用10 min殺菌率高達(dá)99.84%。因此，有望發(fā)掘青梅作為替代抗生素的天然抗菌劑，以緩解抗生素濫用的現(xiàn)狀。劉玉霞等人[12]研究表明，梅果中黃酮類(lèi)物質(zhì)、酚類(lèi)物質(zhì)的含量與其抑菌和抗氧化性能相關(guān)，由此青梅提取物可作為天然的食品添加劑，提高食品安全性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

圖1 1%和5%青梅提取物對(duì)大腸桿菌的殺菌效果圖

2.3 不同濃度青梅提取物對(duì)常見(jiàn)食源性致病菌的抑菌作用

1%、5%和10%青梅提取物對(duì)常見(jiàn)致病菌作用20 min的抑菌率如圖2所示。1%濃度青梅提取物對(duì)副溶血性弧菌的抑菌活性最強(qiáng)，達(dá)99.97%；5%濃度青梅提取物對(duì)痢疾志賀氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌抑菌效果較好，抑菌率分別達(dá)99.70%及99.97%；10%的青梅提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌的抑菌效果較好，抑菌率分別達(dá)97.04%及99.92%。青梅提取物對(duì)副溶血性弧菌、痢疾志賀氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌等常見(jiàn)食源性致病菌都表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑菌效果。

圖2 青梅提取物對(duì)幾種常見(jiàn)食源性致病菌的抑菌效果圖

副溶血性弧菌是對(duì)酸敏感的細(xì)菌，青梅提取物中含量最高的有機(jī)酸是檸檬酸，可推測(cè)青梅提取物抑菌機(jī)制與檸檬酸有關(guān)，可能是檸檬酸降低了細(xì)菌周?chē)h(huán)境的pH值干擾其酶系或細(xì)胞膜的代謝，達(dá)到抑菌效果[13]。此外，1%濃度青梅提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌的抑菌效果較差，二者均屬革蘭氏陽(yáng)性菌，合理推測(cè)抑菌機(jī)制與細(xì)胞壁有一定程度的關(guān)聯(lián)，致密的肽聚糖骨架抵御了抑菌活性物質(zhì)的干擾。

3 結(jié)論

青梅提取物對(duì)幽門(mén)螺桿菌和大腸桿菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺菌作用，對(duì)副溶血性弧菌、痢疾志賀氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌作用。青梅中抗菌活性物質(zhì)種類(lèi)繁多，但目前對(duì)于青梅的抑菌機(jī)制尚未有明確的報(bào)道，根據(jù)前人研究可知青梅的抗菌活性與其檸檬酸、黃酮、熊果酸、綠原酸及其衍生物、順丁烯二酸、糠醛類(lèi)物質(zhì)及酚類(lèi)有關(guān)，且存在相互促進(jìn)作用，具體明確的作用機(jī)制需要更深入的研究[14]。青梅優(yōu)良的抗菌性能使其具有功能性食品或保健產(chǎn)品開(kāi)發(fā)前景，可以用以促進(jìn)消化代謝，為胃炎患者的治療提供輔助作用，也可以作為天然的食品添加劑發(fā)揮其抗菌、抗氧化的作用。