木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響及作用機(jī)制研究

郗 歐，劉禹岐，馬 進(jìn)，焦富英，阮 林

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 腦病一科，遼寧 沈陽 110034；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)二科，遼寧 沈陽 110034）

血管內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋于血管表面，是血液和血管組織之間的天然屏障。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障的重要組成部分，其損傷是腦血管疾病發(fā)生的最直接原因[1]。因此，保護(hù)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷對腦血管疾病的治療尤為重要。木通皂苷D 是中藥續(xù)斷的主要活性成分之一，具有多種藥理作用。研究顯示，木通皂苷D 可減輕H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，提高內(nèi)皮細(xì)胞纖溶功能并抑制血小板的聚集，具有治療心腦血管疾病的潛在價(jià)值[2]；木通皂苷D 通過提高肝組織中GSH 和SOD 活性及降低MDA 含量減輕CCl4引起的小鼠急性肝損傷[3]。circ_TTC3 是一種環(huán)狀RNA（circRNA），參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等生理或病理過程，其異常表達(dá)可影響多種疾病的發(fā)展進(jìn)程。研究顯示，circ_TTC3在大腦中動脈閉塞/再灌注（MCAO/R）小鼠模型及葡萄糖剝奪（OGD）誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)升高，敲減circ_TTC3 可降低MCAO/R 小鼠腦梗死面積及腦組織含水量，同時(shí)減少OGD 誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與靶向調(diào)控miR-372-3p/Toll 樣受體4（TLR4）軸有關(guān)，circ_TTC3 有可能成為中風(fēng)引起的腦缺血再灌注損傷治療的分子靶點(diǎn)[4]。本研究建立脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC）損傷模型，觀察木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的影響及其能否通過調(diào)控circ_TTC3 發(fā)揮作用，以期為其用于腦血管疾病的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、試劑和儀器

人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（上海中喬新舟生物科技有限公司）；木通皂苷D（純度≥98%，上海純優(yōu)生物科技有限公司）；LPS（美國Sigma 公司）；CCK-8 試劑盒、Annexin V-FITC/PI 試劑盒和DMEM 培養(yǎng)液（北京索萊寶科技有限公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；LipofectamineTM2000 試劑盒（美國Invitrogen 公司）；引物序列、circ_TTC3siRNA （si-circ_TTC）和過表達(dá)載體（pcDNA-circ_TTC3）、siRNA陰性序列（si-NC）和空載體（pcDNA）（上海生工生物工程股份有限公司）；SOD 和MDA 試劑盒（南京建成生物工程研究所）。371 型CO2培養(yǎng)箱（美國ThermoForma 公司）；Fax-2100 型酶標(biāo)儀（美國Awareness 公司）；FACSCalibur 分析型流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；T100 型PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組處理 復(fù)蘇HBMEC，加含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液（基礎(chǔ)培養(yǎng)液）置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將HBMEC 分為對照組、LPS 組、LPS+木通皂苷D 低、中、高劑量組。對照組細(xì)胞用DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，LPS 組細(xì)胞用含1.0 mg/L[5]LPS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，LPS+木通皂苷D低、中、高劑量組細(xì)胞分別用含12.5、25、50 μmol/L[2]木通皂苷D 和1.0 mg/L LPS 的DMEM 培養(yǎng)液共同培養(yǎng)24 h。

1.2.2 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖抑制率 將對數(shù)期HBMEC（2.5 × 104個(gè)/mL）接種至96 孔板中，每孔0.2 mL，培養(yǎng)4 h 后，棄培養(yǎng)液，分組處理。處理后，每孔加10 μL CCK-8。孵育2 h，用酶標(biāo)儀（450 nm）測吸光度（A）值。增殖抑制率（%） = （A對照組-A實(shí)驗(yàn)組）/A對照組×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將對數(shù)期HBMEC（2.5 × 104個(gè)/mL）接種至6 孔板中，每孔2.5 mL。培養(yǎng)4 h 后，棄培養(yǎng)液，分組處理。處理后，收集各組細(xì)胞，用PBS 清洗2 次，并調(diào)整密度為1.0 ×106個(gè)/mL。取1.0 mL 細(xì) 胞 懸 液，1 000 r/min 離 心5 min 后，棄上清，加500 μL 結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞。加10 μL Annexin V-FITC，避 光 孵 育10 min。再 加5 μL PI，避光孵育5 min后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.4 比色法檢測細(xì)胞中SOD 活性和MDA 含量細(xì)胞接種和分組處理同“1.2.3”。處理后，收集各組細(xì)胞，PBS 清洗2 次，加細(xì)胞裂解液裂解20 min。將裂解液3 500 r/min 離心10 min，取上清液，分別利用SOD 和MDA 試劑盒，采用比色法檢測SOD 活性及MDA 含量。

1.2.5 qRT-PCR 檢測circ_TTC3 表達(dá) 細(xì)胞接種和分組處理同“1.2.3”。處理后，收集各組細(xì)胞，PBS清洗2 次。用RNA 抽屜試劑盒提取各組細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。引物序列：circ_TTC3 上游5′-CCTGTGTAGAAGCCATCC GT-3′，下 游5′-ATCATCAGTG GTAAAGTCAGGA GTA-3′；GADPH 上 游5′-CCAAGGTCATCCATGA CAAC-3′，下游5′-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3′。2-△△Ct法計(jì)算circ_TTC3 相對GADPH 的表達(dá)量。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和處理 將對數(shù)期HBMEC（2.5 ×104個(gè)/mL）接種至6 孔板中，每孔2.5 mL。培養(yǎng)24 h 后，棄培養(yǎng)液，用LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染si-circ_TTC3、si-NC、pcDNA-circ_TTC3、pcDNA。轉(zhuǎn)染12 h 后，更換為完全培養(yǎng)液。再培養(yǎng)24 h 后，棄培養(yǎng)液，qRT-PCR 法檢測細(xì)胞中circ_TTC3 表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染si-NC、si-circ_TTC3 的HBMEC 均用含1.0 mg/L LPS 的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別記為LPS + si-NC 組、LPS + si-circ_TTC3組。轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-circ_TTC3 的HBMEC 均用含50 μmol/L 木通皂苷D 與1.0 mg/L LPS 的培養(yǎng)液共同培養(yǎng)24 h，分別記為LPS +木通皂苷D + pcDNA組、LPS +木通皂苷D + pcDNA-circ_TTC3 組。分別按照“1.2.2”“1.2.3”“1.2.4”項(xiàng)下方法檢測細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率及細(xì)胞中MDA 含量和SOD 活性。1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的影響

LPS 組HBMEC 增殖抑制率、凋亡率及細(xì)胞中MDA 含量均高于對照組（P＜ 0.05），細(xì)胞中SOD 活性低于對照組（P＜ 0.05）。LPS +木通皂苷D 低、中、高劑量組HBMEC 增殖抑制率、凋亡率及細(xì)胞中MDA 含量均低于LPS 組（P＜ 0.05），細(xì)胞中SOD活性高于LPS 組（P＜ 0.05），且LPS +木通皂苷D 低、中、高劑量組各檢測指標(biāo)兩兩組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖1、表1。

表1 木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的影響（±s，n = 3）Tab. 1 The effect of Akebia saponin D on LPS-induced HBMEC apoptosis and oxidative stress （±s，n = 3）

表1 木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的影響（±s，n = 3）Tab. 1 The effect of Akebia saponin D on LPS-induced HBMEC apoptosis and oxidative stress （±s，n = 3）

注：與對照組相比，*P ＜ 0.05；與LPS 組相比，#P ＜ 0.05；與LPS+木通皂苷D 低劑量組相比，△P ＜ 0.05；與LPS+木通皂苷D 中劑量組相比，□P ＜ 0.05。

分組 抑制率/% 凋亡率/% SOD/（U/L） MDA/（nmol/L）對照組 0.00 ± 0.00 7.79 ± 0.73 446.71 ± 22.77 165.30 ± 15.99 LPS 組 56.39 ± 1.74* 23.70 ± 1.25* 117.21 ± 12.02* 584.58 ± 35.87*LPS+木通皂苷D 低劑量組 45.01 ± 2.44*# 19.48 ± 0.91*# 170.22 ± 12.89*# 505.88 ± 16.60*#LPS+木通皂苷D 中劑量組 31.98 ± 1.38*#△ 15.96 ± 0.82*#△ 229.10 ± 18.72*#△ 367.99 ± 20.79*#△LPS+木通皂苷D 高劑量組 19.41 ± 0.88*#△□ 10.94 ± 0.66*#△□ 384.79 ± 24.38*#△□ 224.32 ± 16.13*#△□F 622.700 152.086 167.797 190.669 P 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 木通皂苷D 抑制LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡Fig. 1 Akebia saponin D inhibits LPS-induced HBMEC apoptosis

2.2 木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 中circ_TTC3表達(dá)的影響

LPS 組HBMEC 中circ_TTC3 表 達(dá) 量 高 于 對 照組（P＜ 0.05）。LPS+木通皂苷D 低、中、高劑量組HBMEC 中circ_TTC3 表達(dá)量均低于LPS 組（P＜0.05），且LPS+木通皂苷D 低、中、高劑量組circ_TTC3 表達(dá)量兩兩組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見表2。

表2 木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 中circ_TTC3 表達(dá)的影響（±s，n = 3）Tab. 2 The effect of Akebia saponin D on the expression of circ_TTC3 in HBMEC induced by LPS （±s，n = 3）

表2 木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 中circ_TTC3 表達(dá)的影響（±s，n = 3）Tab. 2 The effect of Akebia saponin D on the expression of circ_TTC3 in HBMEC induced by LPS （±s，n = 3）

注：與對照組相比，*P ＜ 0.05；與LPS 組相比，#P ＜ 0.05；與LPS+木通皂苷D 低劑量組相比，△P ＜ 0.05；與LPS+木通皂苷D 中劑量組相比，□P ＜ 0.05。

分組 circ_TTC3對照組 1.00 ± 0.00 LPS 組 4.27 ± 0.12*LPS+木通皂苷D 低劑量組 3.44 ± 0.09*#LPS+木通皂苷D 中劑量組 2.88 ± 0.10*#△LPS+木通皂苷D 高劑量組 1.73 ± 0.13*#△□F 521.446 P 0.000

2.3 沉默或過表達(dá)circ_TTC3 的轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證

si-circ_TTC3 組HBMEC 中circ_TTC3 表 達(dá) 量 為0.41 ± 0.03，明顯低于si-NC 組circ_TTC3 表達(dá)量1.00 ±0.00（t= 34.064，P＜ 0.05）， 說 明 si-circ_TTC3 組HBMEC 中circ_TTC3 表達(dá)較si-NC 組沉默。pcDNAcirc_TTC3 組HBMEC 中circ_TTC3 表達(dá) 量 為1.96 ±0.06，明顯高于pcDNA組circ_TTC3表達(dá)量1.00 ± 0.00（t= 26.847，P＜ 0.05），說明pcDNA-circ_TTC3 組HBMEC 中circ_TTC3 表達(dá)較pcDNA 組過表達(dá)。

2.4 沉默circ_TTC3 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的影響

LPS + si-circ_TTC3 組HBMEC 增殖抑制率、凋亡率及細(xì)胞中MDA 含量均低于LPS + si-NC 組（P＜0.05），細(xì)胞中SOD 活性高于LPS + si-NC 組（P＜0.05），見圖2、表3。

圖2 沉默circ_TTC3 抑制LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡Fig. 2 Silencing circ_TTC3 inhibits LPS-induced HBMEC apoptosis

表3 沉默circ_TTC3 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的影響（±s，n = 3）Tab. 3 The effect of silencing circ_TTC3 on LPS-induced HBMEC apoptosis and oxidative stress（±s，n = 3）

表3 沉默circ_TTC3 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的影響（±s，n = 3）Tab. 3 The effect of silencing circ_TTC3 on LPS-induced HBMEC apoptosis and oxidative stress（±s，n = 3）

分組 抑制率/% 凋亡率/% SOD/（U/L） MDA/（nmol/L）LPS+si-NC 組56.41 ± 2.22 23.86 ± 1.30 119.76 ± 12.86 573.16 ± 27.43 LPS+si-circ_TTC3 組24.26 ± 1.46 12.56 ± 0.59 355.54 ± 19.90 252.26 ± 12.63 t 20.957 13.710 17.236 18.406 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.5 過表達(dá)circ_TTC3 逆轉(zhuǎn)木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的影響

LPS +木通皂苷D+pcDNA-circ_TTC3組HBMEC增殖抑制率、凋亡率及細(xì)胞中MDA 含量均高于LPS +木通皂苷D + pcDNA 組（P＜ 0.05），細(xì)胞中SOD 活性低于LPS +木通皂苷D + pcDNA 組（P＜ 0.05），見圖3、表4。

圖3 過表達(dá)circ_TTC3 逆轉(zhuǎn)木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡的抑制作用Fig. 3 Overexpression of circ_TTC3 reverses the inhibitory effect of Akebia saponins D on LPS-induced HBMEC apoptosis

表4 過表達(dá)circ_TTC3 逆轉(zhuǎn)木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的作用（±s，n = 3）Tab. 4 Overexpression of circ_TTC3 reverses the effect of Akebia saponin D on LPS-induced HBMEC apoptosis and oxidative stress（±s，n = 3）

表4 過表達(dá)circ_TTC3 逆轉(zhuǎn)木通皂苷D 對LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激的作用（±s，n = 3）Tab. 4 Overexpression of circ_TTC3 reverses the effect of Akebia saponin D on LPS-induced HBMEC apoptosis and oxidative stress（±s，n = 3）

分組 抑制率/% 凋亡率/% SOD/（U/L） MDA/（nmol/L）LPS+木通皂苷D+pcDNA 組19.64 ± 1.08 10.96 ± 0.68 379.52 ± 29.90 228.87 ± 12.75 LPS+木通皂苷D+pcDNAcirc_TTC3 組42.18 ± 1.97 19.12 ± 0.73 193.10 ± 10.31 446.48 ± 19.66 17.377 14.167 10.209 16.085 P 0.000 0.000 0.000 0.000 t

3 討論

人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC）是腦內(nèi)微環(huán)境的主要結(jié)構(gòu)，HBMEC 的損傷是常見腦微血管疾病的使動環(huán)節(jié)。腦組織損傷后，腦微血管攣縮、內(nèi)皮細(xì)胞體積變小、細(xì)胞間的間隙增加，逐步形成血栓，加重腦損傷[6]。LPS 是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，其可激活細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷[7]。LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 損傷模型常被用于體外模擬腦損傷。在LPS 的作用下，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的多種氧化酶產(chǎn)生大量活性氧（ROS），過量的ROS可引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成細(xì)胞氧化損傷[8]。MDA 是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，其水平高低可間接反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平[9]。SOD 是一種抗氧化酶，其可清除氧自由基，減輕細(xì)胞氧化損傷[10]。細(xì)胞內(nèi)MDA 含量的增加及SOD 活性的降低可說明細(xì)胞氧化受損。

續(xù)斷是川續(xù)斷科多年生草本植物川續(xù)斷DipsacusasperWall.ex Henry 的干燥根，具有補(bǔ)肝、強(qiáng)筋骨等功效。木通皂苷D 是續(xù)斷的主要活性成分，具有神經(jīng)保護(hù)、心肌保護(hù)、抗骨質(zhì)疏松、保肝降脂等藥理作用[11]。已有研究表明，木通皂苷D 可抑制神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡，具有治療緩解神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的急性肺損傷的潛在價(jià)值[12]；木通皂苷D 可通過下調(diào)ECE2 和A2M 基因表達(dá)保護(hù)PC12 細(xì)胞免受Aβ25-35損傷[13]。然而，還未見木通皂苷D 影響人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，木通皂苷D 抑制LPS 引起的HBMEC 凋亡及氧化應(yīng)激損傷。

circRNA 是一類非編碼RNA，呈閉合環(huán)狀，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且高度保守。近年來，隨著對circRNA研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激等過程中起重要調(diào)控作用[14-16]。研究已表明，circ_0003423[17]、circ_ANRIL[18]等circRNA 參 與 調(diào)控HBMEC 損傷，可作為減輕HBMEC 損傷的分子靶點(diǎn)。作為一種circRNA，circ_TTC3 也參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激等過程[19-20]。本研究結(jié)果顯示，circ_TTC3 也可能成為減輕HBMEC 損傷的分子靶點(diǎn)，且木通皂苷D 可能通過下調(diào)circ_TTC3來抑制LPS 誘導(dǎo)的HBMEC 凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)。

4 結(jié)論

木通皂苷D 可能通過下調(diào)circ_TTC3 表達(dá)在LPS誘導(dǎo)的HBMEC 損傷模型中發(fā)揮保護(hù)作用，其具有治療腦血管疾病的潛在藥用價(jià)值。但本實(shí)驗(yàn)僅利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了研究，后續(xù)將進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證木通皂苷D 對HBMEC 損傷的保護(hù)作用，同時(shí)進(jìn)一步探究circ_TTC3 調(diào)控的下游基因和信號通路。