響應(yīng)面法優(yōu)化美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶加工工藝*

王 鑫，成學(xué)冰，魏玉凱，王佳燕，李 碩，韓都柱，王 鑫，王琳琳*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院，河北 黃驊 061100）

美國靈芝中的靈芝多糖具有免疫調(diào)節(jié)[1]、降低血糖[2]、抗氧化[3]和解酒護(hù)肝[4-6]作用。姬松茸含有人體所需的8種必需氨基酸以及多種維生素，可以調(diào)節(jié)人體免疫功能[7-8]、改善學(xué)習(xí)記憶力、促進(jìn)人骨髓造血功能以及抗疲勞[9]、抗腫瘤[10-11]等生物功效。

酸奶是一種由乳酸菌經(jīng)發(fā)酵而成的乳制品，具有獨(dú)特風(fēng)味。隨著生活水平的提高，人們更加注重食品營養(yǎng)問題[12]。現(xiàn)在市場上普遍存在的是原味酸奶和水果酸奶，其中，水果酸奶在一定程度上提高了酸奶的營養(yǎng)價值，增強(qiáng)了一定的口味。但食用菌酸奶很少涉足，本次實(shí)驗(yàn)主要采用美國靈芝和姬松茸的液態(tài)培養(yǎng)物和菌絲球?yàn)樵?，采用單因素試?yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對其加工工藝進(jìn)行優(yōu)化，研究一款新型食用菌酸奶。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

美國靈芝、姬松茸由本實(shí)驗(yàn)室提供；嗜熱乳酸鏈球菌（Streptococcus thermophilus）與保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)選自川秀乳酸菌酸奶發(fā)酵粉；奶源采用伊利利樂包純牛奶。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

SW-CJ-1FB無菌操作臺，杭州川一實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SPX-250B-D振蕩培養(yǎng)箱，上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司；BAS224S電子天平，賽多利斯科技有限公司；DL-6M冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 美國靈芝、姬松茸復(fù)合酸奶加工工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 美國靈芝、姬松茸菌絲制備

（1）液態(tài)PDA培養(yǎng)基制備：將土豆去皮切條，稱取200 g土豆條放入鍋中，加入1 000 mL水，加熱煮沸25 min，用四層紗布趁熱過濾，取濾液，定容至1 000 mL。輕微加熱，加入20 g白砂糖，攪拌，待完全溶解后補(bǔ)充水分至1 000 mL。趁熱將其分裝到250 mL錐形瓶中，每瓶100 mL，用封口膜將三角瓶封好，于滅菌鍋中121℃滅菌20 min[13]。冷卻備用。

（2）美國靈芝、姬松茸菌絲培養(yǎng)：在已培養(yǎng)好的美國靈芝和姬松茸平板上，切取邊長為1 cm的正方形小塊若干，每瓶液態(tài)PDA培養(yǎng)基接種三塊，美國靈芝、姬松茸各接種5瓶。置于160 r/min搖床培養(yǎng)6 d，獲得美國靈芝菌絲發(fā)酵液、姬松茸菌絲發(fā)酵液。

（3）美國靈芝、姬松茸菌絲發(fā)酵液制備：將1.2.2.1（2）中獲得的美國靈芝菌絲發(fā)酵液、姬松茸發(fā)酵液置于組織搗碎機(jī)中搗碎，得到美國靈芝勻漿菌絲發(fā)酵液、姬松茸勻漿菌絲發(fā)酵液。

1.2.2.2 酸奶制備

（1）調(diào)配、滅菌：將新鮮牛奶放入鍋中加熱，隨后加入7%白砂糖。均質(zhì)，于60℃加熱30 min滅菌。

（2）冷卻、接種：a.待溫度冷卻至 40～45 ℃時加入川秀乳酸菌發(fā)酵劑，按照每750 mL牛奶加入1 g發(fā)酵劑。充分混勻后，分裝到150 mL酸奶瓶中，每瓶裝入130 mL。b.并按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)比例分別添加美國靈芝勻漿菌絲發(fā)酵液、姬松茸勻漿菌絲發(fā)酵液。

（3）保溫發(fā)酵：將接種后的酸奶瓶按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)溫度時間放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵。

（4）冷卻、后熟：待發(fā)酵好的酸奶稍冷卻后放入4℃冰箱內(nèi)再發(fā)酵12 h[14]，即得酸奶成品。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 美國靈芝、姬松茸比例的確定

以美國靈芝、姬松茸總添加量為5%，將美國靈芝、姬松茸的比例按照 1∶2、1∶1、2∶1 分別加入到裝有130 mL牛奶（糖添加量7%，發(fā)酵劑添加量750 mL/g）的150 mL酸奶瓶中，于43℃發(fā)酵7 h，對成品進(jìn)行感官評定、持水力和酸度的測定。

1.2.3.2 美國靈芝、姬松茸總添加量的確定

以美國靈芝、姬松茸比例為1∶1，將美國靈芝、姬松茸總添加量按照3%、5%、8%分別加入到裝有130 mL牛奶（糖添加量7%，發(fā)酵劑添加量750 mL/g）的150 mL酸奶瓶中，于43℃發(fā)酵7 h，對成品進(jìn)行感官評定、持水力和酸度的測定。

1.2.3.3 發(fā)酵溫度的確定

以美國靈芝、姬松茸比例為1∶1和總添加量為5%加入到裝有130 mL牛奶（糖添加量7%，發(fā)酵劑添加量750 mL/g）的150 mL酸奶瓶中，分別于39℃、41℃、43℃和45℃培養(yǎng)7 h，對成品進(jìn)行感官評定、持水力和酸度的測定。

1.2.3.4 發(fā)酵時間的確定

以美國靈芝、姬松茸比例為1∶1和總添加量為5%加入到裝有130 mL牛奶（糖添加量7%，發(fā)酵劑添加量750 mL/g）的150 mL酸奶瓶中，于43℃分別培養(yǎng)5 h、6 h、7 h和8 h，對成品進(jìn)行感官評定、持水力和酸度的測定。

1.2.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示方法，顯著性差異采用Duncan多重比較法進(jìn)行比較[15]。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定四因素三水平試驗(yàn)，以感官評定、持水力和酸度為綜合依據(jù)進(jìn)行優(yōu)化，因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 Box-Beheken設(shè)計(jì)因素水平及水平編碼

1.3 評價指標(biāo)

1.3.1 感官評定

參考屈茹琪[16]感官評定標(biāo)準(zhǔn)，采用評分分析法對美國靈芝、姬松茸復(fù)合酸奶的乳清析出情況、組織狀態(tài)、風(fēng)味和滋味進(jìn)行評定，評分為百分制，由10名受過專業(yè)培訓(xùn)的學(xué)生組成評定小組，按照表2的評定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評定，結(jié)果去除最高分和最低分，剩余分?jǐn)?shù)取平均值，試驗(yàn)結(jié)果保留兩位小數(shù)，即得到產(chǎn)品最終的感官評定分?jǐn)?shù)。

表2 美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶的感官評定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2 持水力

持水力反應(yīng)蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)對水的保持能力，持水力越高，酸奶質(zhì)地越好，不易發(fā)生蛋白析出[17]。

參考李海平等[17]持水力測定方法，持水力的測定方法如下：

取20 g酸奶樣品于離心管中，以3 500 r/min速度離心30 min，去上清液稱取沉淀物質(zhì)質(zhì)量。持水力公式如下：

式中：AW為持水力，%；m1為離心后沉淀物總質(zhì)量；m2為樣品總質(zhì)量。

1.3.3 酸度

酸奶酸度可以保證酸奶產(chǎn)品的風(fēng)味、口感、粘稠度等，一般情況下酸度在60～100°T的酸奶口感較好，國家標(biāo)準(zhǔn)中對酸奶酸度的要求是≥70°T[12,18]。

參照GB 5009.239-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測定》進(jìn)行酸度滴定[18]，酸奶酸度的測定方法如下：

（1）氫氧化鈉溶液的標(biāo)定。準(zhǔn)確稱取0.40～0.50g基準(zhǔn)試劑鄰苯二甲酸氫鉀三份，置于錐形瓶中標(biāo)號，加20～30 mL蒸餾水溶解后，加一滴酚酞指示劑。用配置好的氫氧化鈉溶液分別滴定至溶液呈紅色，30s內(nèi)不褪色。記錄每次消耗的氫氧化鈉溶液的體積數(shù)。

式中：C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度；m1為基準(zhǔn)試劑鄰苯二甲酸氫鉀的質(zhì)量；V1為滴定時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積；204.22：鄰苯二甲酸氫鉀的摩爾質(zhì)量。

（2）酸度測定。稱取10 g樣品，置于150 mL錐形瓶中。加20 mL蒸餾水，混勻。再加2.0 mL酚酞溶液，混勻。用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色，并在30 s內(nèi)不褪色。記錄消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積數(shù)，重復(fù)三次。

式中：X為式樣的酸度，單位為度；C2為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度；V2為滴定時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積；m2為試樣質(zhì)量；0.1為酸度理論定義氫氧化鈉的摩爾濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 美國靈芝、姬松茸添加比例對酸奶質(zhì)量影響

通過表3分析得出，菌比例為1∶1時，酸奶質(zhì)量較高。菌比例為1∶1時，感官評分最高，此時，酸奶外觀細(xì)膩，無乳清析出且口感較好無異味；同時菌比例為1∶1時，持水力明顯高于其它兩組；菌比例為1∶1時，酸度在國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定范圍內(nèi)高于其它兩組。因此，綜合感官評分、持水力、酸度，選擇美國靈芝：姬松茸＝1∶1為最佳菌比例較為合適。

表3 菌比例對持水力、酸度以及感官評定的影響

2.1.2 美國靈芝、姬松茸總添加量對酸奶質(zhì)量影響

通過表4分析得出，美國靈芝、姬松茸總添加量為5%時，酸奶質(zhì)量較高，感官評分也最高，為85.26左右，在3%和8%時感官評分處于同一水平面，均低于總添加量5%條件下感官評分；菌種總添加量為3%、5%時持水力處于同一水平面，優(yōu)于8%時的持水力；酸度在3%、5%條件下處于同一水平面。因此，綜合感官評分、持水力、酸度，選擇總添加量為5%較為合適。

表4 總添加量對持水力、酸度以及感官評定的影響

2.1.3 發(fā)酵溫度對酸奶質(zhì)量的影響

通過表5分析得出，發(fā)酵溫度為43℃時，酸奶質(zhì)量較高。在39℃下，感官評定得分小于其他三組且其它三組處于同一水平面并無明顯區(qū)別；持水力在39℃、41℃、43℃和45℃四個溫度變化下仍處于同一水平面；在41℃下酸度較其它三個溫度下較低，45℃最高，但是考慮到實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中節(jié)約能源、降低成本的需求和原則且綜合感官評分、持水力、酸度，選擇發(fā)酵溫度為43℃較為合適。

表5 發(fā)酵溫度對持水力、酸度以及感官評定的影響

2.1.4 發(fā)酵時間對酸奶質(zhì)量的影響

通過表6分析得出，發(fā)酵時間為7 h時，酸奶質(zhì)量較高。感官評定得分在7 h和8 h達(dá)到最高，處于同一水平面且高于其他兩組；在四種發(fā)酵時間下，持水力處于同一水平面；5 h下酸度最低，且一般情況下酸度在60～100°T的酸奶口感較好，國家標(biāo)準(zhǔn)中對酸奶酸度的要求是≥70°T[12]。8 h條件時超出范圍，故排除。因此，綜合感官評分、持水力、酸度，選擇發(fā)酵時間7 h較為合適。

表6 發(fā)酵時間對持水力、酸度以及感官評定的影響

綜上所述，美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶在加工過程中選擇的最佳加工條件為：菌比例（美國靈芝：姬松茸）=1∶1、菌種總添加量5%、發(fā)酵溫度43℃、發(fā)酵時間7 h。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)對感官評定的影響

2.2.1.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與感官評定結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定菌比例、總添加量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度為試驗(yàn)因素。根據(jù)Box-Beheken試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平方案（表1），采用四因素三水平響應(yīng)面分析，結(jié)果見表7。

表7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)對感官評定結(jié)果

2.2.1.2 感官模型檢驗(yàn)

采用Design-Expert 12軟件對于表進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，得到感官評定Y1與A菌比例、B菌總添加量、C發(fā)酵溫度、D發(fā)酵時間的二元多次回歸模型為Y1=91.04+4.66A+0.3560B+1.03C-2.53D-0.2914AB+0.0126AC-3.83AD-0.0347BC+3.20BD-0.5375CD-7.07A2-3.58B2-2.47C2-1.56D2

Box-Beheken試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表8。

由表8可知交互項(xiàng)（AD、BD）對酸奶感官評分較為顯著，且模型顯著，說明其與實(shí)際情況具有較高的吻合度，失擬項(xiàng)差異不顯著，說明方程可以更好的用于美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶工藝的優(yōu)化。

表8 感官評定Box-Beheken試驗(yàn)結(jié)果方差分析

為驗(yàn)證方差分析結(jié)果，對交互項(xiàng)（AD、BD）顯著的曲面圖和等高線圖進(jìn)行分析，曲面的陡峭程度反映對感官評分的影響程度，越陡，說明影響越大；而等高線反映了各因素交互作用的大小，橢圓表示作用顯著[19]。結(jié)果如圖1～圖2所示。

圖1 菌比例和發(fā)酵時間交互影響感官評分的曲面圖和等高線

圖2 總添加量和發(fā)酵時間交互影響感官評定的曲面圖和等高線

由圖1和圖2分析可知，根據(jù)感官評定得出的美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶的最佳加工工藝為：菌比例（美國靈芝：姬松茸）=226：200、菌種總添加量為4.779%、發(fā)酵溫度為42.998℃、發(fā)酵時間為7.358 h，此時預(yù)測感官評分為89.742。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)對持水力的影響

2.2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與持水力結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定菌比例、總添加量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度為試驗(yàn)因素。根據(jù)Box-Beheken試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平方案（表1），采用四因素三水平響應(yīng)面分析，結(jié)果見表9。

表9 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)對持水力結(jié)果

2.2.2.2 持水力模型檢驗(yàn)

采用Design-Expert 12軟件對于表進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，得到持水力Y2與A菌比例、B菌總添加量、C發(fā)酵溫度、D發(fā)酵時間的二元多次回歸模型為

Box-Beheken試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表10。

表10 持水力Box-Beheken試驗(yàn)結(jié)果方差分析

由表10可知交互項(xiàng)（AC）對酸奶持水力較為顯著，且模型顯著，說明其與實(shí)際情況具有較高的吻合度，失擬項(xiàng)差異不顯著，說明方程可以更好地用于美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶工藝的優(yōu)化。

為驗(yàn)證方差分析結(jié)果，對交互項(xiàng)（AC）顯著的曲面圖和等高線圖進(jìn)行分析，曲面的陡峭程度反映了對持水力的影響程度，越陡，說明影響越大；而等高線反映了各因素交互作用的大小，橢圓形表示作用顯著[19]。結(jié)果如圖3所示。

圖3 菌比例和發(fā)酵溫度交互影響持水力的曲面圖和等高線

由圖3分析可知，根據(jù)持水力得出的美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶的最佳加工工藝為：菌比例（美國靈芝：姬松茸）=229∶200、菌種總添加量為 5.197%、發(fā)酵溫度為43.077℃、發(fā)酵時間為6.732 h，此時預(yù)測持水力為0.880。

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)對酸度的影響

2.2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與酸度結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定菌比例、總添加量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度為試驗(yàn)因素。根據(jù)Box-Beheken試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平方案（表1），采用四因素三水平響應(yīng)面分析，結(jié)果見表11。

表11 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)對酸度結(jié)果

2.2.3.2 酸度模型檢驗(yàn)

采用Design-Expert 12軟件對于表進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，得到酸度Y3與A菌比例、B菌總添加量、C發(fā)酵溫度、D發(fā)酵時間的二元多次回歸模型為Y3=94.92+3.50A+0.3722B-1.03C+3.41D+0.7769AB-0.8664AC+3.42AD+0.5462BC-0.2859BD-2.05CD-7.29A2-5.27B2-0.1911C2-0.3855D2

Box-Beheken試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表12。

表12 酸度Box-Beheken試驗(yàn)結(jié)果方差分析

由表12可知交互項(xiàng) （AD）對酸奶酸度較為顯著，且模型顯著，說明其與實(shí)際情況具有較高的吻合度，失擬項(xiàng)差異不顯著，說明方程可以更好地用于美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶工藝的優(yōu)化。

為驗(yàn)證方差分析結(jié)果，對交互項(xiàng)（AD）顯著的曲面圖和等高線圖進(jìn)行分析，曲面的陡峭程度反映對酸度的影響程度，越陡，說明影響越大；而等高線反映了各因素交互作用的大小，橢圓表示作用顯著[19]。結(jié)果如圖4所示。

圖4 菌比例和發(fā)酵時間交互影響酸度的曲面圖和等高線

由圖4分析可知，根據(jù)酸度得出的美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶的最佳加工工藝為：菌比例 （美國靈芝：姬松茸）=329：250、菌種總添加量為 5.405%、發(fā)酵溫度為42.706℃、發(fā)酵時間為6.617 h。此時預(yù)測酸度為93.02。

2.2.4 結(jié)果綜合分析

根據(jù)感官評定優(yōu)化試驗(yàn)得出的美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶的最佳加工工藝為：菌比例（美國靈芝∶姬松茸）=226∶200、菌種總添加量為 4.779%、發(fā)酵溫度為42.998℃、發(fā)酵時間為7.358 h；根據(jù)持水力優(yōu)化試驗(yàn)得出的美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶的最佳加工工藝為：菌比例（美國靈芝∶姬松茸）=229∶200、菌種總添加量為5.197%、發(fā)酵溫度為43.077℃、發(fā)酵時間為6.732 h；根據(jù)酸度優(yōu)化試驗(yàn)得出的美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶的最佳加工工藝為：菌比例（美國靈芝∶姬松茸）=329：250、菌種總添加量為5.405%、發(fā)酵溫度為42.706℃、發(fā)酵時間為6.617 h。為了試驗(yàn)的可操作性，將美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶的最佳加工工藝調(diào)整為：菌比例（美國靈芝∶姬松茸）=1∶1、菌種總添加量為5%、發(fā)酵溫度為43℃、發(fā)酵時間為7 h。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，將美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶的最佳加工工藝調(diào)整為：菌比例（美國靈芝∶姬松茸）=1∶1、菌種總添加量為5%、發(fā)酵溫度為43℃、發(fā)酵時間為7 h。預(yù)測美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶的感官評分為89.742、持水力為0.880、酸度為93.020。進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，得到的最終感官評定為90.275、持水力為0.8762、酸度為95.5944，與預(yù)測值接近，說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶的最佳加工工藝是合理的。

2.4 成品比較

最終，我們按照最佳加工工藝制作成品美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶及其空白對照酸奶。采用CAT試劑盒對其蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定，測定美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶CAT活力為18.652 U/mg prot，空白對照酸奶CAT活力為0.8814 U/mg prot。結(jié)果表明：隨著美國靈芝、姬松茸菌絲的加入，對酸奶蛋白質(zhì)含量有著顯著提高。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)表明，美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶的最佳加工工藝為：菌比例（美國靈芝∶姬松茸）=1∶1、菌種總添加量為 5%、發(fā)酵溫度為43℃、發(fā)酵時間為7 h。在此工藝條件下美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶外觀細(xì)膩，風(fēng)味醇厚，無乳清析出。同時，持水力較高，蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)對水的保持能力強(qiáng)。美國靈芝姬松茸復(fù)合酸奶憑借其獨(dú)特的風(fēng)味和較高的蛋白質(zhì)含量有著良好的市場前景。