UPLC-MS/MS同時測定經典名方澤瀉湯中6個成分的含量

譚麗盈，胡國輝

廣州中醫(yī)藥大學 第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510400

澤瀉湯為中藥經典名方，出自東漢張仲景《金匱要略》，在2018年國家中醫(yī)藥管理局公布的《古代經典名方目錄（第一批）》100 首中，其具有療效確切、應用廣泛的特點。澤瀉湯原方記載：“澤瀉五兩，白術二兩，右二味，以水二生，煮取一升，分溫再服”，具有利水除飲、調補脾腎的功效[1-2]。方中澤瀉為君藥，白術為臣藥，兩者相須使用，共同發(fā)揮功效。目前，相關文獻報道澤瀉的主要成分為三萜類和倍半萜類，三萜類成分澤瀉醇A、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉B是其主要的活性成分[3-5]。藥理研究表明，澤瀉的主要成分均具有降血壓、調血脂、降血糖、利尿、抗炎的作用[2,6]。白術中的主要化學成分為白術內酯類、揮發(fā)類成分、苷類及多糖類成分[7]，白術中特有的活性成分主要是白術內酯類，其中白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ是白術中含量較高的成分，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、健補脾腎和調節(jié)胃腸道的作用[8-10]。目前，對澤瀉湯的研究多為臨床應用方法的報道[10-11]，質量控制方面的報道主要有高效液相色譜法（HPLC）測定澤瀉湯中3 種或多種成分和澤瀉湯的指紋圖譜研究等[12-14]，未有其他質量控制手段的報道。質量控制僅通過對幾個成分進行考察，缺少對全方的整體把握，超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜法（UPLC-MS/MS）是目前常用于中藥復方中多成分含量測定的一種方法，具有靈敏度高、專屬性強的優(yōu)點。因此，本實驗參考文獻[15-16]，從澤瀉和白術2味中藥整體出發(fā)，建立UPLC-MS/MS同時測定澤瀉湯中澤瀉醇A、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ含量的方法，為中藥經典名方澤瀉湯的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY H-class 型超高效液相色譜儀、Xevo TQD 型三重四極桿質譜儀（美國Waters 公司）；QSM 型四元洗脫泵、FTN 型全自動進樣器、BT124S 型電子天平（德國賽多利斯公司）；KG-300DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Research plus型手動移液器（德國Eppendorf公司）。

1.2 試藥

對照品澤瀉醇A（批號：Must-19080105，純度：99.49%）、澤瀉醇B（批號：Must-19070305，純度：99.38%）、白術內酯Ⅰ（批號：111975-201501，純度：99.9%）、白術內酯Ⅱ（批號：111976-201501，純度：99.9%）、白術內酯Ⅲ（批號：111978-201501，純度：99.9%）、23-乙酰澤瀉醇B（批號：111846-202006，純度：98.3%）均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

澤瀉分別來源于福建（批號分別為190801、200502）、四川（批號：200901）；白術分別來源于安徽（批號：191203）、江西（批號：200101）和河北（批號：200702），經廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院梁文能副主任藥師鑒定分別為澤瀉科澤瀉屬植物澤瀉Alisma plantago-aquaticaLinn.的干燥塊莖厚片、菊科蒼術屬植物白術Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖厚片，性狀符合《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版標準。

采用隨機組方的方法，將澤瀉和白術進行組方，澤瀉湯（實驗室自制）批號分別為210501、210502、210503、210504、210505（表1）。

表1 澤瀉湯及處方藥材信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Agilent SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～3 min，28%A；3～5 min，28%～55%A；5～12 min，55%～75%A）；體積流量為0.3 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進樣量為1 μL。

2.2 質譜條件

Waters Xevo TQD三重四極桿質譜儀，電噴霧離子源（ESI），正離子采集模式，采集方式為多反應監(jiān)測（MRM），毛細管電壓為3.0 kV，錐孔電壓為40 V，脫溶劑氣流速為400 L·h-1，脫溶劑氣溫度為800 ℃，空氣為加熱氣，氬氣為碰撞氣，6個成分的質譜參數見表2。在上述色譜質譜條件下測定，對照品和供試品的色譜圖見圖1。

表2 澤瀉湯中6個成分的質譜參數

圖1 混合對照品和澤瀉湯的MRM色譜圖

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取白術內酯Ⅰ3.22 mg、白術內酯Ⅱ3.57 mg 和白術內酯Ⅲ4.06 mg 置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，作為對照品儲備溶液Ⅰ；精密稱取澤瀉醇A 4.12 mg、澤瀉醇B 8.08 mg、23-乙酰澤瀉醇B 7.36 mg置20 mL量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，作為對照品儲備溶液Ⅱ；分別精密吸取對照品儲備溶液Ⅰ1 mL和對照品儲備溶液Ⅱ2 mL置同一10 mL量瓶中，作為對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

取澤瀉80 g、白術32 g，加10倍量水，浸泡30 min，然后采用傳統(tǒng)砂鍋進行煎煮，煎煮1 h，濾過，濾液備用，然后加8倍量水，繼續(xù)煎煮1 h，濾過，合并2次濾液，濃縮至100 mL，作為澤瀉湯液，置冰箱中冷藏保存，精密吸取上述湯液1 g置10 mL量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm 的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.5 方法學考察

2.5.1線性關系的考察 精密吸取2.3 項下混合對照品溶液1 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對照品溶液，分別精密吸取20、100、200、500 μL 和1 mL 分別置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，分別作為對照品1～5 號線性系列溶液，然后按照2.1、2.2 項下的色譜、質譜條件進行測定，以峰面積為縱坐標（Y），以進樣量的質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，結果見表3。

表3 澤瀉湯6個成分的線性關系

2.5.2精密度試驗 取2.3 項下對照品溶液，在2.1、2.2 項下色譜、質譜條件下，連續(xù)進樣6 次，進行測定，結果澤瀉醇A、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ和白術內酯Ⅲ峰面積的RSD 分別為2.15%、2.87%、1.66%、1.09%、3.08%和3.36%，結果表明儀器的精密度良好。

2.5.3重復性試驗 取上述澤瀉湯溶液，分別精密吸取1 mL 置10 mL 量瓶中，共制備6 份樣品，按2.4 項下的方法制備供試品溶液，按2.1、2.2 項下色譜、質譜條件進行測定，采用外標法計算，結果澤瀉湯中澤瀉醇A、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ和白術內酯Ⅲ含量的RSD分別為0.69%、1.08%、1.97%、1.55%、2.32%和0.98%，結果表明該方法重復性良好。

2.5.4穩(wěn)定性試驗 取2.4 項下供試品溶液，分別在0、1、2、4、8、12、16、24 h測定，記錄各色譜峰面積，結果澤瀉醇A、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ和白術內酯Ⅲ的峰面積的RSD 分別為3.52%、3.98%、2.77%、3.07%、2.66%和4.03%，結果表明該供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.5.5加樣回收率試驗 精密稱取澤瀉醇A 3.82 mg置5 mL 量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，作為澤瀉醇A對照儲備溶液，精密稱取澤瀉醇B 3.92 mg、23-乙酰澤瀉醇B 2.56 mg置同一10 mL量瓶中，精密吸取上述澤瀉醇A 對照儲備溶液1 mL，2.3 項下的白術內酯混合儲備溶液1 mL，置上述10 mL 量瓶中，作為待加混合對照品溶液，精密吸取2.4 項下的澤瀉湯0.5 g 置10 mL 量瓶中，共6 份，分別向上述6份樣品的量瓶中各精密加入上述待加混合對照品溶液1 mL，加甲醇溶解稀釋至刻度，作為供試品溶液，按照2.1、2.2 項下色譜、質譜條件進行測定，結果見表4。

表4 澤瀉湯6個成分加樣回收率試驗結果

2.5.6樣品含量測定 取自制的5 個不同批號的澤瀉湯，然后分別按照2.4 項下方法制備，按照2.1、2.2項下色譜、質譜條件進行測定，外標法計算5批樣品中澤瀉醇A、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ和白術內酯Ⅲ的含量，結果見表5。

表5 澤瀉湯中6個成分含量測定結果

3 結果與討論

3.1 指標成分的選擇

澤瀉醇A、澤瀉醇B 和23-乙酰澤瀉醇B 是澤瀉發(fā)揮藥效的主要活性成分，具有降血糖、調血脂和降血壓的作用；白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ和白術內酯Ⅲ是白術藥材質量控制的關鍵指標，具有抗炎、利尿和降血壓的藥理作用，白術在《中國藥典》2020 年版中無含量測定指標成分，故通過測得3 個白術內酯的含量對其進行質量控制。本研究在測定中發(fā)現，澤瀉湯在煎煮過程中23-乙酰澤瀉醇B 不穩(wěn)定，會發(fā)生氧環(huán)開裂并重排，生成24-乙酰澤瀉醇A，進而脫乙?；D換為澤瀉醇A 和澤瀉醇B，因此，對于澤瀉的質量控制建議控制3 個成分之和，白術內酯的3 個成分含量較低，尤其白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅲ不穩(wěn)定，易發(fā)生分子脫水生成白術內酯Ⅱ，白術內酯Ⅲ和白術內酯Ⅰ可以發(fā)生分子間脫水生成雙白術內酯，因此，對于白術質量的控制也應該控制3 個白術內酯之和，比單一控制某個成分更具有實際意義。

3.2 色譜、質譜條件的選擇

本研究首先對甲醇和乙腈分別與0.1%甲酸水溶液作為流動相進行考察，結果發(fā)現以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相時，白術內酯的3 個成分色譜峰形不好，響應較低，當以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相時，澤瀉湯中6 個成分的色譜峰均可較好分離，響應值較高。然后對6 個成分分別在正、負離子模式下進行掃描，結果發(fā)現，正離子模式下所有成分的響應優(yōu)于負離子，因此，在正離子模式下分別對6 個成分的錐孔電壓、毛細管電壓、碰撞能量和碰撞電壓等質譜參數進行優(yōu)化，選擇強度最高、穩(wěn)定性和重復性較好的離子作為定量離子進行定量分析，最終確定本實驗的質譜采集條件。

3.3 結果的分析

本實驗對經典名方澤瀉湯中6個主要成分進行測定，將其作為質量控制方法，5批樣品中澤瀉醇A、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ和白術內酯Ⅲ的平均質量濃度分別為158.66、754.17、557.11、24.71、32.91、20.12 μg·mL-1，質量分數為148.32～170.06、689.79～810.66、488.13～628.35、12.58～20.33、29.67～36.18、17.51～24.34 μg·g-1，含量波動均在平均值的70%～130%，符合《古代經典名方中藥復方制劑物質基準的申報資料要求（征求意見稿）》的要求。本實驗由于所制樣品批數較少，藥材的產地信息偏少，只是對2 個不同產地的澤瀉和3 個不同產地的白術進行隨機組方，制備澤瀉湯，具有一定的局限性。從結果可以看出，不同產地澤瀉與不同產地的白術組合時，澤瀉湯中6 個成分的含量存在一定的差異，因此，在澤瀉湯的組方中可以考慮藥材的產地信息，同時結合臨床藥效結果，優(yōu)選澤瀉湯的最佳產地組方，從而保證澤瀉湯的質量和臨床療效。

4 結語

本實驗建立了UPLC-MS/MS 同時測定經典名方澤瀉湯中澤瀉醇A、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ和白術內酯Ⅲ含量的方法，通過同時測定多種成分來控制處方中澤瀉和白術藥材的質量，并對測定結果進行分析評價，且UPLCMS/MS 具有分析速度快、靈敏度高、專屬性強的優(yōu)點，更適合于中藥經典名方的開發(fā)及復方制劑中多成分的含量測定，但是對于澤瀉湯物質基礎中活性成分的研究仍然需要借助超高效液相色譜串聯(lián)飛行時間質譜進行深入分析，從而闡明更多澤瀉湯的物質基礎，在發(fā)現確定活性化學成分的基礎上建立質量控制標準，保證澤瀉湯的療效，從而更好地為經典名方澤瀉湯及其相關制劑的后續(xù)開發(fā)提供參考。