羊脂肪關(guān)鍵香氣成分分析

杜文斌，王羽桐，徐玉霞，謝建春*

（食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京食品風味化學重點實驗室，北京工商大學，北京 100048）

我國羊肉產(chǎn)量大[1]，作為羊肉加工副產(chǎn)物，羊脂肪資源豐富，但其深加工技術(shù)匱乏，導致資源浪費。動物脂肪對肉類特征風味的形成有重要貢獻[2-4]，尤其羊脂肪對提升羊肉類食品如涮羊肉的羊肉特征風味有明顯作用，但食用動物脂肪會給健康帶來隱患，其利用很有限。肉味香精是一類可賦予食品肉類風味的食品添加劑，在方便食品、休閑食品以及速凍食品等行業(yè)需求量大[5]。研究羊脂肪的風味物質(zhì)構(gòu)成，對研發(fā)羊肉味香精及促進羊脂肪在食品中的深度利用尤為重要。

迄今，關(guān)于羊脂肪揮發(fā)性成分研究已有較多報道[6-10]。例如，Caporaso等[6]采用水蒸氣蒸餾-冷阱收集的方法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析了綿羊脂肪揮發(fā)性成分。謝建春等[7]采用超臨界二氧化碳萃取結(jié)合GC-MS分析了調(diào)控氧化的精煉羊脂肪中的揮發(fā)性成分。Watkins等[8]分別采用同時蒸餾萃取和固相微萃取結(jié)合GC-MS分析了綿羊皮下脂肪揮發(fā)性成分。Vasta等[9]采用固相微萃取結(jié)合GC-MS分析比較了不同方式喂養(yǎng)羔羊脂肪揮發(fā)性成分。Sivadier等[10]采用動力學頂空-GC-MS分析了持續(xù)牧草喂養(yǎng)羔羊脂肪的揮發(fā)性標志物?；谝陨涎芯浚藗円褟难蛑局袡z測出大量的醛、酮、醇、羧酸、酯等揮發(fā)性物質(zhì)，并認為羊脂肪組織中的代謝物4-甲基辛酸和4-乙基辛酸對羊肉膻味起主要貢獻[11-13]。

食品風味分析中，GC-MS分析可獲得樣品的揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成信息，考察對樣品整體香氣成分有貢獻的關(guān)鍵物質(zhì)，還需采用氣相色譜-嗅聞（gas chromatographyolfactometry，GC-O）手段進行分析。GC-O為一種將氣相色譜高效分離與人鼻的嗅覺靈敏性相結(jié)合的技術(shù)，GC-O分析的檢測方法主要包括頻率法、強度法和香氣萃取物稀釋法（aroma extract dilution analysis，AEDA）[14-15]。AEDA的操作過程是：將樣品逐級稀釋并GC-O分析，化合物能被嗅聞到氣味時的最高稀釋倍數(shù)記為風味稀釋（flavor dilution，F(xiàn)D）因子，F(xiàn)D值越大表示對整體香氣的貢獻越大，因而經(jīng)AEDA/GC-O分析可篩選出樣品中對整體香氣貢獻大的化合物[14-16]。

溶劑輔助蒸發(fā)（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）法利用高真空蒸餾的原理將溶劑萃取物中的風味物質(zhì)進行分離，操作溫度接近室溫，處理條件溫和，得到的風味濃縮物接近真實的樣品，近年在食品風味分析上得到了廣泛應(yīng)用。本實驗前期采用SAFE結(jié)合GC-MS、AEDA/GC-O成功地分析了黑豬肉湯[17]、燉煮北京油雞肉湯[18]、山西老陳醋[16]、新鮮蒜黃[19]、烤羊肉[20]的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。本實驗采用SAFE裝置直接蒸餾揮發(fā)性組分，再結(jié)合GC-MS、AEDA/GC-O研究羊脂肪的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。研究結(jié)果可為羊肉味香精的制備及羊脂肪的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊腹部脂肪 永輝超市；二氯甲烷（色譜純）國藥集團化學試劑有限公司；C5～C29正構(gòu)烷烴（色譜純）北京化學試劑有限公司；鄰二氯苯（≥98%）、丙烯醛（≥98%）、丁醛（≥98%）、戊醛（≥98%）、己醛（≥98%）、庚醛（≥98%）、辛醛（≥98%）、(E,E)-2,4-己二烯醛（≥98%）、(E,E)-2,4-庚二烯醛（≥98%）、(E)-2-辛烯醛（≥98%）、(E)-2-癸烯醛（≥98%）、(E)-2-壬烯醛（≥98%）、(E,E)-2,4-辛二烯醛（≥98%）、(E,E)-2,4-壬二烯醛（≥98%）、(E,E)-2,4-癸二烯醛（≥98%）、(E)-2-十一烯醛（≥98%）、(E)-2-十二烯醛（≥98%）、十三醛（≥98%）、十五醛（≥98%）、苯甲醛（≥98%）、糠醛（≥98%）、噻吩（≥98%）、2-甲基噻吩（≥98%）、2,4-二甲基噻唑（≥98%）、糠硫醇（≥98%）、3-甲硫基丙醛（≥98%）、2-噻吩甲醛（≥98%）、4-甲基噻唑（≥95%）、4,5-二甲基噻唑（≥98%）、2,5-二甲基吡嗪（≥95%）、四甲基吡嗪（≥98%）、2,6-二甲基吡嗪（≥98%）、三甲基吡嗪（≥98%）、1-辛烯-3-醇（≥97%）、2-庚醇（≥95%）、辛醇（≥98%）、苯乙醇（≥97%）、2-十一酮（≥98%）、乙酸（≥95%）、丁酸（≥98%）、2-甲基丙酸（≥98%）、2-甲基丁酸（≥98%）、3-甲基丁酸（≥98%）、己酸（≥98%）、辛酸（≥98%）、壬酸（≥98%）、二甲基亞砜（≥95%）、5-丁基-二氫-2(3H)-呋喃酮（≥98%）、2(5H)-呋喃酮（≥95%）、庚烷（≥90%）、辛烷（≥90%）、十七烷（≥90%）、麥芽酚（≥98%）、苯酚（≥98%）、對甲酚（≥98%）、4-甲基辛酸（≥98%）、4-乙基苯酚（≥98%）、吲哚（≥98%）北京百靈威科技有限公司；脂肪酸甲酯標準品（色譜純） 上海安譜實驗科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C型GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司；氣味測量儀 美國DATU Inc公司；電磁爐 杭州九陽生活電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酸分析

參照GB 5009.168ü2016《食品中脂肪酸的測定》進行。準確稱取羊脂肪60 mg加入4 mL異辛烷中，加內(nèi)標參比液十七烷酸甲酯（溶于異辛烷，5 g/L，2 mL）、200 μL氫氧化鉀-甲醇溶液（2 mol/L），猛烈振搖30 s后靜置，將上層溶液轉(zhuǎn)移到具塞玻璃試管中，加入1 g硫酸氫鈉，猛烈振搖，靜置，取上層溶液參照文獻[21]進行GC-MS分析，通過檢索質(zhì)譜庫及與采用脂肪酸甲酯標品，對脂肪酸進行鑒定。脂肪酸甲酯含量先按式（1）計算，再根據(jù)國標中脂肪酸甲酯和脂肪酸之間的轉(zhuǎn)化系數(shù)計算各脂肪酸含量：

式中：xi為脂肪酸甲酯含量/（mg/g）；Ai為脂肪酸酯峰面積；As為十七烷酸甲酯的峰面積；V0為異辛烷體積/mL；Cs為十七烷酸甲酯質(zhì)量濃度/（g/L）；m為羊脂肪質(zhì)量/mg。

1.3.2 SAFE提取

羊脂肪（500f0.1）g，切成1 cmh1 cmh1 cm的小塊，放入鐵炒鍋，電磁爐加熱，不斷攪拌，加熱溫度（130f5）℃，加熱時間20 min。取加熱后的羊脂肪冷卻至室溫，SAFE裝置直接蒸餾處理。恒溫水槽溫度50 ℃，SAFE的蒸餾頭夾層循環(huán)水溫度為30 ℃，液氮冷凝，系統(tǒng)內(nèi)壓力保持10-5Pa左右，收集樣品0.3 mL。

1.3.3 揮發(fā)性成分GC-MS分析

DB-WAX色譜柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm），柱溫40 ℃，4.5 ℃/min升至180 ℃，然后7 ℃/min升至230 ℃。載氣為He，流速1 mL/min。進樣口溫度250 ℃；不分流模式，進樣量1 μL。

電子電離源，能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍50～450 u；輔助加熱線溫度230 ℃。

在相同GC-MS條件下進樣C5～C29正構(gòu)烷烴，按式（2）計算保留指數(shù)（retention index，RI）：

式中：tn和t（n+1）分別為碳原子數(shù)為n、n+1的正構(gòu)烷烴的保留時間；ti為出峰在n和n+1的正構(gòu)烷烴間的i化合物的保留時間。

1.3.4 GC-O分析

由7890A GC裝置及氣味測量裝置組成，毛細管柱為DB-WAX（30 mh0.25 mm，0.25 μm），起始柱溫40 ℃，5 ℃/min升至230 ℃；載氣為N2（純度為99.999%），流速1 mL/min，進樣口溫度250 ℃，不分流模式，進樣1 μL。

由3 名評價員完成，樣品用二氯甲烷按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等逐級稀釋，分別進行GC-O分析，并記錄嗅聞的RI、氣味特征、FD值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

3 份樣品的結(jié)果取均值為最終結(jié)果。GC-MS分析采用檢索NIST11譜庫、RI、標準品進樣鑒定化合物。GC-O分析中，氣味描述詞由3 名評價員協(xié)商確定，F(xiàn)D值取3 名評價員的平均值，根據(jù)RI、譜庫檢索、氣味特征及標準品比對鑒定化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊脂肪的脂肪酸分析

在加熱脂肪過程中，脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生人們喜好的脂肪風味。脂肪酸組成對脂肪的風味有重要影響，不同脂肪酸的氧化速率不同，氧化產(chǎn)生的揮發(fā)性風味化合物不同[22-23]。如表1所示，共檢測到19種脂肪酸，飽和脂肪酸533.70 mg/g（占59.97%），單不飽和脂肪酸330.26 mg/g（占37.11%），多不飽和脂肪酸25.97 mg/g（占2.92%），含量高的3種脂肪酸為棕櫚酸（占29.70%）、硬脂酸（占27.48%）、油酸（占35.16%）。本實驗檢測到的飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸總含量與Nizar等[24]分析羊脂肪的結(jié)果類似。本實驗除了亞油酸、亞麻酸外，還檢測到的幾種其他多不飽和脂肪酸（如C22:5）且均含量低，這與Chin等[25]報道的羊脂肪的脂肪酸檢測結(jié)果一致。

表1 羊脂肪的脂肪酸組成Table 1 Fatty acid composition of sheep tallow

2.2 羊脂肪SAFE濃縮物的GC-MS分析

GC-MS檢測結(jié)果如表2所示。共鑒定出58種物質(zhì)，醛類化合物10種、醇類化合物13種、酮類化合物2種、酸類化合物10種、呋喃類化合物4種、吡嗪類化合物5種、含硫化合物8種、其他化合物6種。含量較高的化合物（＞3 μg/kg）有1-己醇、1-辛烯-3-醇、2-己醇、2,3-丁二醇、乙偶姻、乙酸、丙酸、2-甲基丙酸、己酸、二甲基亞砜。本實驗檢測到乙酸含量高，這與Vsata等[9]采用固相微萃取-GC-MS分析羊脂肪揮發(fā)性成分的報道一致。檢測到戊醛、己醛、庚醛、(E)-2-己烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、苯甲醛、苯乙醇、1-辛烯-3-醇、1-庚醇、1-戊醇、1-己醇、乙酸、辛酸、壬酸、2-甲基丁酸和3-甲硫基丙醛等，在已有的羊脂肪揮發(fā)性成分分析報道中均曾檢測到[6-10]。2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪，Buttery等[26]在烤羊脂肪中曾檢測到。

表2 SAFE結(jié)合GC-MS分析羊脂肪揮發(fā)性物質(zhì)的結(jié)果Table 2 Quantitative analysis of volatile compounds in sheep tallow by SAFE combined with GC-MS

續(xù)表2

檢測到的脂肪族的醛（如戊醛）、酮（如8-壬烯-2-酮）、醇（如1-己醇）、酸（如辛酸）、烴（如庚烷），這些均為脂質(zhì)氧化降解成分。其中戊醛、1-戊醇、己醛、1-辛烯-3-醇、丁醛、(E)-2-壬烯醛和2,4-癸二烯醛可來源于亞油酸的氧化降解，己醛、己酸、(E)-2-癸烯醛、壬醇等化合物可來源于油酸的氧化降解，(E,E)-2,4-庚二烯醛可來源于亞麻酸的氧化降解[22,27]。

羊脂肪組織中除了脂質(zhì)，還含有少量的氨基酸、蛋白質(zhì)及糖類，因而還檢測到可來源于美拉德反應(yīng)的化合物，包括含硫化合物如3-甲硫基丙醛、噻吩、4,5-二甲基噻唑等，吡嗪類化合物如2,5-二甲基吡嗪、苯乙醇、2-甲基丁酸和3-甲基丁酸、乙偶姻等。2-甲基丁酸和3-甲基丁酸可由亮氨酸、異亮氨酸的Strecker醛2-甲基丁醛和3-甲基丁醛氧化生成，苯乙醇可由苯丙氨酸的Strecker醛苯乙醛發(fā)生還原反應(yīng)得到[28]。

2.3 羊脂肪SAFE濃縮物的GC-O分析

目前，有關(guān)羊脂肪的揮發(fā)性風味分析報道多數(shù)為GC-MS分析揮發(fā)性成分，而并未采用GC-O進行分析。本實驗GC-O分析檢測到37個氣味活性區(qū)域，基于GC-MS鑒定結(jié)果、嗅聞的RI、氣味特征、標準品比對，鑒定出37個氣味活性化合物，見表3。有的化合物如糠硫醇，因含量低于GC-MS檢測限，未檢測到，但GC-O檢測到，與這些化合物具有較低的氣味閾值有關(guān)。

表3 SAFE結(jié)合AEDA/GC-O分析羊脂肪香氣成分結(jié)果Table 3 Identification of aroma compounds in sheep tallow by SAFE combined with AEDA/GC-O

鑒定出的化合物中包括脂肪醛19種、脂肪醇4種、吡嗪2種、含硫化合物4種、呋喃類化合物3種等。脂肪醛類化合物是GC-O鑒定出最多的化合物，這與Bravo-Lamas等[29]分析烤羊肉的結(jié)果一致。檢測到的脂肪醛類化合物主要提供青香、油脂香，吡嗪類化合物主要提供烤香，含硫化合物主要提供烤肉香，呋喃類化合物主要提供焦糖香。一般認為，在羊肉香氣中，酚類和支鏈脂肪酸對羊肉的膻味有貢獻[13,20]，因此本實驗中檢測到4-乙基苯酚、4-甲基辛酸，應(yīng)提供了羊脂肪的特征香氣（膻味）。早期Rota等[11]采用GC-O分析煮羊肉時4-甲基辛酸和4-乙基辛酸均檢測到。相比之下，4-乙基辛酸的氣味閾值低于4-甲基辛酸，對羊肉的膻氣影響更大。而近年Resconi[30]及Bravo-Lamas[29]等采用GC-O分析烤羊肉，均未檢測到任何支鏈脂肪酸。這很可能與近年人們?yōu)榻档拖M者不喜歡的羊膻氣，在羊的養(yǎng)殖上進行改良有關(guān)[30-31]。

稀釋法嗅聞中，F(xiàn)D值越大表明對總體香氣的貢獻越大。檢測出FD值較大（log2FD≥4）的化合物有(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-辛二烯醛、(E)-2-癸烯醛、(E,Z)-2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、2-庚醇、三甲基吡嗪、4-甲基噻唑、3-甲硫基丙醛、5-甲基-二氫-2(3H)-呋喃酮、4-乙基苯酚。這些化合物對羊脂肪的香氣起主要作用。其中(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛和3-甲硫基丙醛在煮羊肉中GC-O分析也檢測到[11]，并具有較高FD值。Du Wenbin等[20]在烤羊肉中也鑒定出(E,E)-2,4-庚二烯醛、三甲基吡嗪、4-甲基噻唑、3-甲硫基丙醛、4-乙基苯酚，并均具有較大的FD值。Resconi等[30]在烤羊肉中也鑒定出(E,E)-2,4-辛二烯醛、(E)-2-癸烯醛。

3 結(jié) 論

羊脂肪中共檢測到19種脂肪酸，飽和脂肪酸533.70 mg/g（占59.97%），單不飽和脂肪酸330.26 mg/g（占37.11%），多不飽和脂肪酸25.97 mg/g（占2.92%），含量高的為棕櫚酸、硬脂酸、油酸。羊脂肪加熱后經(jīng)過SAFE裝置萃取，GC-MS、AEDA/GC-O分析，GC-MS鑒定出58種化合物，在羊脂肪中嗅聞到37種香氣活性成分，其中FD值大（log2FD≥4）的化合物有(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-辛二烯醛、(E)-2-癸烯醛、(E,Z)-2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、2-庚醇、三甲基吡嗪、4-甲基噻唑、3-甲硫基丙醛、5-甲基-二氫-2(3H)-呋喃酮、4-乙基苯酚，認為是羊脂肪的關(guān)鍵香氣成分。研究結(jié)果可為了解羊脂肪風味構(gòu)成及開發(fā)羊肉類香精提供參考。