橡膠制品中 3 種 N- 亞硝基胺類物質假陽性的鑒別

馮徐根，韓軍，孫旸，孫敬，楊萌

（北京市產品質量監(jiān)督檢驗院 國家紡織及皮革產品質量監(jiān)督檢驗中心，北京 100025）

前言

N- 亞 硝 基胺類物質被認為是最重要的化 學致癌物之一，N- 亞硝基胺可以通過呼吸道、消化道進入人體，也可以通過皮膚的吸收進入人體誘發(fā)癌癥[1-2]。近年來,隨著人民對該類物質重視度的提高，國內外對 N- 亞硝基胺殘留量的測定研究越來越多，集中在食品、水和各種日用橡膠制品，如橡膠密封材料、嬰兒奶嘴、橡膠玩具及橡膠手套等[3-7],橡膠制品中的 N- 亞硝基胺主要源于橡膠加工所用的仲胺類促進劑，硫化過程中形成仲胺, 再與硝基化試劑反應生成 N- 亞硝基胺[8-9]。

我國國家標準 GB/T24153-2009[10]也提供了橡膠中 N- 亞硝基胺類物質的檢測方法。該標準使用氣質聯用法測定 N- 亞硝基胺類物質，但 N- 亞硝基-N- 甲基苯胺、N- 亞硝基 -N- 乙基苯胺和 N- 亞硝基二苯基胺具有熱不穩(wěn)定性，在進樣口高溫條件下會分解為 N- 甲基苯胺、N- 乙基苯胺和二苯胺，實際測定物質為分解產物 N- 甲基苯胺、N- 乙基苯胺和二苯胺，而該 3 種分解產物同時也常作為橡膠生產助劑和促進劑廣泛應用于橡膠生產中，可能會少量殘留于橡膠制品中，如果實際樣品中含有這 3種物質，按照 GB/T24153-2009 的方法測試將會得到假陽性結果。

本研究建立了橡膠材料中 3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質液相色譜儀和液質聯用儀的鑒別方法，3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質化學信息見表 1。

表1 3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質化學信息Tab.1 Chemical information of 3 N-nitrosoamines and 3 false positive substances

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

儀器：氣質聯用儀 Agilent 7890A-5975C（安捷倫科技有限公司）；液相色譜儀 Agilent 1260 Infinity（安 捷 倫 科 技 有 限 公 司）； 液 質 聯 用 儀 Agilent 1200-641 0B（安捷倫科技 有 限公 司）；超聲 波發(fā) 生器JP-040（深 圳 市 潔 盟 清 洗 設 備 有 限 公 司）；旋 轉 蒸 發(fā)儀（瑞士步琦有限公司）。

標準物質、試劑、材料：N- 亞硝基 -N- 甲基苯胺（標準物質，99.5%，FirstStandard）；N- 亞硝基 -N-乙基苯胺（標準物質，98.4%，FirstStandard）；N- 亞硝基二苯基胺（標準物質，98.0%，FirstStandard）；N- 甲基苯胺（標準物質，98.9%，BePure）；N- 乙基苯胺（標準 物 質 ，99.2% ，BePure）； 二 苯 胺 （ 標 準 物 質 ，1000μg/mL，BePure）；甲醇（色譜純,國藥集團化學試劑有限公司）；黑色橡膠（經檢測不含 3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質）。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取 0.0250 g 的 N- 亞硝基 -N- 甲基苯胺、N- 亞硝基 -N- 乙基苯胺、N- 亞硝基二苯基胺、N- 甲基苯胺、N- 乙基苯胺，用色譜純甲醇定容至 25 mL，得到質量濃度均為 1000 μg/mL 的單種標準儲備溶液，使用時用甲醇將標準儲備溶液稀釋至所需濃度。

1.3 儀器分析條件

1.3.1 氣質聯用儀 GC-MS

色譜柱：DB-5MS （30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度：140 ℃；質譜接口溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；載氣：氦氣，流速：1.0 mL/min；電離方式：EI 源；進樣方式：不分流進樣；升溫程序：38 ℃保持 2 min，以 20 ℃/min 升溫至 250 ℃，保持 2 min；質量掃描范圍：50～200 amu。

1.3.2 液相色譜儀 HPLC

色譜柱：Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣體積：15 μL；流動相 A：二級水，流動相 B：乙腈；梯度洗脫程序：0～8 min，50%A 等度洗脫；8～10 min，A 由 50%線性降至 40%，保持 5 min；二極管陣列檢測器，檢測波長：243 nm、270 nm、282 nm。

1.3.3 液質聯用儀 LC-MS

色譜柱：ZORBAX XDB-C18(50 mm×2.1 mm×5 μm)流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣體積：10 μL；流動相 A：二級水，流動相 B：乙腈；梯度洗脫程序：0～4 min，A 由 80%線性降至 40%，保持 0.5 min；離子源：ESI；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多重反應監(jiān) 測（MRM）；電 噴 霧 電 壓 ：4000 V；霧 化 器 壓 力 ：40 psi；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：11 L/min。

1.4 前處理

按照 GB/T24153-2009 標準中的前處理方法對樣品進行前處理，樣品萃取液轉移至棕色進樣瓶中，于 4 ℃條件下冷藏待測。

2 結果與討論

2.1 氣質聯用儀檢測結果

使用 GB/T24153-2009 標準中的氣質聯用儀分析條件分析 3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質色譜圖見圖 1，質譜圖見圖 2～ 圖 4。

圖1 3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質GC-MS 色譜圖Fig.1 GC-MS Chromatogram of 3 N-nitrosamines and 3 false positive substances

圖2 N- 亞硝基 -N- 甲基苯胺、N- 甲基苯胺 GC-MS 質譜圖Fig.2 Mass spectrum of N-nitroso-N-methylaniline and Nmethylaniline with GC-MS

圖3 N- 亞硝基 -N- 乙基苯胺、N- 乙基苯胺 GC-MS質譜圖Fig.3 Mass spectrum of N-nitroso-N-ethylaniline and Nethylaniline with GC-MS

由圖 1～ 圖 4 可知，3 種 N- 亞硝基胺類物質與其對應的 3 種假陽性物質在保留時間、特征離子和特 征 離 子 豐 度 比 上 均一 致 ， 結 果 表 明 ： 采 用GB/T24153-2009 標準中的儀器分析條件，無法分辨3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質。

圖4 N- 亞硝基二苯基苯胺、二苯胺 GC-MS 質譜圖Fig.4 Mass spectrum of N-nitrosodiphenylaniline and diphenylamine with GC-MS

2.2 假陽性原因分析

N- 亞硝基 -N- 甲基苯胺、N- 亞硝基 -N- 乙基苯胺和 N- 亞硝基二苯基胺具有熱不穩(wěn)定性，高溫條件下容易分解，在進樣口的高溫條件下，N- 亞硝基 -N- 甲基苯胺、N- 亞硝基 -N- 乙基苯胺和N- 亞硝基二苯基胺會分解成 N- 甲基苯胺、N- 乙基苯胺和二苯胺，同時還會生成副產物 N- 甲基羥乙基苯胺、2,3,3- 三甲基 -1- 苯基氮雜環(huán)丁烷和 N-乙 基 羥 乙 基 苯 胺 。 所 以 使 用 氣 質 聯 用 儀 采 用GB/T24153-2009 標準中儀器條件分析 N- 亞硝基-N- 甲基苯胺、N- 亞硝基 -N- 乙基苯胺和 N- 亞硝基二苯基胺時，實際測定的是其分解產物 N- 甲基苯胺、N- 乙基苯胺和二苯胺。N- 甲基苯胺、N- 乙基苯胺和二苯胺作為橡膠生產助劑和促進劑廣泛應用于橡膠生產中，可能會少量殘留于橡膠產品中 ， 如 果 實 際 樣 品 中 含 有 這 3 種 物 質 ， 按 照GB/T24153-2009 的測試方法將會得到假陽性的結果。所以需降低進樣口溫度防止物質分解或采用其他分析方法來分辨 3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質。

2.3 氣質聯用法鑒別方法的確定

陶進熊等人研究了氣質聯用儀進樣口溫度對N- 亞硝基 -N- 甲基苯胺和 N- 亞硝基 -N- 乙基苯胺的影響[11]，但并未研究 N- 亞硝基二苯基胺在進樣口高溫條件下的分解情況，所以基于上述研究結果，進樣口溫度分別選擇 100、140 和 180 ℃，比較不同進樣口溫度對 N- 亞硝基二苯基胺結果的影響，結果見圖 5。

結合圖 5 及物質對應的質譜圖可知，進樣口溫度為 100 ℃時，N- 亞硝基二苯基胺已經分解為二苯胺，過低的進樣口溫度還會影響樣品溶液的氣化效果，結果表明：氣質聯用法目前不適應于 N- 亞硝基二苯基胺的檢測。文獻[12]顯示，N- 亞硝基二苯基胺熱穩(wěn)定性不好，通常采用測定其分解產物二苯胺對 N- 亞硝基二苯基胺進行定量。但二苯胺也可作為防老劑應用于橡膠生產中[13]，勢必會在檢測中有假陽性的情況發(fā)生，所以還應結合使用其他分析手段鑒別 N- 亞硝基二苯基胺和二苯胺。

圖5 不同進樣口溫度下 N- 亞硝基二苯基胺的 GC-MS色譜圖Fig.5 GC-MS Chromatograms of N-nitrosodiphenylamine at different inlet temperatures

使用優(yōu)化后的分析條件對 2 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質標準溶液進行分析，2 種 N-亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質色譜圖見圖 6，定量離子、定性離子及保留時間信息見表 2。

圖6 2 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質 GC-MS色譜圖Fig.6 GC-MS Chromatograms of 2 N-nitrosamine substances and 3 false positive substances

表2 2 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質的 GC-MS 定性離子及定量離子Tab.2 Qualitative and quantitative ions of 2 N-nitrosoamines and 3 false positive substances with GC-MS

2.4 HPLC 鑒別方法的確定

2.4.1 色譜柱的選擇

試驗考察了 Eclipse XDB-C18 柱（250 mm×4.6 mm×5 μm） 和 Eclipse Plus-C18 柱 （250 mm×4.6 mm×5 μm）對 3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質的保留和分離效果，發(fā)現在同等條件下，兩種色譜柱都可以實現 6 種物質的分離，當使用 Eclipse XDB-C18 柱時，6 種物質的分離效果更好，所以本實驗選擇 Eclipse XDB-C18 柱。

2.4.2 流動相的選擇

為保證 3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質間良好的色譜分離及響應，分別考察了乙腈 -水流動相體系和甲醇 - 水流動相體系對 6 種物質分離的影響。結果表明，在同等梯度條件下，乙腈 -水流動相體系比甲醇 - 水流動相體系的分離效果更好，峰形更加尖銳，保留時間更短，但色譜峰響應基本一致，所以綜合考慮本實驗選擇乙腈 - 水流動相體系。

2.4.3 檢測波長的確定

使用二極管陣列檢測器對 3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質進行光譜全掃描檢測，檢測結果表明：N- 亞硝基二苯基胺、N- 甲基苯胺和 N-乙基苯胺在 240～246 nm 有特征吸收，二苯胺在 282 nm 有特征吸收，而 N- 亞硝基 -N- 甲基苯胺和 N-亞硝基 -N- 乙基苯胺在 215 nm 和 270 nm 均有特征吸收，綜合考慮到越靠近遠紫外區(qū)，乙腈溶劑和雜質吸收越強，會對目標物造成干擾，所以確定 270 nm 作為 N- 亞硝基 -N- 甲基苯胺和 N- 亞硝基-N- 乙基苯胺的檢測波長，243 nm 作為 N- 亞硝基二苯基胺、N- 甲基苯胺和 N- 乙基苯胺的檢測波長，282 nm 作為二苯胺的檢測波長。

3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質液相色譜圖見圖 7，由圖7 可知，該方法可以實現 6 種物質的分離，6 種物質在 243 nm、270 nm 和282 nm 下，可以得到較好的峰強度，檢測時長為18 min。

圖7 3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質液相色譜圖Fig.7 Liquid chromatograms of 3 N-nitrosoamines and 3 false positive substances

2.5 液質聯用法鑒別方法的確定

使用 ESI 源分別在正離子和負離子模式下對 3種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質進行質譜全掃描。結果表明：在 ESI 源正離子模式下，3 種 N-亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質質譜響應更強，因此電離方式選擇正離子模式。

在正離子模式下對 3 種 N- 亞硝基胺類物質及3 種假陽性物質進行全掃描，準分子離子[M+H]-為最高響應強度離子，將其選為母離子后使用選擇離子掃描模式優(yōu)化碎裂電壓。采用子離子掃描方式對二級質譜進行分析，選擇豐度較強并且干擾較少的子離子分別作為定量離子和定性離子，進一步優(yōu)化碰撞能量，使各物質的特征碎片離子強度達到最大，具體質譜參數見表 ，使用多重反應監(jiān)測模式（MRM）掃描 3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質，MRM 色譜圖見圖 8，質譜參數見表 3。

表3 3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質的質譜參數Tab.3 Mass spectrometric parameters of 3 N-nitrosamine substances and 3 false positive substances

圖8 3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質 MRM 色譜圖Fig.8 MRM chromatograms of 3 N-nitrosoamines and 3 false positive substances

2.6 方法線性關系及檢出限

以 3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質的濃度為橫坐標，3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，方法檢出限采用試劑空白添加標準溶液完成前處理步驟后進行儀器分析，當 S/N=3 時所對應的濃度為方法檢出限。結果表明：液相色譜法的線性相關系數為 0.9928～0.9992，方法檢出限為 0.14～0.43 mg/kg，結 果 見 表 4。 液 質 聯 用 法 的 線 性 相 關 系 數 為0.9931～0.9968，方法 檢 出 限 為 0.10～0.46 mg/kg，結果見表 5。

表4 液相色譜法測 3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質的標準曲線及檢出限Tab.4 Standard curve and detection limit of 3 N-nitrosoamines and 3 false positive substances by HPLC

表5 液質聯用法測 3 種 N- 亞硝基胺類物質及 3 種假陽性物質的標準曲線及檢出限Tab.5 Standard curve and detection limit of 3 N-nitrosoamine substances and 3 false positive substances by LC-MS/MS

2.7 回收率與精密度

回收率采用基體加入法，選取黑色橡膠作為基體，添加三個水平，分別為 1.0 mg/kg、5.0 mg/kg、10.0 mg/kg，每個水平平行測定 7 次，結果表明：液相色譜法的加標回收率為 96.7%～103.7%，相對標準偏差為 2.3%～5.4%；液質聯用法的加標回收率為 98.1%～106.4%，相對標準偏差為 2.2%～4.2%，均滿足日常檢測要求。

3 結論

分析了氣質聯用法測 3 種 N- 亞硝基胺類物質出現假陽性的原因，建立了測定 3 種 N- 亞硝基胺類物質及其 3 種假陽性物質的液相色譜法和液質聯用法，優(yōu)化了儀器參數，能夠實現對 3 種物質的準確定量，有助于提高實驗室對 N- 亞硝基胺類物質假陽性情況的識別及檢測能力，也為其他產品中N- 亞硝基胺類物質的測定提供了參考方法。