基于近紅外漫反射光譜法所建的模型快速預(yù)測甜葉菊中甜菊糖苷、綠原酸及水分的含量

張?zhí)O蘋，石文杰，楊清山，2，王立勛，程遠欣，2*

(1.晨光生物科技集團股份有限公司，邯鄲 057250；2.河北省植物天然色素技術(shù)研究院，邯鄲 057250)

甜葉菊中除甜菊糖苷類化合物之外，還含有綠原酸類、黃酮類化合物等[1-4]。從甜葉菊葉片中提取的甜菊糖苷類化合物是一種天然的甜味劑，由甜菊苷(STV)、瑞鮑迪苷A(RA)、瑞鮑迪苷B、瑞鮑迪苷C、瑞鮑迪苷D、瑞鮑迪苷F、杜克苷A、甜茶苷、甜菊雙糖苷等9種甜菊糖苷單體組成，其熱量低、甜度高(約是蔗糖的300倍)[5-6]。綠原酸類化合物是咖啡酸與奎尼酸生成的縮酚酸，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降糖等多種活性作用[7-9]，甜葉菊中主要含有新綠原酸(5-CQA)、綠原酸(3-CQA)、隱綠原酸(4-CQA)、異綠原酸B(3，4-diCQA)、異綠原酸A(3，5-diCQA)、異綠原酸C(4，5-diCQA)等6種綠原酸單體。正是這些特性，使得甜葉菊在食品、飲料和制藥行業(yè)變得越來越重要。

目前，甜菊糖苷、綠原酸的測定方法大多采用高效液相色譜法，該方法精密度較高，但分析時間長，前處理繁瑣[10-16]；而近紅外光譜檢測技術(shù)因簡單、便捷、快速而備受關(guān)注[17-19]。并且，文獻大多是對甜葉菊中RA、STV 兩種甜菊糖苷單體進行研究[20-23]，尚未發(fā)現(xiàn)近紅外光譜法測定甜葉菊中9種甜菊糖苷單體總量(TSG)和6種綠原酸單體總量的報道。鑒于此，本工作以高效液相色譜法和烘干法為參比，采用近紅外漫反射光譜法對500個甜葉菊樣品進行分析，結(jié)合偏最小二乘法(PLS)建立了甜葉菊中RA、STV、TSG、綠原酸總量和水分的定量分析模型，以期對甜葉菊采購和實際生產(chǎn)提供一定的方法參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

AntarisⅡ型傅里葉變換近紅外光譜儀，配漫反射積分球附件、信號采集系統(tǒng)以及Result、TQ Analyst等數(shù)據(jù)處理軟件；Agilent 1260 型高效液相色譜儀(用于分析甜菊糖苷)；Waters e2695型高效液相色譜儀(用于分析綠原酸)；SQP 型電子天平；JJ5000型電子天平；HBYQ 型電熱鼓風(fēng)干燥箱。

磷酸二氫鈉溶液(pH2.6)：10 mmol·L－1，稱取磷酸二氫鈉1.560 1 g，用水溶解并定容至1 L，再用磷酸調(diào)節(jié)溶液酸度至pH2.6，配制成濃度為10 mmol·L－1的磷酸二氫鈉溶液。

RA 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：稱取0.025 g RA 標(biāo)準(zhǔn)品，用30%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙腈溶液定容至10 mL，混勻，配制成2.5 g·L－1RA 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。使用時，用30%乙腈溶液稀釋至所需質(zhì)量濃度。

綠原酸單體標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：稱取5-CQA、3-CQA、4-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA、4，5-diCQA標(biāo)準(zhǔn)品各0.025 g，用甲醇定容至25 mL，混勻，配制成6種綠原酸單體質(zhì)量濃度均為1.0 g·L－1的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。使用時，用甲醇稀釋至所需質(zhì)量濃度。

RA 標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于99.0%，5-CQA、3-CQA、4-CQA、3，4-diCQA、3，5-diCQA、4，5-diCQA標(biāo)準(zhǔn)品的純度均大于95.0%；三氟乙酸為優(yōu)級純；乙腈、甲醇均為色譜純；磷酸二氫鈉、磷酸均為分析純；試驗用水為純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 高效液相色譜法

1)甜菊糖苷 SHISEIDO(MGII)C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；柱溫40℃；流動相為體積比32∶68的乙腈-10 mmol·L－1磷酸二氫鈉溶液(pH2.6)的混合液；流量1.0 mL·min－1；進樣量10μL；檢測波長210 nm。

2)綠原酸 Phenomenex Kinetex C18反相色譜柱(100 mm×4.6 mm，5μm)；柱溫25℃；流動相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸溶液，B 為乙腈；流量1.5 mL·min－1；進樣量3μL；檢測波長330 nm。梯度洗脫程序：0～10 min時，A 由95%降至80%，保持3 min；13～14 min時，A 由80%降至60%，保持3 min；17～18 min時，A 由60%升至95%，保持2 min。

1.2.2 近紅外漫反射光譜法

掃描溫度為室溫；掃描范圍4 000～10 000 cm－1；掃描次數(shù)64次；分辨率8.0 cm－1。

1.3 試驗方法

1.3.1 高效液相色譜法

1)RA、STV 和TSG 的測定 將甜葉菊樣品粉碎，過0.425 mm(40目)篩網(wǎng)。稱取過篩后的樣品粉末1.000 0 g于250 mL錐形瓶中，加入100 mL水，用保鮮膜封口，于80 ℃恒溫水浴鍋中加熱1 h，冷卻至室溫，取上層清液，過0.45μm 尼龍濾膜。按照1.2.1節(jié)進行測定，每個樣品平行測定兩次，兩次測定值的相對偏差的絕對值不超過0.60%。

2)綠原酸總量的測定 將甜葉菊樣品粉碎，過0.425 mm 篩網(wǎng)(過篩率需大于95%)，合并篩上篩下所有樣品于混樣袋中，充分混勻，搖晃時間不少于5 min。稱取樣品粉末1.000 0 g，用70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶液溶解并定容至100 mL，超聲2 h，取上層清液，過0.45μm 聚四氟乙烯(PTFE)濾膜。按照1.2.1節(jié)進行測定，每個樣品平行測定兩次，兩次測定值的相對偏差的絕對值不超過3.0%。

1.3.2 烘干法

將玻璃瓶皿(直徑16 cm)放入105 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中加熱至恒重，稱重，記為G1。將甜葉菊樣品粉碎，過0.425 mm 篩網(wǎng)。稱取樣品粉末20.00 g于玻璃瓶皿中，將其放入(105±1)℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中加熱烘干約2 h，稱重，并重復(fù)以上操作至兩次稱重的質(zhì)量差不超過0.01 g，記為G2，按照公式(G1－G2)/20.00 g×100%計算水分含量，每個樣品平行測定兩次，兩次測定值的相對偏差的絕對值不超過0.50%。

1.3.3 模型的建立

選取新疆、江蘇、甘肅、內(nèi)蒙、東北和河北等6個地區(qū)的甜葉菊共500個，分別粉碎、過篩，將過篩后的樣品粉末裝入3個樣品杯中，按照1.2.2節(jié)進行掃描，取平均光譜。以高效液相色譜法和烘干法為參比，采用TQ Analyst軟件中的PLS，按照表1中TSG、RA、STV、綠原酸總量和水分的建模條件分別建立模型，將待測樣品的近紅外光譜圖導(dǎo)入相應(yīng)的模型進行分析。其中，MSC 為多元散射校正，SNV 為標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換，1st為一階導(dǎo)數(shù)，2nd為二階導(dǎo)數(shù)，SG 為Savitzky-Golay卷積平滑，ND 為Norris derivative濾波平滑。

表1 TSG、RA、STV、綠原酸總量和水分的建模條件Tab.1 Modeling conditions of TSG，RA，STV，total chlorogenic acids and moisture

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相色譜法的分析結(jié)果

2.1.1 RA、STV 和TSG

按照1.2.1 節(jié)對質(zhì)量 濃度為0.062 5，0.125，0.250，0.500，1.0，2.0 g·L－1的RA 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進行測定，以RA 的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，RA 的質(zhì)量濃度在0.062 5～2.0 g·L－1內(nèi)與其對應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y＝1 856x，相關(guān)系數(shù)為0.999 4。

按照1.3.1節(jié)對500 個甜葉菊樣品進行測定，RA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.324%～8.979%。按照公式(1)計算其他8種甜菊糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Xi)，9種組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和即為TSG，結(jié)果得STV 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.181%～4.523%，TSG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.633%～15.960%。某甜葉菊樣品中9種甜菊糖苷的色譜圖見圖1。

圖1 甜葉菊樣品中9種甜菊糖苷的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 9 steviol glycosides in stevia sample

式中：Xi為組分i的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；Si為組分i的峰面積；V為樣品溶液的體積，100 mL；m為試樣稱樣量，1.000 0 g；k為RA 線性回歸方程的斜率，1 856；fi為組分i與RA 的式量比值，1.00(STV)，1.00(瑞鮑迪苷B)，1.18(瑞鮑迪苷C)，1.40(瑞鮑迪苷D)，1.16(瑞鮑迪苷F)，0.98(杜克苷A)，0.80(甜茶苷)，0.80(甜菊雙糖苷)[24]。

2.1.2 綠原酸總量

配制 質(zhì)量濃度為0.002 0，0.005 1，0.012 6，0.031 6，0.079 0，0.395 2 g·L－1的5-CQA標(biāo)準(zhǔn)溶液系列；0.0021，0.005 3，0.013 2，0.033 1，0.082 8，0.414 0 g·L－1的3-CQA 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列；0.002 1，0.005 2，0.013 0，0.032 6，0.081 5，0.407 6 g·L－1的4-CQA 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列；0.002 2，0.005 5，0.013 8，0.034 5，0.086 2，0.430 8 g·L－1的3，4-diCQA標(biāo)準(zhǔn)溶液系列；0.002 1，0.005 2，0.012 9，0.032 3，0.080 8，0.404 0 g·L－1的3，5-diCQA 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列；0.002 2，0.005 6，0.013 9，0.034 8，0.086 9，0.434 4 g·L－1的4，5-diCQA 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按照1.2.1節(jié)對上述6種綠原酸單體標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進行測定，以各綠原酸單體的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，6種綠原酸單體標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性參數(shù)見表2。

表2 線性參數(shù)Tab.2 Linearity parameters

按照試驗方法對500個甜葉菊樣品進行測定，計算每個樣品中6種綠原酸單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和，結(jié)果得綠原酸總量為1.48%～6.98%。某甜葉菊樣品中6種綠原酸的色譜圖見圖2。

圖2 甜葉菊樣品中6種綠原酸的色譜圖Fig.2 Chromatogram of 6 chlorogenic acids in stevia sample

2.2 烘干法結(jié)果

按照1.3.2節(jié)對500 個甜葉菊樣品進行分析，結(jié)果得500個甜葉菊樣品中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～12%。

2.3 近紅外漫反射光譜法的分析結(jié)果

2.3.1 近紅外光譜圖

按照1.3.2節(jié)采集500個甜葉菊樣品的近紅外光譜圖，結(jié)果見圖3。

圖3 近紅外光譜圖Fig.3 Near infrared spectra

結(jié)果表明，在波數(shù)4 000～10 000 cm－1內(nèi)，500個樣品的近紅外吸收均不超過0.9，每個樣品的近紅外光譜圖的趨勢幾乎一致，而同一波長下的吸光度不同，說明樣品成分接近，但各成分含量存在差異。

2.3.2 TSG、RA、STV、綠原酸總量和水分的定量分析模型

采用TQ Analyst軟件中的光譜異常值(spectrum outlier)、杠桿值(leverage)、主成分分?jǐn)?shù)3D 顯示(pricipal component scores 3D display)功能對500個樣品的近紅外光譜圖進行識別，根據(jù)格魯布斯法(Grubs)，在顯著性水平為0.05條件下剔除異常樣品，并按照樣品中各組分含量高低對剩余樣品劃分校正集和驗證集。同時，為避免近紅外光譜圖中吸收峰重疊、漂移、噪聲等因素的影響，通常采用MSC、SNV、1st、2nd、SG、ND 等方式對光譜進行預(yù)處理，從而放大、分離重疊信息，提高信噪比。另外，在對不同組分進行建模時，需要選擇合適的光譜范圍。根據(jù)校正相關(guān)系數(shù)(RC)、校正均方根誤差(RMSEC)、預(yù)測相關(guān)系數(shù)(RP)、預(yù)測均方根誤差(RMSEP)、交叉驗證相關(guān)系數(shù)(RCV)、交叉驗證均方根誤差(RMSECV)來確認最佳模型。優(yōu)化后的校正集和驗證集、光譜預(yù)處理方式、光譜范圍、主因子數(shù)見表1；在TSG、RA、STV、綠原酸總量和水分的建模條件下，相應(yīng)的模型參數(shù)見表3。

模型的相關(guān)系數(shù)越大，均方根誤差越小，說明模型的分析效果越好，預(yù)測值與真實值越接近。由表3可知，TSG、RA、STV、綠原酸總量和水分定量分析模型的RC、RP、RCV均大于0.800 0，且RMSEC、RMSEP、RMSECV 均小于0.500，表明模型具有較好的預(yù)測效果。

表3 TSG、RA、STV、綠原酸總量和水分的模型參數(shù)Tab.3 Model parameters of TSG，RA，STV，total chlorogenic acids and moisture

2.4 模型的外部驗證

額外選取未參與建模的30個具有代表性的甜葉菊樣品，按照1.3.1節(jié)進行測定，得到TSG、RA、STV、綠原酸總量和水分的實測值；按照1.3.2節(jié)采集30個樣品的近紅外光譜圖，將近紅外光譜圖導(dǎo)入模型中，得到TSG、RA、STV、綠原酸總量和水分的預(yù)測值，結(jié)果見圖4。

圖4 外部驗證結(jié)果Fig.4 Results of external validation

結(jié)果表明：外部驗證樣品中TSG、RA、綠原酸總量和水分的預(yù)測值與實測值擬合的相關(guān)系數(shù)依次為0.957 0，0.912 5，0.979 5，0.928 1，說明預(yù)測結(jié)果較準(zhǔn)確，可以用于實際樣品分析；STV 的預(yù)測值與實測值擬合的相關(guān)系數(shù)為0.886 7，可以粗略預(yù)測樣品中STV 的含量。

2.5 精密度試驗

選取兩個不同的甜葉菊樣品，按照1.3.2 節(jié)于同一天不同時間段內(nèi)采集其近紅外光譜圖6次，采用TSG、RA、STV、綠原酸總量和水分模型進行分析，計算各組分測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以考查模型的日內(nèi)精密度；接著，連續(xù)6 d采集這兩個樣品的近紅外光譜圖，采用模型進行分析，計算各組分測定值的RSD，以考查模型的日間精密度，結(jié)果見表4。

表4 精密度試驗結(jié)果(n=6)Tab.4 Results of test for precision(n=6)

結(jié)果顯示，TSG、RA、STV、綠原酸總量和水分測定值的日內(nèi)RSD 為0.54%～2.7%，日間RSD 為1.1%～4.7%，表明所建立模型的精密度較高。

2.6 樣品分析

由于企業(yè)生產(chǎn)的甜菊糖苷主要監(jiān)測指標(biāo)是甜葉菊中的TSG、RA 和綠原酸總量水平，為了讓企業(yè)利潤最大化，需要測定不同生長期甜葉菊中TSG、RA和綠原酸總量，以確定甜葉菊的收割期。采摘某試驗基地不同生長批次的甜葉菊(批次號越大代表生長時間越久)，每批次隨機取12個樣品，采用模型進行分析，計算測定值的RSD，結(jié)果見表5。

表5 樣品分析結(jié)果(n=12)Tab.5 Analytical results of the samples(n=12)

結(jié)果顯示：每批次的12個樣品中TSG、RA、綠原酸總量測定值的RSD 均小于7.0%，說明批次內(nèi)甜葉菊植株間差異較??；隨著時間推移，甜葉菊中TSG、RA 和綠原酸總量均逐漸增多。通過該方法可快速預(yù)測不同時期甜葉菊中TSG、RA、綠原酸總量，從而確定最佳收割期，為農(nóng)民收割甜葉菊和企業(yè)采購甜葉菊提供可靠依據(jù)。

本工作以高效液相色譜法和烘干法為參比，采用近紅外漫反射光譜法采集500個甜葉菊樣品的近紅外光譜圖，通過剔除可疑樣品光譜圖，劃分校正集與驗證集，優(yōu)化光譜預(yù)處理方式和光譜范圍，建立了甜葉菊中TSG、RA、STV、綠原酸總量和水分的定量分析模型，各模型參數(shù)較優(yōu)，預(yù)測效果較好，精密度較高。利用模型可對甜葉菊中TSG、RA、STV、綠原酸總量和水分進行快速預(yù)測，為甜葉菊的實際生產(chǎn)和樣品采購提供了一定的技術(shù)參考。