基于線粒體蛋白編碼基因探討飛虱科Delphacidae13屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

張爭光，趙 芳，蘇田娟，蔣 凱

基于線粒體蛋白編碼基因探討飛虱科Delphacidae13屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

*張爭光，趙 芳，蘇田娟，蔣 凱

（井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西，吉安 343009）

飛虱科昆蟲隸屬于半翅目蠟蟬總科，是世界上最重要的農(nóng)業(yè)害蟲之一。昆蟲的線粒體基因是昆蟲分子與進(jìn)化研究中常用且有效的分子標(biāo)記。本研究基于線粒體蛋白編碼基因探討了飛虱科13屬18種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，分別采用距離法、最大似然法和貝葉斯法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹得到的結(jié)論是一致的，即在飛虱科13屬中，Ugyops屬較為原始，處于系統(tǒng)樹的基部，其余12個(gè)屬聚為2支，Bambusiphaga屬、Epeurysa屬、Tropidocephala屬和Saccharosydne屬聚為一支，Peregrinus屬、Perkinsiella屬、Changeondelphax屬、Chloriona屬、Ishiharodelphax屬、Sogatella屬、Laodelphax屬和Nilaparvata屬聚為另一支。18種的進(jìn)化地位和分類歸屬與傳統(tǒng)分類結(jié)果基本一致。

線粒體基因組；系統(tǒng)發(fā)育；飛虱科

飛虱科Delphacidae隸屬于半翅目Hemiptera頭喙亞目Auchenorrhyncha蠟蟬總科Fulgoroidea，是蠟蟬總科中最大的一個(gè)類群，廣泛分布于世界各地，物種多樣性十分豐富，目前全世界已報(bào)到427屬2226種[1]。該科昆蟲許多種類是重要的農(nóng)林業(yè)害蟲，主要通過直接取食和作為病原物的傳播載體對農(nóng)作物造成危害[3]。其以刺吸式口器吮吸植物的汁液來奪取植物的營養(yǎng)，使植物營養(yǎng)不良或至枯萎或在吮吸部位出現(xiàn)黃色或黃褐色病斑，有的則因涎液的刺激使植物細(xì)胞反常增殖，造成畸形臃腫的蟲癭，作為植物病毒傳播的潛在媒介，是玉米、甘蔗、小麥、水稻、大麥等主要糧食作物上的重要的農(nóng)業(yè)害蟲之一[2]。由于具有很高的繁殖潛力、擴(kuò)散能力和對植物病毒疾病的傳播能力，一些飛虱種類已經(jīng)對谷物生產(chǎn)造成了巨大損害，并在一些亞洲國家被確定為造成稻米饑荒的重要原因之一[4]。

飛虱分類始于18世紀(jì)歐洲。1815年英國倫敦大英博物館館長Leach以Fabricius 為模式屬建立了飛虱科（Delphacidae），為飛虱類昆蟲和系統(tǒng)分類奠定了基礎(chǔ)[5]。我國飛虱科研究起步較晚，早期的飛虱研究始于國外學(xué)者，在1941年胡經(jīng)甫編寫《中國昆蟲名錄》中僅記錄飛虱9屬14種。此后，Metcalf在《世界飛虱名錄》中記載了我國飛虱種類23屬55種，其中多數(shù)是分布于臺灣的種類[6]。上世紀(jì)七十年代，由黃其林和葛鐘麟主持的飛虱科分類研究開啟了我國大陸飛虱科昆蟲分類研究工作。經(jīng)歷了70年代中后期創(chuàng)始階段，進(jìn)入80年代后我國飛虱分類研究進(jìn)展較快，相關(guān)研究進(jìn)展詳見丁錦華教授的我國飛虱分類研究概況一文[7]。進(jìn)入新世紀(jì)以后，我國飛虱科的研究得到了進(jìn)一步快速發(fā)展，主要研究內(nèi)容包括飛虱若蟲分類、飛虱新種記述和屬級階元厘定、飛虱區(qū)系分類和地理分布以及飛虱分子鑒定等。例如陳祥盛等對中國飛虱科若蟲分類開展了系列研究[8-11]。郭兩珍等對叉飛虱屬[12]，陳祥盛等對長突飛虱亞科和偏角飛虱屬、竹飛虱屬[13-14]，秦道正等對隆脊飛虱屬、帕飛虱屬、細(xì)突飛虱屬、等胸飛虱屬、扁角飛虱屬開展了系統(tǒng)分類研究，發(fā)表了大量新種[15-18]；李紅榮，陳祥盛開展了飛虱生物地理學(xué)研究，分析了貴州飛虱科昆蟲物種多樣性及地理分布格局[19]。特別是南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院丁錦華教授編著的《中國動物志—昆蟲綱飛虱科》，它的出版是對我國飛虱科昆蟲分類研究工作的系統(tǒng)總結(jié)，共記述我國飛虱152屬335種，其中包括31新屬43新種和15新組合種，并核定新異名32種，極大地促進(jìn)了我國飛虱科分類工作的發(fā)展[20]。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，飛虱科的分類研究也從傳統(tǒng)單一的形態(tài)分類向形態(tài)、分子相結(jié)合的綜合分類和系統(tǒng)進(jìn)化方向發(fā)展。例如侯曉輝，陳祥盛利用16S rDNA基因序列對飛虱科5屬10種15個(gè)地理種群進(jìn)行了分子鑒定[21]。Zhu Junjie等報(bào)到了灰飛虱的紋狀體基因組組裝體，并與白背飛虱（）和褐飛虱（）兩種飛虱進(jìn)行了比較[22]。在系統(tǒng)發(fā)育研究方面，一些研究者基于單個(gè)基因或聯(lián)合少數(shù)幾個(gè)基因，如16S rDNA、28S rDNA、COI和Cytb基因研究了Delphacini和Tropidocephalini的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[23]。Urban等則基于4個(gè)核基因（18S rDNA、28S rDNA、Wingless和COI）和132個(gè)形態(tài)學(xué)編碼特征研究了飛虱科高級階元間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并根據(jù)寄主—植物組合的進(jìn)化模式發(fā)現(xiàn)飛虱科多樣性的快速分化與寄主轉(zhuǎn)移到禾本科植物有關(guān)，特別是從C3植物向C4植物的轉(zhuǎn)移有關(guān)[24]。

物種的準(zhǔn)確鑒定和物種間進(jìn)化關(guān)系的確定對于指導(dǎo)害蟲防治策略的制定非常關(guān)鍵，由于種類繁多和形態(tài)近似，飛虱科物種傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定和進(jìn)化關(guān)系研究一直面臨著較大挑戰(zhàn)。以往的研究大多基于單個(gè)基因（如16SrDNA、COI）或少數(shù)幾個(gè)基因聯(lián)合（如16S rDNA、28S rDNA、COI和Cytb），造成系統(tǒng)發(fā)育的信息較少，由于多基因聯(lián)合能夠解決單基因系統(tǒng)發(fā)育信息較少的問題，結(jié)果更接近物種進(jìn)化的真實(shí)情況，因此在系統(tǒng)發(fā)育研究中受到越來越多的關(guān)注。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和測序技術(shù)的發(fā)展，線粒體基因組序列的獲得變得越來越便捷，線粒體基因在昆蟲進(jìn)化研究中的應(yīng)用也越來越廣泛。比如Song等學(xué)者利用49個(gè)線粒體基因序列（蛋白編碼基因和核糖體RNA基因）探討了半翅目的目級階元的親緣關(guān)系，研究結(jié)果支持蠟蟬亞目Fulgoromorpha與胸喙亞目Sternorrhyncha為姐妹群，各亞目間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系為(((Fulgoromorpha, Sternorrhyncha), Cicadomorpha),Heteroptera)，該結(jié)論解決了蠟蟬總科的分類地位問題，這與半翅目傳統(tǒng)的分類系統(tǒng)相一致[25]。測序技術(shù)的快速發(fā)展導(dǎo)致GenBank數(shù)據(jù)庫中線粒體基因組數(shù)據(jù)呈爆發(fā)式增長。截止目前，GenBank數(shù)據(jù)庫中已收錄飛虱科昆蟲mtDNA基因組序列共計(jì)18種，分屬于13個(gè)屬，詳細(xì)信息見表1。本文聯(lián)合線粒體13個(gè)蛋白編碼基因，探討迄今已測定線粒體基因組全序列的飛虱科13屬18種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以驗(yàn)證線粒體蛋白編碼基因在飛虱科系統(tǒng)發(fā)育研究中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

18個(gè)飛虱科昆蟲物種的線粒體基因組序列數(shù)據(jù)均下載自GenBank，具體情況見表1。

表1 飛虱科線粒體基因及外群的GenBank信息

Table1 GenBank information of mitochondrial genes of Delphacidae and Outgroup

屬種GenBank登錄號參考文獻(xiàn) UgyopsU. sp.MH352481.1Fang Y. & A.P. Liang, 2018[26] BambusiphagaB. furcaMH293453.1Huang Y.X., F.J. Ren & C.R. Bartlett et al. 2020[27] BambusiphagaB. taibaishanaMH293456.1Huang Y.X., F.J. Ren & C.R. Bartlett et al. 2020[27] EpeurysaE. nawaiiMH293459.1Huang Y.X., F.J. Ren & C.R. Bartlett et al. 2020[27] TropidocephaiaT. brunnipennisMH293471.1Huang Y.X., F.J. Ren & C.R. Bartlett et al. 2020[27] SaccharosydneS. procerusMG515237.1Huang Y.X. & D.Z. Qin, 2018[28] PeregrinusP. maidisMG049917.1Huang Y.X. & D.Z. Qin, 2017[29] PerkinsiellaP. saccharicidaMH293466.1Huang Y.X., F.J. Ren & C.R. Bartlett et al. 2020[27] NilaparvataN. bakeri|KC333655.1Lu L., X.X. Peng & S.L. Jing et al. 2015[30] NilaparvataN. muiriJN563998.1Lu L., X.X. Peng & S.L. Jing et al. 2015[30] NilaparvataN. lugensJN563995.1Lu L., X.X. Peng & S.L. Jing et al. 2015[30] ChangeondelphaxC. velitchkoskyiMG049916.1Huang Y.X. & D.Z. Qin, 2018[31] ChlorionaC. tateyamanaMH293458.1Huang Y.X., F.J. Ren & C.R. Bartlett et al. 2020[27] IshiharodelphaxI. matsuyamensisMH293461.1Huang Y.X., F.J. Ren & C.R. Bartlett et al. 2020[27] Sogatella S. furciferaKC512914.1Zhang K.J., W.C. Zhu & Rong X. et al. 2014[32] SogatellaS. kolophonMW009064.1Yu F. & Z.S. Song 2021[33] SogatellaS. vibixMG515238.1Huang Y.X. & D.Z. Qin, 2018[28] LaodelphaxL. striatellusFJ360695.1Song N. & A.P. Liang, 2009[34] CicadellaC. viridisMK335936.1Zhong L.K., H.X. Li & X.F. Yu, et al. 2019[35] CicadettaC. absconditaMW123088.1unpublished

1.2 分析方法

多序列比對與序列聯(lián)合：13個(gè)線粒體蛋白編碼序列分別通過MegaX（Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms）軟件進(jìn)行多序列比對[36]，經(jīng)過人工修剪后保存為fasta格式。然后使用MegaX軟件對比對后的蛋白編碼基因進(jìn)行多序列聯(lián)合，形成單一的聯(lián)合序列。

堿基序列分析：在MegaX中分別查看各基因堿基長度，計(jì)算基因的堿基組成，統(tǒng)計(jì)各基因的不變位點(diǎn)（C）、可變位點(diǎn)（V）和信息位點(diǎn)（PI）的堿基數(shù)，并計(jì)算13蛋白編碼基因聯(lián)合序列的堿基配對頻率，包括相同堿基對數(shù)（ii）、轉(zhuǎn)換堿基對數(shù)（si）、顛換堿基對數(shù)（sv）以及轉(zhuǎn)換/顛換比（R）。

距離法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹：在MegaX中采用NJ法（Neighbor-joining Method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹的檢驗(yàn)（Test of Phylogeny）采用Bootstrap method，重復(fù)次數(shù)（No. of Bootstrap Replications）為1000次，其余選項(xiàng)采用默認(rèn)設(shè)置。

最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹：利用IQTREE 1.6.12軟件進(jìn)行進(jìn)化模型的選擇[37]，然后基于BIC標(biāo)準(zhǔn)選擇最佳模型，利用最大似然法構(gòu)建ML樹。

貝葉斯法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹：利用MrModeltest 2.0軟件分別計(jì)算13個(gè)編碼基因的堿基替換模型[38]，然后利用MrBayes3.27構(gòu)建貝葉斯進(jìn)化樹[39]。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿基序列分析

通過NCBI網(wǎng)站下載了飛虱科18個(gè)物種的線粒體全基因組和2個(gè)外群的線粒體基因組，通過線粒體基因組信息，分別提取出每個(gè)物種的13個(gè)蛋白編碼基因。13個(gè)線粒體蛋白編碼序列分別通過MegaX（Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms）軟件進(jìn)行多序列比對，經(jīng)過人工修剪后保存為fasta格式。然后使用MegaX軟件將比對好的13個(gè)蛋白編碼基因進(jìn)行多序列聯(lián)合，形成單一的聯(lián)合序列。13個(gè)蛋白編碼基因的長度、位點(diǎn)信息及堿基多樣性信息見表2。其中NAD5基因長度最長（1728 bp），ATP8基因長度最短（129 bp），C/V值最高的是COX1（0.96），最低的是NAD4L（0.21），信息位點(diǎn)（PI）最高的是NAD5，最低的是ATP8。13蛋白編碼基因聯(lián)合序列的堿基組成見表3，其中平均A+T含量為76.33%，遠(yuǎn)高于G+C含量。13蛋白編碼基因聯(lián)合序列的堿基配對頻率見表4，平均相同堿基對（ii = Identical Pairs）7579bp，轉(zhuǎn)換堿基對（si = Transitional Pairs）982bp，顛換堿基對（sv = Transversional Pairs）1856bp，轉(zhuǎn)換/顛換比（R = si/sv）為0.50。

表2 13蛋白編碼基因聯(lián)合序列位點(diǎn)信息

Table 2 Site information of 13 protein coding genes

GeneLengthSitesCVC/VPI NAD210111-10111847850.23646 COX115331012-25447527810.96644 COX26722545-32162544180.61331 ATP81293217-334525800.3165 ATP66663346-40111774770.37386 COX37804012-47912675130.52425 NAD33544792-5145642870.22252 NAD517285146-687344012550.35934 NAD413206874-81933249900.33796 NAD4L2888194-8481492240.21176 NAD65078482-8988934020.23315 CYTB11258989-101134416840.64569 NAD191510114-110282856300.45493 Total110281-11028335575260.456029

注：C代表保守位點(diǎn)；V代表可變位點(diǎn)；Pi代表信息位點(diǎn)；

表3 13蛋白編碼基因聯(lián)合序列堿基組成

Table 3 Nucleotide composition of the combined sequence of the 13 protein coding gene

SpeciesT(U)%C%A%G%Total ength Bambusiphaga furca42.4012.5834.7510.279147 Bambusiphaga taibaishana43.0412.0135.459.499147 Changeondelphax velitchkovskyi42.8614.0631.6111.4710805 Chloriona tateyamana41.8115.0330.8812.2810806 Cicadella viridis44.7911.2332.0211.9510799 Cicadetta abscondita44.4110.2933.8011.4910875 Epeurysa nawaii43.4512.9732.6710.9110824 Ishiharodelphax matsuyamensis44.2312.5532.2910.9310809 Laodelphax striatellus43.4113.2532.3111.0310752 Nilaparvata bakeri44.0612.7232.5410.6910677 Nilaparvata lugens43.9912.8431.9511.2210677 Nilaparvata muiri43.3913.3332.0111.2610680 Peregrinus maidis43.6013.1032.1411.1610809 Perkinsiella saccharicida44.3012.4032.5810.7210809 Saccharosydne procerus45.3011.1033.869.7410806 Sogatella furcifera43.5613.6430.8811.9110803 Sogatella kolophon43.7712.8732.2111.1510809 Sogatella vibix43.8213.2031.5411.4410809 Tropidocephala brunnipennis44.7811.4434.119.6710815 Ugyops sp42.1212.5534.2811.0610827 Avg.43.6712.6632.6611.0110624.25

表4 13蛋白編碼基因聯(lián)合序列堿基配對頻率

Table 4 Nucleotide pair frequencies of the combined sequence of the 13 protein coding gene

iisisvRTTTCTATGCCCACGAAAGGGTotal Avg757998218560.503486601127422484727683244338180210417.2

注：ii = Identical Pairs，代表相同堿基對；si = Transitional Pairs，代表轉(zhuǎn)換堿基對；sv = Transversional Pairs，代表顛換堿基對；R =si/sv，代表轉(zhuǎn)換/顛換比

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于線粒體13蛋白編碼基因聯(lián)合序列分別采用距離法、最大似然法和貝葉斯推斷法構(gòu)建了飛虱科13屬18種的系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖1-3）。三種方法得到的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)構(gòu)幾乎完全一致，均能把相同屬的物種或近緣種聚在一起，僅在部分分支的支持率上有所差別。研究結(jié)果表明在飛虱科13屬中，屬較為原始，處于系統(tǒng)樹的基部，其余12個(gè)屬分別聚為2支，屬、屬、屬和屬聚為一支，屬、屬、屬、屬、屬、屬、屬和屬聚為另一支。

圖1 基于13蛋白編碼基因構(gòu)建的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 基于13蛋白編碼基因構(gòu)建的最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 基于13蛋白編碼基因構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

通過對昆蟲遺傳物質(zhì)的研究，可以探討不同分類水平上昆蟲類群之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、進(jìn)化機(jī)制和種群遺傳變異及分化。目前用于昆蟲系統(tǒng)學(xué)研究的主要方法有核酸序列分析（DNA sequence analysis）、限制性片段長度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP）、分子雜交技術(shù)（molecular hybridization）、隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析（random amplified polymorphic DNA, RAPD）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformational polymorphism, SSCP）和雙鏈多態(tài)性（double-strand conformational polymorphism, DSCP）分析等。近年來，線粒體基因已成為動物分子系統(tǒng)學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的遺傳物質(zhì)之一。線粒體DNA具有進(jìn)化速率較核DNA快，遺傳過程不發(fā)生基因重組、倒位、易位等突變特點(diǎn)，并且遵守嚴(yán)格的母系遺傳方式等特點(diǎn)[40]。昆蟲的線粒體基因長為15-20 Kb的雙鏈環(huán)狀DNA分子，包含2個(gè)核糖體RNA（rRNA）基因，22個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）基因和13個(gè)蛋白編碼基因[41]?；诰€粒體編碼基因開展物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究已在節(jié)肢動物直翅目[42]、雙翅目[43]、鱗翅目[25]44等昆蟲以及甲殼類[45]、魚類[46]和脊椎動物中開展了大量研究，結(jié)果表明基于線粒體多基因的聯(lián)合可以更好的解析物種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

本研究基于線粒體蛋白編碼基因序列構(gòu)建的飛虱科13屬18種的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果支持屬在飛虱科中較為原始，處于系統(tǒng)樹的基部，這與Dijkstra, Slotman and Post的結(jié)果一致。三種方法獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)構(gòu)幾乎完全一致，均能把相同屬的物種或近緣種聚在一起，其中飛虱屬先與屬、屬聚為一支，然后再與屬聚為一支，屬與屬姐妹群，屬與屬聚為一支，屬先與屬相聚，再與屬聚為一支，這與Park, Xi H, Park J et al.的研究結(jié)果一致。基于線粒體編碼基因得到的飛虱科種屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系符合飛虱科傳統(tǒng)分類結(jié)果，進(jìn)一步驗(yàn)證了線粒體編碼基因在飛虱科系統(tǒng)發(fā)育研究中的應(yīng)用價(jià)值。然而，由于飛虱科物種多樣性極其豐富，本研究僅包含了少量飛虱科物種，驗(yàn)證線粒體蛋白編碼基因用于飛虱系統(tǒng)發(fā)育研究的可行性，若要解決整個(gè)飛虱科的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系則需要更多飛虱物種分子數(shù)據(jù)的支持。

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PHYLOGENTIC ANALYSIS WITHIN 13 GENERA OF DELPHACIDAE BASED ON THE CONCATENATED PROTEIN CODING GENES OF MITOCHONDRIAL GENOMES

*ZHANG Zheng-guang，ZHAO Fang，SU Tian-juan，JIANG Kai

（School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China）

Delphacidae, belonging to Fulgoroidea of Hemiptera, is one of the most important agricultural pests in the world. The mitochondrial genome of insects has been proven to be a useful genetic marker for molecular and evolutionary studies. The objective of this study is to infer phylogenetic relationships among 18 species of 13 genera mitochondrial genomes within Delphacidae. The results of phylogenetic trees constructed by distance method, maximum likelihood method and Bayesian method are consistent. Among the 13 genera of planthopper family, Ugyops is relatively primitive and located at the base of the phylogenetic tree. The other 12 genera cluster into two branches respectively.,,andcluster into one branch,,,,,,,, andconverge into another branch. The evolutionary status and classification of 18 species are consistent with the results of traditional morphological classification.

mitochondrial genomes; phylogenetics; Delphacidae

1674-8085（2022）03-0027-07

S433.3

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2022.03.005

2021-06-30；

2022-01-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31960219，31460157)；江西省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(20171BAB204010)

*張爭光（1979-），男，山東濟(jì)寧人，副教授，博士，主要從事昆蟲系統(tǒng)學(xué)和分子生態(tài)學(xué)研究(Email: zhzhg0537@163.com).