基于多元素含量分析結(jié)合化學(xué)計量學(xué)技術(shù)的橄欖油等級鑒別方法

李雪婷，伊雄海*，樊 祥，蔡文瑄，鄧曉軍，郭德華，丁 濤，柳 菡，鈕 冰，曾 靜

（1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；2.上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫中心，上海 200135；3.南京海關(guān)動植物與食品檢測中心，江蘇 南京 210001）

橄欖油是以油橄欖的果實作為原材料，通過物理壓榨法獲得，并且不得摻入其他種類的油[1]。橄欖油含有豐富的不飽和脂肪酸、角鯊烯、多酚、維生素等物質(zhì)，具有抗氧化、調(diào)節(jié)膽固醇、預(yù)防癌癥、美容等功效，享有“液體黃金”的美譽。GB 23347ü2009《橄欖油、油橄欖果渣油》中對規(guī)定橄欖油的種類作出了明確的劃分：初榨橄欖油、精煉橄欖油、混合橄欖油。初榨橄欖油又分為特級初榨橄欖油、中級初榨橄欖油和初榨油橄欖油[2]。特級初榨橄欖油是采用機械冷壓榨的方式直接從油橄欖的果實榨取的油脂，不需要添加任何化學(xué)試劑或采用任何化學(xué)手段，只需離心過濾除去雜質(zhì)即可。精煉橄欖油是油橄欖果渣油或初榨橄欖油經(jīng)過精煉工藝制成的無香、無色、無味的可以食用的油，精煉過程破壞了橄欖油的口感和基本的多酚抗氧化物，營養(yǎng)價值和口感與特級初榨橄欖油也相差甚遠。特級初榨橄欖油因其營養(yǎng)價值高、生產(chǎn)率相對較低，消費旺盛，一直被認(rèn)為是一種高經(jīng)濟價值的食用油，市面上的特級初榨橄欖油摻假、以次充好、產(chǎn)地冒用等違法行為屢禁不止，據(jù)相關(guān)機構(gòu)統(tǒng)計數(shù)據(jù)，全球橄欖油年產(chǎn)量只有300萬 t，其中僅25%為特級初榨橄欖油，而橄欖油的銷量數(shù)據(jù)顯示，全球橄欖油交易量65%為特級初榨橄欖油，由此可見，其產(chǎn)量遠不能滿足市場需求[3-4]。為了保護消費者的相關(guān)利益，除了制定與實施各種標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)以外，開發(fā)有效的橄欖油摻偽檢測及等級鑒別手段，一直以來都是國內(nèi)外學(xué)術(shù)界的研究熱點[5]。

目前橄欖油摻偽鑒別主要以甾醇、脂肪酸、揮發(fā)性物質(zhì)、蠟含量為目標(biāo)物進行檢測[6-10]。Yang Yang等[7]采用氣相色譜-質(zhì)譜法通過測定食用油中脂肪酸含量，成功鑒別出摻有4種植物油的特級初榨橄欖油。由于不同等級的橄欖油組成相似，且不法商販會在精煉橄欖油里添加目標(biāo)檢測物，所以上述目標(biāo)物往往無法滿足對橄欖油等級的準(zhǔn)確鑒定，常被用來鑒別橄欖油中加入其他植物油的摻偽。因此，需要一種更有效、可量化的鑒定方法用于鑒別橄欖油等級，為橄欖油市場提供保障。元素的定量測定已被廣泛用于鑒別有機食品和食品的地理來源，它們具有豐富的營養(yǎng)[11]、安全性[12]和質(zhì)量影響[13]。Benincasa等[14]通過電感耦合等離子體質(zhì)譜法對意大利不同地區(qū)的初榨橄欖油進行多元素分析，研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)檢測的元素在不同地區(qū)樣品中顯示出明顯的差異，并結(jié)合適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計分析實現(xiàn)了良好區(qū)分。Wu Hao等[15]采用同位素和多元素含量分析對我國進口紅酒進行產(chǎn)地判別，建立了一種可靠的紅酒產(chǎn)地溯源方法。已有先前研究采用化學(xué)計量學(xué)在食品產(chǎn)地溯源[16-21]、品質(zhì)鑒別[22-23]、摻假鑒別[24-25]等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。利用主成分分析（principal component analysis，PCA）、層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）及正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）等化學(xué)計量學(xué)方法建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫和鑒別模型，成為橄欖油摻偽鑒別技術(shù)研究的主攻方向[26-31]。

目前鮮有報道基于多元素含量分析結(jié)合化學(xué)計量學(xué)技術(shù)對橄欖油等級進行鑒別。因此，本實驗提出了一種采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（inductively coupled plasma optical emission spectroscopy，ICP-OES）儀、電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）儀定量分析橄欖油中53種元素，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)的方法對特級初榨橄欖油和精煉橄欖油進行鑒別，并找出兩種等級橄欖油間具有顯著差異的特征性元素，旨在為橄欖油摻偽及等級鑒別提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

已確認(rèn)屬性的樣品共34種，包括18種特級初榨橄欖油和16種精煉橄欖油，均收集于進口及國內(nèi)外各橄欖油企業(yè)，經(jīng)相關(guān)機構(gòu)認(rèn)定及實驗證明其真實屬性，樣品編號及真實屬性等信息見表1；98種未知屬性的橄欖油樣品作為測試集。

表1 實驗樣品信息Table 1 Information of olive oil samples used in this study

Ir、Pt、Au、Ag、V、Co、Te、Rb、Ru、Cs、As單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為1 000 mg/L，由美國o2si公司提供；Na、Li、Al、Ti、Sn、Mo、Se、Sr、Mn、Cu、Cd、Ca、K、P、Mg、Sb、Fe、Ni、Hg、Pb、Zn、Ba、Cr、Rh、Tl單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液以及Sc、Y、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yd、Ln這17種稀土多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為1 000 mg/L，內(nèi)標(biāo)元素貯備液（1 000 mg/L）Sc、In、Rh、Bi，均由國家有色金屬和電子材料分析測試中心提供。

硝酸（優(yōu)級純）；氬氣（≥99.995%）；氦氣（≥99.995%）。

1.2 儀器與設(shè)備

7900 ICP-MS儀、5100 ICP-OES儀 美國Agilent公司；XPE26C電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；TOPEX微波消解儀 上海屹堯儀器公司；Million-Q Integral型超純水系統(tǒng) 德國默克公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取約0.5 g（精確至0.001 g）樣品于微波管中，加入5 mL硝酸進行消解，120 ℃消化5 min，150 ℃消化10 min，190 ℃消化20 min。然后取出消化物，冷卻至室溫，消解之后的樣品轉(zhuǎn)移至25 mL或50 mL離心管中，用適量超純水洗滌消解罐3次，洗滌液倒入離心管中，用水稀釋至刻度，混勻，即為待測試樣。每組樣品平行測定3次，同時作試劑空白溶液。

1.3.2 測定條件

Na、K、Mn、P、Zn、Ca、Fe、Mg含量通過ICP-OES測定，其余元素通過ICP-MS測定，按照GB 5009.268ü2016《食品中多元素的測定》中規(guī)定的方法進行分析。

ICP-MS條件：功率1 500 W；載氣流量0.8 L /min；等離子體氣流量15 L/min；輔助氣流量0.40 L/min；氦氣流量4～5 mL/min；霧化室溫度2 ℃；樣品提升速率0.3 r/s；采樣深度8～10 mm。

ICP-OES條件：功率1 150 W；等離子氣流量15 L/min；輔助氣流量0.5 L/min；霧化氣流量0.65 L/min；泵速50 r/min。

1.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理及化學(xué)計量學(xué)分析

采用SPSS 24.0軟件對測得的數(shù)據(jù)進行預(yù)處理、獨立樣本t檢驗以及箱型圖的繪制。數(shù)據(jù)預(yù)處理方式包括：1）檢出限的一半替換空值；2）檢出限的一半替換空值后取log2值；3）檢出限的一半替換空值后，進行Z-score化處理。數(shù)據(jù)進行預(yù)處理后導(dǎo)入到Metaboanalyst軟件中進行PCA、OPLS-DA和HCA。用SIMCA14.0軟件進行置換檢驗及外部驗證驗證模型的可靠性。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入OmicShare軟件進行差異倍數(shù)的計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種等級橄欖油的多元素含量測定結(jié)果

本研究測定了特級初榨橄欖油和精煉橄欖油樣品中53種元素含量，結(jié)果表明，其中31種元素含量低于方法檢出限，其余22種元素在兩種等級橄欖油中經(jīng)過統(tǒng)計的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差如表2所示，數(shù)據(jù)顯示，Cu、Fe在特級初榨橄欖油和精煉橄欖油中含量的平均值分別為51.389 μg/100 g、0.636 mg/100 g和197.075 μg/100 g、1.604 mg/100 g，據(jù)相關(guān)文獻報道，可能是由于精煉過程而導(dǎo)致這兩類金屬含量的升高[32]；Sc和La在特級初榨橄欖油中含量的平均值為0.593 mg/kg、6.780 μg/kg，顯著高于精煉橄欖油中含量的平均值0.370 mg/kg、4.360 μg/kg，有文獻研究發(fā)現(xiàn)，稀土元素在橄欖油中的含量與生產(chǎn)過程有關(guān)，同時據(jù)報道，稀土元素還與土壤中的原始分布及橄欖樹的代謝有關(guān)[33]。因此，這兩種元素還需后續(xù)進一步考察，在本研究中作為參考指標(biāo)結(jié)合其他元素進行綜合判定。

表2 22種元素在兩種等級橄欖油中的含量（±s）Table 2 Concentrations of 22 elements in two grades of olive oil (x ± s)

表2 22種元素在兩種等級橄欖油中的含量（±s）Table 2 Concentrations of 22 elements in two grades of olive oil (x ± s)

元素 含量特級初榨橄欖油 精煉橄欖油V/（mg/kg） 0.003f0.001 0.004f0.001 Co/（mg/kg） 0.002f0.001 0.002f0.002 Ag/（mg/kg） 0.273f0.272 0.102f0.130 Ca/（mg/100 g） 13.036f9.986 12.850f11.070 Cu/（μg/100 g） 51.389f30.331 197.075f45.237 Fe/（mg/100 g） 0.636f0.231 1.604f0.260 K/（mg/100 g） 7.018f1.335 7.821f1.705 Mg/（mg/100 g） 7.403f1.428 7.346f0.881 Mn/（μg/100 g） 35.917f32.140 66.988f66.765 Na/（mg/100 g） 1.629f0.697 1.597f0.707 Zn/（mg/100 g） 0.753f0.244 0.340f0.021 Ti/（mg/kg） 0.013f0.009 0.013f0.006 Ni/（mg/kg） 0.324f0.840 0.288f0.416 Sr/（mg/kg） 0.116f0.082 0.089f0.044 Al/（mg/100 g） 6.280f2.833 22.812f3.233 Li/（mg/kg） 0.180f0.173 0.331f0.216 Ba/（mg/kg） 0.180f0.162 0.490f0.204 Sc/（mg/kg） 0.593f0.040 0.370f0.057 Y/（μg/kg） 1.170f0.830 1.500f1.670 La/（μg/kg） 6.780f0.808 4.360f1.027 Ce/（μg/kg） 5.508f6.700 3.447f4.315 Dy/（μg/kg） 0.312f0.272 0.408f0.399

2.2 兩種等級橄欖油鑒別的化學(xué)計量學(xué)分析

2.2.1 PCA

PCA通過對錯綜復(fù)雜的數(shù)據(jù)進行降維，篩選能重現(xiàn)的數(shù)據(jù)信息，并以幾個PC的形式對原始數(shù)據(jù)進行可視化，可以集中典型地表征原變量的數(shù)據(jù)特征，從而充分反映總體信息[34-35]。為觀察樣品的聚類情況及是否存在離群點，對18種特級初榨橄欖油及16種精煉橄欖油中檢測到的22種元素進行PCA，圖1A～C為采用不同數(shù)據(jù)預(yù)處理方法得到的22種元素鑒別兩種等級橄欖油的PCA得分圖，結(jié)果表明，在3種數(shù)據(jù)預(yù)處理方式中，檢出限的一半替換空值，Z-score化處理得到的PCA得分圖可以對兩種等級橄欖油明顯區(qū)分。因此，此數(shù)據(jù)預(yù)處理方法是最有效的一種。圖1D反映了引起兩種等級橄欖油差異的關(guān)鍵變量，其中，Al、Fe、Cu、V、Ba在載荷圖的位置與精煉橄欖油在得分圖的位置相似，說明與其呈正相關(guān)；同理，Sc、Zn、La與特級初榨橄欖油呈正相關(guān)。這與表2結(jié)果一致。

圖1 2種橄欖油等級鑒別的PCA得分圖及載荷圖Fig.1 PCA score and loading plots for grade identification of two grades of olive oil

2.2.2 HCA

如圖2所示，基于22種元素通過HCA，樣品清晰地分為兩組，并且都被正確分類。上述研究結(jié)果表明，可以通過HCA成功區(qū)分特級初榨橄欖油和精煉橄欖油。

圖2 基于22種元素對兩種等級橄欖油鑒別的HCA熱圖Fig.2 Heat map obtained by cluster analysis of two grades of olive oil based on 22 elements

2.2.3 OPLS-DA

為在兩種等級橄欖油間獲得更好的分類，建立了OPLS-DA模型，R2X代表建模時，在X軸方向模型的解釋率（即在X軸方向保留原始數(shù)據(jù)信息百分比的平方）；R2Y代表建模時，在Y軸方向模型的解釋率；Q2代表模型的可預(yù)測能力，通過交叉驗證得到，Q2大于0.5，說明該模型預(yù)測能力良好[29]。理論上，R2、Q2數(shù)值越接近于1說明模型的預(yù)測能力及擬合準(zhǔn)確度越高。兩種等級橄欖油鑒別的OPLS-DA模型如圖3A所示，此模型可以對特級初榨橄欖油及精煉橄欖油進行明顯區(qū)分，樣品組內(nèi)可得到較好的聚類分離效果。OPLS-DA 模型數(shù)值為R2X=0.545，R2Y=0.959，Q2=0.9，表明模型的解釋及預(yù)測能力良好，兩種等級橄欖油可進行有效鑒別。此外，進行外部驗證以進一步評估基于測試樣品驗證模型的準(zhǔn)確性，測試樣品包括98個未知屬性的橄欖油樣品，結(jié)果顯示只有個別測試樣品被錯誤分類，94個樣品分類和原有標(biāo)識一樣，準(zhǔn)確率高達96%，說明建立的OPLS-DA模型可靠。OPLS-DA模型產(chǎn)生的載荷圖可用于篩選對兩組樣本組間分類有貢獻的變量，離原點越遠的點則對分類越有貢獻，如圖3B所示，Sc、La、Zn、Al、Fe、Cu對模型的貢獻較大。

圖3 兩種等級橄欖油鑒別的OPLS-DA模型（A）及載荷圖（B）Fig.3 OPLS-DA model (A) and loading plot (B) for the identification of two grades of olive oil

OPLS-DA作為有監(jiān)督的模式判別模型，具有一定的數(shù)據(jù)過擬合風(fēng)險，因此，需要對建立的模型進行置換檢驗。置換檢驗是將樣品的分組標(biāo)記隨機打亂，對樣品進行順序置換，從而重新進行建模和預(yù)測的過程，一般置換檢驗次數(shù)設(shè)置為200次。作為一個可靠的有監(jiān)督模型，Q2回歸線在y軸上的截距要小于0。置換檢驗結(jié)果如圖4所示，R2回歸線在y軸上的截距為0.339；Q2回歸線在y軸上的截距為-0.413，明顯小于0，這也表明所建立的OPLS-DA模型可靠。

圖4 OPLS-DA模型的200次置換檢驗Fig.4 Validation of OPLS-DA model by 200 permutation tests

2.3 特征性元素的確定

圖5表示OPLS-DA模型得到的變量權(quán)重重要性排序（variable importance for the projection，VIP），VIP是指貢獻變量影響的所有模型維度上的總和。通常認(rèn)為VIP≥1的變量是模型的重要變量。VIP值越大，說明該變量在判別過程中貢獻越大，在兩組樣品間的差異越顯著，從圖5可以看出，有8種元素VIP≥1，可作為區(qū)分特級初榨橄欖油和精煉橄欖油的重要變量。通過SPSS 24.0軟件對預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進行t檢驗，P＜0.05表示具有顯著差異。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入OmicShare軟件進行差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）的計算，F(xiàn)C即某個代謝物在兩組間表達量的差異倍數(shù)。最終以VIP≥1、FC＞2和P＜0.05為條件進行兩種等級橄欖油的特征性元素篩選，結(jié)果如表3所示，Al、Fe、Cu、Ba、V、Sc、La、Zn在特級初榨橄欖油和精煉橄欖油的等級鑒別中起著重要作用，得到的8種特征性元素在兩種等級橄欖油中相對含量差異的箱型圖如圖6所示。

圖5 OPLS-DA模型的VIP值Fig.5 VIP values of OPLS-DA model

表3 區(qū)別兩種等級橄欖油的特征性元素Table 3 Characteristic elements to distinguish two grades of olive oil

圖6 8種元素在兩種等級橄欖油中的箱型圖Fig.6 Box plots of eight elements in two grades of olive oil

3 結(jié) 論

采用ICP-MS和ICP-OES的方法基于多元素含量分析結(jié)合化學(xué)計量學(xué)技術(shù)成功區(qū)分了特級初榨橄欖油和精煉橄欖油。與特級初榨橄欖油相比，F(xiàn)e、Cu在精煉橄欖油中的含量顯著增多，這可能是因為橄欖油的精煉過程導(dǎo)致；而Sc、La在精煉橄欖油中含量顯著降低，由于稀土元素的含量受品種、土壤等環(huán)境的影響，所以精煉過程對稀土元素的影響還有待后續(xù)進一步考察。預(yù)處理方式中，檢出限的一半替換空值，Z-score化處理所得到的PCA得分圖效果最佳。進一步對兩種等級橄欖油進行了聚類分析，聚類效果明顯，且兩種等級橄欖油都被正確分類。所建立的OPLS-DA模型聚類區(qū)分度良好，具有良好的解釋及預(yù)測能力，可對兩種等級橄欖油進行有效鑒別。根據(jù)VIP值、FC和P值，篩選出Al、Fe、Cu、Ba、V、Sc、La、Zn為區(qū)分兩種等級橄欖油的特征性元素。結(jié)果證明，基于多元素含量分析結(jié)合化學(xué)計量學(xué)技術(shù)可以作為鑒別兩種等級橄欖油有效手段，為橄欖油真實性鑒別提供了堅實理論和科學(xué)依據(jù)。