范曉玉,王亞丹,邵平,韓凌,呂重寧*,路金才*
1.沈陽藥科大學 中藥學院,遼寧 沈陽 110016;2.國家中成藥工程技術(shù)研究中心,遼寧 本溪 117004
延胡索藥材為罌粟科(Papaveraceae)植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥根莖,其味辛、苦,性溫,具有活血、行氣、止痛的功效,用于胸脅、脘腹疼痛等證[1-2]。研究表明,延胡索通過其主要活性成分生物堿(如原阿片堿、延胡索乙素等)發(fā)揮鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等作用,臨床上應用廣泛[3-5]。
延胡索與余零子、水半夏、夏天無、齒瓣延胡索等多種藥材外形極為相似,很容易混淆[6]。以傳統(tǒng)鑒別方法區(qū)分延胡索與其混偽品有一定難度,因此,建立一種快速有效的延胡索鑒別方法對其臨床用藥安全至關(guān)重要。DNA 分子鑒定技術(shù)是利用基因組中一段公認標準的、相對較短的DNA 片段來進行物種鑒定的分子診斷技術(shù)[7]。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)最早被應用于系統(tǒng)發(fā)育和物種的分類研究,在藥用植物及其混偽品的鑒別中具有顯著的優(yōu)勢[8-9]。已有研究將DNA 條形碼技術(shù)用于延胡索及其混偽品的鑒別,許燦新[10]對延胡索及其同屬的4種混偽品進行鑒別,以藥材新鮮塊莖為研究對象,對比了ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK4 個條形碼的鑒別能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITS2 序列可以較好完成延胡索及其混偽品的鑒別;王丹依等[11]也利用ITS2 序列成功鑒別了紫堇屬包括延胡索在內(nèi)的6種植物。
現(xiàn)有研究均以延胡索的植物葉片或者新鮮塊莖為對象,而市售延胡索飲片都是經(jīng)過高溫蒸煮、醋炙或醋煮等的炮制加工品,其DNA 降解嚴重,聚合酶鏈式反應(PCR)擴增困難,鑒別難度較大[12]。因此,本研究以延胡索加工品為研究對象,在文獻研究的基礎上,采用改良后的試劑盒法提取樣品DNA,選取ITS2 條形碼對市售延胡索進行真?zhèn)舞b別,以評價ITS2序列對延胡索加工品的鑒別能力。
60 份市售延胡索飲片來自安徽中藥材市場或延胡索的主要產(chǎn)地浙江、陜西,樣品經(jīng)沈陽藥科大學中藥學院路金才教授鑒定均為延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥根莖,具體信息見表1。同時,從GenBank 的Nucleotide 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)下載23 份延胡索及其混偽品序列信息,見表2。
表1 市售延胡索樣品信息
表2 從GenBank數(shù)據(jù)庫下載的延胡索及其混偽品序列信息
離心柱型植物基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司];ITS2 擴增引物、DNAMarker-D[生工生物工程(上海)股份有限公司];EB 終結(jié)者Green 凝膠核酸染料(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);2×TaqPCR Mix酶(TaKaRa公司)。
MM400型混合球磨儀(Resch公司);Centrifuge 5810/5810 R 型高速離心機(Eppendorf 公司);MXRL-E 標準型旋轉(zhuǎn)混勻儀[大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司];Veriti?型梯度PCR 儀(Life Technoligies公司);DYY-6C 型電泳儀(北京市六一儀器廠);TOCAN-360 型全自動凝膠成像系統(tǒng)(上海領成生物科技有限公司)。
取75%乙醇擦洗過的干凈飲片70 mg,平均放入2 個滅菌后的2 mL 離心管中,加入滅菌鋼珠,磨碎后采用植物基因組DNA 提取試劑盒提取樣品DNA,方法參照說明書。由于藥材經(jīng)過高溫炮制后DNA 降解嚴重,難以擴增出目的片段。為獲得高質(zhì)量的DNA,本實驗對試劑盒法提取DNA 進行改良,除將樣品質(zhì)量增加至70 mg 外,在加入提取液之前加入核分離液,以除去蛋白質(zhì)及酚類物質(zhì),加速細胞膜的裂解。同時適當增加水浴時間(56 ℃,過夜),使細胞充分裂解。PCR 反應體系為25 μL,包括2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL,上游引物ITS2F(5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′)和下游引物ITS3R(5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′)[13]各1 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 8.5 μL。PCR擴增程序為94 ℃,5 min;94 ℃、30 s,56 ℃、30 s,72 ℃、45 s,40 個循環(huán);72 ℃,10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產(chǎn)物,將具有單一明亮目的條帶的產(chǎn)物送往美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行雙向測序。
應用CodonCode Aligner 軟件對測序峰圖進行拼接、校對,去除引物及低質(zhì)量區(qū)?;陔[馬爾可夫模型的HMMer注釋方法,去除兩端5.8S和28S區(qū)段后獲得ITS2 間隔區(qū)序列。對所得序列進行美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站的BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)相似性捜索,找出最相似序列進行物種鑒別。利用MEGA 7.0軟件進行序列多重比對,查找變異位點,計算鳥嘌呤+胞嘧啶(G+C)占比,比對后的序列基于Kimura 2-parameter(K2P)模型構(gòu)建鄰接(neighbor-joining,NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹,同時NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的置信度用靴帶法做1000次可信度分析。
市售延胡索飲片共60份利用ITS2引物進行PCR擴增,采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產(chǎn)物,結(jié)果顯示約80%(47 份)的樣品能夠擴增出明顯單一、完整的條帶(部分凝膠電泳結(jié)果見圖1)。其中擴增失敗的13 份樣品可能與其炮制加工方法有關(guān),《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020 年版中規(guī)定延胡索的加工過程為“置沸水中煮至恰無白心時,取出,曬干”[2],藥材經(jīng)高溫處理后往往會導致DNA嚴重降解,難以擴增出目的片段。
圖1 市售延胡索樣品ITS2序列電泳圖(1~14號樣品)
將注釋得到的47 條ITS2 序列在中藥材DNA 條形碼鑒別系統(tǒng)(http://www.tcmbarcode.cn/china/)和GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行相似性搜索,完成結(jié)果鑒定。以主要單倍型C1(YH8)為例,鑒定結(jié)果顯示(圖2),數(shù)據(jù)庫中與之最匹配的物種為C.yanhusuo,序列描述顯示鑒別覆蓋率為99%,使用MEGA 6.0軟件將其與參考序列KX896711 進行比對分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)219位A-G變異,延胡索主要單倍型219位為A,數(shù)據(jù)庫中單倍型219 位為G。該結(jié)果表明,ITS2序列能夠準確鑒定市售延胡索飲片。本次實驗所得序列完全符合要求,全部鑒定為正品延胡索。
圖2 市售延胡索樣品ITS2單倍型C1(YH8)序列與參考序列比對結(jié)果
共得到延胡索加工品的ITS2序列47條,長度為238~242 bp,比對后長度為242 bp,C+G 平均占比為70.51%,種內(nèi)變異較多,主要分布在序列的前半段,共存在17 個變異位點,分別為36、39、42、73位點C-G 變異,44、57 位點G-C 變異,46、70 位點A-G 變異,49 位點T-A 變異,52、55 位點T-A/G 變異,54、197 位點G-A 變異,74 位點T-C 變異。48、58、65 位點為簡并堿基。有2 處插入/缺失,分別為35-36、67-68 位點。利用MEGA 6.0 軟件進行比對分析,歸納為5 種主要的單倍型(C1~C5),并提交至GenBanK 數(shù)據(jù)庫,登錄號為MH260614-18,序列信息見圖3。
圖3 市售延胡索樣品ITS2序列主要單倍型(C1~C5)信息
實驗中獲得的延胡索ITS2 序列種內(nèi)變異較大,為進一步確認實驗結(jié)果的準確性,基于K2P 模型構(gòu)建了延胡索的5 個單倍型與從GenBank 數(shù)據(jù)庫下載的23條ITS2序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖4所示,實驗獲得的延胡索5 個主要單倍型與數(shù)據(jù)庫下載的延胡索的14 個ITS2 序列單聚為一大支,支持率為95%,而且不同種都能各聚為小枝,能較好地區(qū)分;東北延胡索單獨聚為一支,支持率為82%,此外,齒瓣延胡索與夏天無聚為一支,支持率為62%,與延胡索和東北延胡索分處不同的分支。NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹表明,延胡索ITS2 序列和參考序列緊密聚合在一起,具有良好的單系性,能夠明顯區(qū)分其混偽品。
圖4 延胡索及其混偽品的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹
延胡索具有悠久的用藥歷史,臨床應用廣泛,由于地方用藥習慣及藥材價格的升高,市場上出現(xiàn)了以次充好、摻假等情況,《中國藥典》2020 年版僅以延胡索乙素作為單一的檢測指標,但目前延胡索的主要混偽品齒瓣延胡索、東北延胡索和夏天無也含有延胡索乙素,且東北延胡索和齒瓣延胡索均有一定的毒性[14],因此有必要對市售延胡索飲片進行鑒定,避免藥材混用、誤用的情況。
傳統(tǒng)的中藥鑒別方法主要為性狀鑒別、顯微鑒別和理化鑒別,其中性狀鑒別容易受主觀因素的影響,顯微和理化鑒別需對樣品進行復雜的前處理,耗時耗力[15],隨著現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展,逐漸將分子生物技術(shù)應用到藥用植物的鑒別中,該方法主要是依據(jù)藥材的DNA 差異來完成對藥材的鑒別,已有研究將DNA 條形碼技術(shù)用于延胡索及其混偽品的鑒別,通常以延胡索新鮮塊莖為研究對象,但市售延胡索藥材都是經(jīng)過高溫蒸煮或醋炙等的加工品,其DNA 降解嚴重,PCR 擴增困難,不利于進行分子生物鑒別。本研究以延胡索炮制加工品為研究對象,以ITS2 作為DNA 條形碼成功擴增出完整、符合要求且變異位點豐富的序列。除此之外,基于ITS2 條形碼序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,延胡索加工品與其混偽品分屬于不同的分支,而同一物種緊密的聚集在一起,表明ITS2 條形碼序列能夠準確鑒別延胡索加工品及其混偽品,驗證了ITS2 條形碼的鑒別能力,可以為保障延胡索的臨床安全合理應用提供依據(jù)。