BMAP-28對乳腺癌Bcap37細胞的抗腫瘤活性研究

李昂 王順 劉桃源 衣同輝 李淑艷 潘洪明

【摘要】 目的：研究BMAP-28對乳腺癌Bcap37細胞增殖及凋亡的影響。方法：體外培養(yǎng)Bcap37細胞，設(shè)置對照組（BMAP-28濃度為0 μg/mL）和實驗組（BMAP-28濃度分別為20、40、60、80 μg/mL）。CCK-8實驗檢測Bcap37細胞的增殖情況;DAPI染色觀察細胞凋亡形態(tài)學(xué)變化;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。結(jié)果：CCK-8實驗測得BMAP-28對Bcap37細胞的增殖具有抑制作用，BMAP-28的IC50=49.19 μg/mL。DAPI染色可見隨著BMAP-28濃度的增加，細胞凋亡數(shù)量增加，凋亡形態(tài)明顯。流式細胞術(shù)顯示細胞凋亡率逐漸增高，趨勢和DAPI染色結(jié)果一致（P<0.01）。結(jié)論：BMAP-28能顯著抑制乳腺癌Bcap37細胞的增殖，促進癌細胞的凋亡，有望成為臨床乳腺癌治療的新型抗癌藥物。

【關(guān)鍵詞】 BMAP-28 乳腺癌 增殖 凋亡

Study on Anti-tumor Activity of BMAP-28 on Breast Cancer Bcap37 Cells/LI Ang， WANG Shun， LIU Taoyuan， YI Tonghui， LI Shuyan， PAN Hongming. //Medical Innovation of China， 2022， 19（10）： 0-016

[Abstract] Objective： To study the effects of BMAP-28 on the proliferation and apoptosis of breast cancer Bcap37 cells. Method： Bcap37 cells were cultured in vitro， the control group （BMAP-28 concentration was 0 μg/mL）

and the experimental group （BMAP-28 concentrations were 20， 40， 60， 80 μg/mL） were set up. CCK-8 assay was used to detect the cell proliferation of breast cancer Bcap37 cells， DAPI staining was used to observe the morphological changes of cell apoptosis， flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of cells. Result： CCK-8

assay showed that BMAP-28 can inhibit the proliferation of breast cancer Bcap37 cells， IC50=49.19 μg/mL. DAPI staining showed that with the increase of BMAP-28 concentration， the number of cell apoptosis increased， and the apoptotic morphology was obvious. Flow cytometry showed that the rate of cell apoptosis increased and the trend was consistent with the result of DAPI staining （P<0.01）. Conclusion： BMAP-28 can significantly inhibit the proliferation of breast cancer Bcap37 cells and promote the apoptosis of cancer cells， which is hopefully to be a new type of anticancer agents for clinical breast cancer treatment.

[Key words] BMAP-28 Breast cancer Proliferation Apoptosis

First-authors address： School of Medical Technology， Qiqihar Medical University， Qiqihar 161006， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.10.004

癌癥是全球范圍最受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一，嚴(yán)重危害人類生命健康。國際癌癥研究機構(gòu)（international agency for research on cancer，IARC）最新發(fā)布的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年全球新發(fā)癌癥病例1 930萬例，死亡1 000萬例。而在女性當(dāng)中，乳腺癌（占新發(fā)病例的11.7%）首次超過肺癌（11.4%），成為女性癌癥中最常見的類型[1]。一些常規(guī)的化療藥物不僅利用率低，癌癥復(fù)發(fā)率高，且常伴有細胞耐藥性[2]。

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是少于50個氨基酸組成的小分子短肽，通常帶正電荷，且呈兩親性[3]。它是機體先天免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，能殺滅細菌、真菌、寄生蟲及病毒等[4]。近年來人們發(fā)現(xiàn)越來越多的AMPs同時具有抗腫瘤活性[5-6]。BMAP-28是牛中性粒細胞中發(fā)現(xiàn)的一種牛骨髓抗菌肽，屬于Cathelicidin家族，于1996年首次被發(fā)現(xiàn)[7]。該肽由28個氨基酸組成，其N-末端呈兩親性-螺旋構(gòu)象（殘基1-18），C-末端是疏水尾部（殘基19-27），帶有7個正電荷[8]。早期研究報道BMAP-28具有廣譜抗菌活性，能夠抑制多種革蘭陰性、革蘭陽性細菌及其他耐藥菌[9-10]，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)BMAP-28還具有不同程度的抗腫瘤活性。本課題通過研究BMAP-28對乳腺癌Bcap37細胞增殖和凋亡的影響，為癌癥的臨床研究及新型抗乳腺癌藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 研究起止時間：2021年3-8月。乳腺癌細胞系Bcap37由大連理工大學(xué)惠贈;BMAP-28購自安徽國肽生物有限公司;DMEM-H（美國Gibco公司）;胎牛血清（美國Clark公司）;CCK-8試劑盒（南京碧云天生物技術(shù)有限公司）;DAPI染色液（北京索萊寶有限公司）;Annexin V-FITC/PI試劑盒（北京博奧森技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) Bcap37細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞融合度達80%～90%時，PBS沖洗后用0.25%胰酶消化，再用配制好的培養(yǎng)基吹打并制備成單細胞懸液，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8實驗測定細胞增殖能力 收集對數(shù)生長期的Bcap37細胞，按5×103個/孔的密度將細胞接種于96孔板。設(shè)置對照組（BMAP-28濃度0 μg/mL）、實驗組（BMAP-28終濃度分別為20、40、60、80 μg/mL），每組設(shè)置5個復(fù)孔。每孔加入100 μL相應(yīng)濃度的BMAP-28，對照組加入相同體積DMEM-H培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，按照CCK-8試劑盒說明，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，孵育2 h后測定450 nm波長下的吸光度值。每組不同濃度取3個復(fù)孔的OD值計算細胞活力。計算半數(shù)抑制濃度（IC50），并篩選最佳作用時間。

1.2.3 DAPI實驗觀察細胞凋亡情況 細胞處理及分組方式同1.2.2。取6孔板以5×104個/孔密度接種細胞，每組設(shè)置3個復(fù)孔。BMAP-28作用24 h后用PSB沖洗2次，每孔加入適量4%多聚甲醛溶液，置于-20 ℃冰箱固定20 min。棄去固定液，用PBS沖洗2次后，每孔加入適量DAPI染色工作液，室溫下避光孵育10 min。PBS沖洗2～3次后，熒光顯微鏡下拍照觀察各組細胞形態(tài)變化。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 細胞處理及分組方式同1.2.2。細胞按1×105個/孔接種于6孔板。BMAP-28作用24 h后，離心收集各組細胞。按照試劑盒操作流程進行Annexin V-FITC和PI染色，1 h內(nèi)用流式細胞儀測定各組中正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞的比例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8實驗測定細胞增殖情況 BMAP-28作用24、48 h后，對Bcap37細胞增殖的抑制趨勢均增強，且隨著濃度的增加，細胞活力逐漸降低。實驗組不同濃度24、48 h細胞活力與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。應(yīng)用GraphPad Prism 8.0繪制24、48 h時BMAP-28濃度抑制曲線（圖1）。采用非線性回歸分析，計算出BMAP-28作用Bcap37細胞24 h的IC50=49.19 μg/mL。

2.2 DAPI實驗觀察細胞形態(tài)變化 與對照組相比，不同濃度的BMAP-28作用24 h后，可見細胞邊界逐漸收縮變圓，細胞形態(tài)變得模糊形成碎片，細胞核大小不一，核內(nèi)部分染色質(zhì)出現(xiàn)斷裂或皺縮形成團塊。且隨藥物濃度的增加，細胞數(shù)量減少，凋亡細胞增多，見圖2。

2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 對照組（0 μg/mL）、實驗組（20、40、60、80μg/mL）細胞凋亡率依次為（3.983±1.556）%、（11.423±1.776）%、（31.767±5.159）%、（37.400±2.651）%、（44.833±4.826）%，隨著BMAP-28濃度的增高，凋亡細胞數(shù)量隨之增多，趨勢和DAPI染色結(jié)果一致，實驗組不同濃度（20、40、60、80μg/mL）細胞凋亡率與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。從20 μg/mL開始，BMAP-28對Bcap37細胞殺傷作用逐漸增大，見圖3。

3 討論

目前乳腺癌已超越肺癌，成為當(dāng)今全球第一大癌癥類型[11]?？鼓[瘤藥物的開發(fā)一直是癌癥治療的重點課題，分子靶向治療與免疫療法在癌癥治療中取得一定成效，但不良反應(yīng)及細胞耐藥性問題仍然難以解決[12-13]?？咕挠捎谄浞肿恿啃　⒁子谌斯ず铣?、不易產(chǎn)生耐藥性等特點受到廣泛關(guān)注[14]。對BMAP-28早期的研究主要集中在抗細菌、真菌及抗病毒活性。如BMAP-28能抑制多殺性巴氏桿菌（P.Multocida）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）及牛皰疹病毒1型（BoHV-1）和5型（BoHV-5）等病原體的生長。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)BMAP-28還對淋巴細胞瘤、甲狀腺癌等腫瘤細胞具有抑制作用[9，15-16]。

無限增殖是惡性腫瘤最基本的生物特征之一，也是引起癌癥患者死亡的根本原因[17]。本研究通過CCK-8實驗證明，隨著BMAP-28濃度的增加，Bcap37細胞存活率逐漸減小，說明BMAP-28具有抑制乳腺癌細胞增殖的作用。凋亡是細胞生理性死亡的過程，而腫瘤細胞由于調(diào)控機制等發(fā)生改變，往往能夠逃避凋亡機制，獲得無限增殖的能力[18]。因此促使腫瘤細胞發(fā)生凋亡，是一些新型抗癌藥物研究的重要方向之一。細胞凋亡的完整實現(xiàn)涉及廣泛的蛋白質(zhì)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的相互作用，以及一系列信號通路的級聯(lián)作用[19]。Caspase-3和Caspase-9是早期細胞凋亡細胞的標(biāo)志。前期已有學(xué)者證明BMAP-28能激活甲狀腺癌TT細胞Caspase-3和Caspase-9途徑，其蛋白和mRNA水平表達量均顯著增加，標(biāo)志著凋亡程序的啟動[16]。另外，BMAP-28還可以誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）的開放導(dǎo)致線粒體功能紊亂，并促使細胞色素C（Cyt-C）的釋放誘導(dǎo)細胞凋亡[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DAPI染色后可見Bcap37細胞邊界逐漸收縮變圓，形態(tài)變得模糊形成碎片，細胞核大小不一，核內(nèi)部分染色質(zhì)斷裂或皺縮形成團塊，提示BMAP-28能夠促進Bcap37細胞的凋亡。流式細胞術(shù)實驗也證實BMAP-28促進了Bcap37細胞發(fā)生凋亡，并呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)（P<0.01）。

綜上所述，BMAP-28能顯著抑制Bcap37細胞的增殖，并促進其凋亡，然而其分子機制尚不清楚，將在下一步的研究中繼續(xù)探討。

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（收稿日期：2021-08-17） （本文編輯：程旭然）