腦震寧顆粒安神藥隊改善腦震蕩模型小鼠學習記憶與空間認知能力的實驗研究

王曉英，裴妙榮，趙艷艷

（1.山西中醫(yī)藥大學，山西 晉中 030619；2.桂林醫(yī)學院，廣西 桂林 541199）

腦震蕩是常見的輕型顱腦損傷類型，有頭痛、頭暈及程度不一的植物神經(jīng)功能失調（耳鳴、心悸、血壓波動、多汗、性功能下降等）、注意力渙散、記憶力減退、情緒不穩(wěn)容易激動等表現(xiàn)，以傷后即刻出現(xiàn)定向障礙或者意識障礙，傷后24 h內出現(xiàn)平衡功能缺失，傷后48 h內出現(xiàn)反應遲鈍及學習能力和記憶力減退為其主要癥狀［1］。腦震寧顆粒由活血祛瘀藥隊：（當歸、川芎、牡丹皮、丹參、地黃、地龍）、除煩止嘔藥隊：（陳皮、竹茹）、安神益智藥隊（柏子仁、酸棗仁、茯苓）共11味中藥經(jīng)科學提取加工制成，共奏涼血活血、化瘀通絡、益血安神、寧心定智、除煩止嘔之效。臨床使用腦震寧顆粒治療腦震蕩效果頗佳，我們對該方進行拆方，應用于腦震蕩模型小鼠，觀察各組動物空間學習記憶能力的變化，從而探求腦震寧顆粒組方的科學意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物與儀器 4周齡ICR小鼠，雄性，體質量（18～22）g，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（晉）2015-0001。自制小鼠腦震蕩制造儀；Morris水迷宮（BW-MWM101，上海軟隆科技發(fā)展有限公司）。

1.1.2 藥物與試劑 腦震寧顆粒（山西振東安特生物制藥有限公司出品，批號：Z14021119，10 g/袋）；0.9%氯化鈉注射液（山東華魯制藥有限公司，250 mL，2.25 g/瓶，批號：C07020410）；當歸、川芎、茯苓、酸棗仁（炒）、地黃、地龍、陳皮、柏子仁、牡丹皮、竹茹、丹參由山西振東安特生物制藥有限公司提供，與腦震寧顆粒（批號：Z14021119）原料一致，經(jīng)裴香萍教授鑒定為合格品。

1.2 方 法

1.2.1 給藥樣品制備 腦震寧顆粒全方：腦震寧顆粒加蒸餾水配置成0.85 g/mL的灌胃液。腦震寧去酸棗仁、柏子仁、茯苓（實驗1組）：全方去酸棗仁、柏子仁、茯苓，按腦震寧顆粒制備方法制備顆粒劑，配置成0.59 g/mL的灌胃液。腦震寧去酸棗仁（實驗2組）：全方去酸棗仁，按腦震寧顆粒制備方法制備顆粒劑，配置成0.76 g/mL的灌胃液。腦震寧去柏子仁（實驗3組）：全方去柏子仁，按腦震寧顆粒制備方法制備顆粒劑，配置成0.76 g/mL的灌胃液。

1.2.2 造模、分組、給藥 根據(jù)參考文獻［2］，自制小鼠腦震蕩制造儀，采用振動法造模：將單只小鼠放入鐵盒內，以10次/min左右的頻率用力搖晃，使小鼠撞擊盒子內壁造成腦震蕩。造模后觀察并記錄小鼠恢復自主呼吸及意識障礙等各種反射的時間，同時觀察造模后30 min內小鼠呼吸及運動能力等的變化。造模成功的標準：①短暫的意識障礙，30 min內恢復；②短暫的呼吸暫?；驕p弱，20 s內恢復；③短暫的角膜反射、痛刺激反射，3 min內恢復；④無遺留運動功能障礙；⑤肉眼及組織學觀察均無腦挫傷灶［2］。50只造模成功的小鼠納入實驗，隨機分為5組，每組10只，分別為模型組、全方組、實驗1組、實驗2組、實驗3組?？瞻捉M10只不造模。各給藥組按體重分別灌胃制備好的對應藥液，灌胃量為0.2 mL/10 g，空白組和模型組予等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)6 d。

1.2.3 Morris水迷宮測試 Morris水迷宮由圓形水池、可移動位置并隱藏在水下面的平臺、圖像自動采集處理系統(tǒng)組成。水迷宮直徑100 cm，水深21 cm，水池內壁已做黑色噴塑處理；平臺直徑9 cm，表面粗糙，內壁高度20 cm，肉眼觀察水面無法看清平臺位置，水溫21～22℃。采用Morris水迷宮定位航行和空間探索實驗檢測小鼠學習記憶和記憶保持能力。給藥6 d，第1天到第5天為有平臺測試，第6天為撤去平臺的測試，均于每天給藥1 h后進行。

定位航行實驗：實驗第1天到第5天，將小鼠放入水池中（不放平臺）自由游泳2 min，使其熟悉迷宮環(huán)境。訓練開始時，將平臺置于第III象限，將小鼠由第I象限面向池壁放入水池。自由錄像記錄系統(tǒng)記錄小鼠找到目標平臺所需的時間和游泳距離，小鼠找到平臺后或60 s內找不到平臺（潛伏期記為60 s）由實驗者將其拿上平臺，在平臺上體息15 s，吹干后放回籠中。

空間探索實驗：實驗第6天，撤除水下平臺，隨機選定一個入水點將小鼠均于此處面向池壁放入水中，記錄小鼠在60 s內第1次跨越平臺時間和穿越平臺的次數(shù)。圖像自動監(jiān)視和處理系統(tǒng)自動完成數(shù)據(jù)采集及圖像分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有統(tǒng)計分析均采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 定位航行實驗

模型組小鼠平均速度、在目標象限第Ⅲ象限的路程與停留時間均較空白組降低（P＜0.05）。上述指標全方組、實驗2組、實驗3組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義，而明顯高于模型組（P＜0.05，P＜0.01），其中以全方組最高。實驗1組的平均速度及在目標象限第Ⅲ象限的路程與空白組接近，在第Ⅲ象限的時間與模型組接近，但差異均無統(tǒng)計學意義。結果見表1。

表1 定位航行實驗結果 （±s）

表1 定位航行實驗結果 （±s）

注:與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01

組別平均速度（mm/s）第Ⅰ象限路程（mm）第Ⅱ象限路程（mm）第Ⅲ象限路程（mm）第Ⅲ象限時間（s）空白組229.17±39.072）3406.30±1326.09 1751.41±479.24 2651.05±763.842）15.92±4.552）模型組187.01±37.911）3579.33±1018.60 2904.41±1497.93 2032.65±327.181）10.28±4.931）全方組238.91±30.223）4356.89±1572.63 2809.36±991.21 2719.65±810.272）11.66±4.94實驗1組227.84±41.83 3097.35±1503.51 2946.79±1490.56 2695.99±817.38 11.78±4.33實驗2組226.07±15.423）3421.64±1320.89 2601.72±1006.82 2665.85±1572.662）11.58±7.15實驗3組240.67±26.173）3723.15±747.86 2976.69±1335.17 2669.97+768.612）12.21±3.162）

2.2 空間探索實驗

模型組小鼠平均速度、在目標象限第Ⅲ象限的路程與停留時間、站臺穿越次數(shù)均明顯低于空白組。全方組、實驗2組上述指標均較模型組明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）；實驗1組站臺穿越次數(shù)高于模型組（P＜0.05）；實驗3組小鼠平均速度以及在目標象限第Ⅲ象限的路程與停留時間均較模型組增加（P＜0.05）。各給藥組小鼠上述指標與空白組比較，差異均無統(tǒng)計學意義。結果見表2。

表2 空間探索實驗結果 （±s）

表2 空間探索實驗結果 （±s）

注:與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01

組別平均速度（mm/s）第Ⅲ象限路程（mm）第Ⅲ象限時間（s）站臺穿越次數(shù)（次）空白組249.49±45.142）4294.2210±928.09 13.74±6.992）1.80±0.632）模型組197.22±44.781）2982.8256±1250.84 14.99±4.401）1.21±0.921）全方組247.78±15.373）4556.4033±992.82 23.09±5.883）2.51±0.713）實驗1組248.53±29.29 3471.1071±1067.24 17.64±5.56 1.92±1.29實驗2組214.94±18.792）3908.3840±566.75 19.55±3.072）2.30±1.162）實驗3組238.38±43.852）4131.3522±1034.90 19.66±3.062）1.51±0.53

上述結果表明振動法對小鼠造成的空間記憶、工作記憶以及空間辨別能力的損傷明顯，腦震寧全方及其安神藥隊均能提高小鼠空間記憶、工作記憶以及空間辨別能力。

3 討論

Morris水迷宮由英國心理學家Morris設計，并用于學習記憶腦機制的研究［3-4］，是目前國際通用的較好的空間辨別學習工具。腦損傷動物在迷宮中找到隱匿平臺的時間越長，表明其認知記憶缺失越明顯；在空間探索實驗中，如果動物有良好正常的學習記憶能力，則動物在原平臺所在區(qū)域就會停留較長的時間，所以我們利用Morris水迷宮實驗研究腦震寧顆粒對腦震蕩小鼠模型的益智作用。

腦震寧顆粒中酸棗仁、柏子仁、茯苓皆為安神類藥物，而安神類藥物對記憶有一定的影響，可以增加GABA（γ-氨基丁酸）含量，對大鼠神經(jīng)功能缺失癥狀有一定改善，具有腦保護作用［5-7］。酸棗仁為鼠李科植物酸棗（Ziziphus jujubeMill.）的干燥成熟種子［5-7］，具有寧心、安神等功效，用于治療虛煩不眠、驚悸多夢等癥。黃酮類成分是酸棗仁的主要活性成分之一［2］，除鎮(zhèn)靜催眠外，還具有抗焦慮、抗抑郁、增強記憶力、腦神經(jīng)保護、抗氧化等多種作用。柏子仁為柏科植物側柏［Platycladus orientalis（L.）Franco］的種仁，其性平味甘，入心、肝、腎、大腸經(jīng)，具有寧心安神、斂汗生津、潤腸通便之功效［3-4］。茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，具有利水滲濕、健脾寧心等作用，臨床用于水腫、心悸、失眠等。茯苓能改善苯巴比妥鈉所致記憶障礙小鼠的學習記憶能力，具有明顯鎮(zhèn)靜催眠作用［8］。各給藥組益智作用由強到弱順序為：腦震寧全方組＞實驗3組（全方去柏子仁）＞實驗2組（全方去酸棗仁）＞實驗1組（全方去酸棗仁、柏子仁和茯苓）。由此可以推測腦震寧顆粒中酸棗仁、柏子仁、茯苓為改善小鼠腦震蕩后記憶損傷的主要成分，其他藥味也可發(fā)揮協(xié)同作用，而以全方組療效最佳。酸棗仁、柏子仁、茯苓等安神藥隊及腦震寧顆粒對學習記憶影響的機制，有待深入研究。