基于電子順磁共振波譜法的美拉德反應產物抗氧化活性研究

章銀良，黃天琪，張陸燕，王明雷，王悅，陳科宇，李振城

(鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院，鄭州 450001)

美拉德反應(Maillard reaction，MR)，是指羰基化合物和氨基化合物在一定反應條件下發(fā)生的化學變化，這類化學反應會生成棕黑色聚合物——美拉德反應產物(Maillard reaction products，MRPs)[1-2]。MRPs中抗氧化活性成分受到美拉德反應條件的影響，高溫和堿性條件下更有利于MRPs中例如還原酮、呋喃、類黑精等抗氧化活性物質的生成[3-5]。食品加工過程中合理利用美拉德反應能極大程度提高食品的風味、貨架期等。例如，發(fā)酵黑化技術能減少不良氣味并提高果蔬的抗氧化性及風味[6]。肉制品中肉香味主要通過美拉德等反應將香味前體物質轉化形成[7]。某些羰基和氨基反應的MRPs的抗氧化活性甚至可以和人工合成的BHA、BHT相媲美，由于在食品熱加工過程中這類反應經(jīng)常發(fā)生，因此，MRPs也可被稱為天然抗氧化劑[8-9]。

自由基，是一類性質十分活潑、具有非偶電子的基團或原子，對人體代謝有著重要的影響[10-11]。氧化應激會縮短生物體的壽命，過量的自由基積累會加速人體衰老[12-13]。篩選具有較強抗氧化活性的物質一直以來都是食品研究的熱點[14]。電子自旋共振技術(electron spin resonance，ESR)能利用自由基的順磁性直接以譜圖的形式反映出自由基的含量，通過計算出待測樣品的g因子，從而對樣品所處的電子狀態(tài)、化學環(huán)境進行定性判斷，對自由基進行定性分析[15-16]。DPPH·是一種十分穩(wěn)定的自由基，不需添加補集劑就能得到類似于手掌的五重峰譜圖信號。常用于實驗室檢驗電子順磁共振波譜儀設備是否能正常運行以及反映物質的抗氧化活性能力[17-18]。紫色的DPPH與抗氧化活性物質反應會變成淡黃色，因此常借助紫外分光光度法判定物質的抗氧化活性，但此方法容易受到樣品本身顏色的干擾，從而影響試驗的準確性。ESR法能直接快速地檢驗DPPH·的含量，從而避免顏色的干擾[19-20]。本文以DPPH·清除率為指標，借助電子順磁共振波譜法(ESR)比較不同反應條件下(反應溫度、pH、反應時間、料液比)L-精氨酸和D-核糖組合反應的MRPs對DPPH·的清除能力，并設計均勻試驗對模擬的美拉德反應條件進行優(yōu)化，得到具有最強抗氧化活性的MRPs反應條件，為完善天然抗氧化劑的檢測方法以及深入研究MRPs提供了參考依據(jù)。

1 材料、設備與方法

1.1 試劑與材料

D-核糖(AR)、L-精氨酸(AR)：北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉(AR)、無水乙醇(AR)：天津市永大化學試劑有限公司；鹽酸(AR)：煙臺市雙雙化工有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基 (DPPH·，AR)：進口試劑。

1.2 儀器設備

SQP型電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；E-Scan型電子順磁共振波譜儀 美國布魯克科技(北京)有限公司；FE20型 pH計 瑞士梅特勒-托利多公司；HH-1智能型數(shù)顯恒溫油浴槽、HH-S型水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司；T6型新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 美拉德反應產物(MRPs)的制備

將試驗樣品單因素依次分為反應時間、pH、反應溫度和料液比。制備MRPs的具體操作如下。

1.3.1.1 反應時間

稱取12.5 g精氨酸和12.5 g核糖置于燒杯中，溶解于450 mL的去離子水中，用移液槍吸取HCl(4 mol/L)和NaOH(6 mol/L)調整pH至10.0，然后用去離子水定容至500 mL，混合均勻。量取10 mL反應液轉移至25 mL帶蓋螺口試管中，密封嚴實后，置于120 ℃恒溫油浴槽中反應20，40，60，80，100，120，140，160, 180，200 min。每組反應平行3次，反應結束后快速置于冰水中冷卻并進行相關測定，剩余樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 pH

稱取12.5 g精氨酸和12.5 g核糖置于燒杯中，溶解于450 mL的去離子水中，用移液槍吸取HCl(4 mol/L)和NaOH(6 mol/L)調整pH為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，然后用去離子水定容至50 mL，混合均勻。量取10 mL反應液轉移至25 mL帶蓋螺口試管中，密封嚴實后，置于120 ℃恒溫油浴槽中反應l h，每組反應平行3次。反應結束后快速置于冰水中冷卻并進行相關測定，剩余樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.3 反應溫度

稱取12.5 g精氨酸和12.5 g核糖置于燒杯中，溶解于450 mL的去離子水中，用移液槍吸取HCl(4 mol/L)和NaOH(6 mol/L)調整pH至10.0，然后用去離子水定容至500 mL，混合均勻。量取10 mL反應液轉移至25 mL帶蓋螺口試管中，密封嚴實后，分別置于40，60，80 ℃水浴鍋中反應l h。量取10 mL反應液轉移至25 mL帶蓋螺口試管中，密封嚴實后，分別置于100，120，140 ℃恒溫油浴槽中反應l h。在50 mL圓底燒瓶中加入25 mL混合液并安裝冷凝回流裝置，將圓底燒瓶置于160，180, 200 ℃恒溫油浴槽中反應1 h。反應結束后快速置于冰水中冷卻并進行相關測定，剩余反應液置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.4 料液比

準確稱量核糖和精氨酸，使它們的質量比分別為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1，溶解于45 mL的去離子水中，并分別用4 mol/L的HCl溶液和6 mol/L的NaOH溶液調整pH至10.0，然后用去離子水定容至50 mL，混合均勻。量取10 mL反應液轉移至25 mL帶蓋螺口試管中，密封嚴實后，置于120 ℃恒溫油浴槽中反應l h。反應結束后快速置于冰水中冷卻并進行相關測定，每組反應平行3次，剩余樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ESR檢測方法

用石英毛細管吸取23.77 μL(d=0.93 mm，h=35 mm)待測樣品，將石英毛細管手拿部分稍微向下傾斜，當混合液吸取部分產生空氣柱后用手頂住并插入固體膠中密封底端，并將裝好混合溶液的石英毛細管管壁上殘留溶液以及底部固體膠用紙擦拭干凈，緩慢傾斜放入石英筒套中，將筒套放入E-Scan量規(guī)，上下調節(jié)石英筒套位置，將E-Scan量規(guī)上刻度線指向待測溶液中間位置。立即放入電子順磁波譜儀的諧振腔中，待儀器自動調諧完畢后開始測量。

ESR測定條件：參考李輝等[21]的方法，并稍作改變。頻率9.792069 GHz，功率5.00 mW，中心磁場3487 G，掃描寬度100 G，調制幅度2.27 G，調制頻率86.00 kHz，時間常數(shù)40.96，掃描時間83.88 s(20.97 s×4次)，橫坐標點數(shù)512，接收機增益為3.17×103。

1.3.3 DPPH標準曲線的繪制

以無水乙醇作為溶劑，配制0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mmol/L的DPPH溶液，按照1.3.2所述方法進行測定，積分區(qū)域為(3450±0.01)G～(3525±0.01)G，并建立DPPH的ESR標準曲線。

1.3.4 暗反應時間的確定

將參數(shù)改成按時間掃描，單次掃描時間20.97 s，掃描間隔時間158.23 s，掃描總次數(shù)45次，其余參數(shù)與1.3.2所述一致。用移液槍吸取0.5 mL精氨酸和核糖組(料液比1∶1、反應時間60 min、反應溫度120 ℃、pH 10)的MRPs與2.0 mL 0.5 mmol/L DPPH于棕色具塞刻度管中混勻并計時。按照1.3.2所述方式上樣調諧，混合2 min后立即測量。反應0 min的強度值用空白組的DPPH的ESR譜圖的第3個特征峰峰高表示。測量完畢后，對單次掃描好的DPPH的ESR譜圖的第3個特征峰峰高進行測量，并建立MRPs與DPPH混合溶液的DPPH第3個特征峰峰高隨時間的變化關系。

1.3.5 DPPH自由基清除率的測定

采用電子順磁共振波譜法——ESR法。

參考Nanjo F等[22]、章銀良等[23]的方法，并稍作修改。取0.1 mL MRPs于具塞刻度管中，加入4.9 mL去離子水，配制成50倍稀釋液，振蕩搖勻。再取500 μL MRPs(去離子水溶液作為空白對照組)與2 mL 0.5 mmol/L DPPH于棕色具塞試管中振蕩混合均勻。暗反應20 min后，立即放入電子順磁波譜儀的諧振腔中，待儀器自動調諧完畢后按1.3.2所述方法開始測量。

將掃描波譜圖傳入布魯克自帶軟件WINEPR-Processing中，對DPPH自由基ESR譜圖進行二重積分，積分區(qū)域為(3450±0.01)G～(3525±0.01)G，將測量的二重積分值記為As。在相同操作條件下，以0.5 mL去離子水代替0.5 mL稀釋后的樣品溶液，作為控制組，并記錄其二重積分值，記為Ac。美拉德反應產物對DPPH自由基清除能力可由下式計算得出：

1.3.6 均勻試驗因素水平設計

選取核糖和精氨酸組合，以DPPH自由基(DPPH·)清除率為檢測指標，采用 U10(108)均勻試驗表，因素水平見表1。

表1 U10 (108)均勻試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of U10 (108) uniform test

1.4 統(tǒng)計分析

所有的試驗均做3次平行，采用WINEPR-Processing、Origin 8.0、Mathematics 4.0及其相關方法進行處理，并用SPSS軟件進行顯著性分析(差異顯著p<0.05)。

2 結果與討論

2.1 DPPH濃度和MRPs暗反應時間的確定

DPPH自由基是一種合成的、具有單電子、穩(wěn)定的、以氮為中心的順磁化合物。由于該自由基較為穩(wěn)定，因此不需要捕獲劑也能通過清晰的ESR掃描出譜圖。不同濃度DPPH的積分值與濃度關系圖(A)和ESR譜圖(B)見圖1。

A

B

由圖1可知，DPPH的ESR信號為類似于手掌形狀的五重峰, 隨著DPPH濃度的升高，DPPH·峰形和峰寬基本保持不變, 高度發(fā)生了明顯的變化。在0.1～1.0 mmol/L區(qū)間內DPPH濃度與ESR譜圖的二次積分值具有良好的線性關系，線性方程為y=7.9594x+0.0526，相關系數(shù)R2=0.9918。DPPH·清除的過程實質上是DPPH·含量減少的過程。因此，可以通過DPPH的ESR譜圖的二次積分值來反映DPPH濃度的變化。在0.1～ 0.5 mmol/L區(qū)間內DPPH濃度與ESR譜圖的二次積分值具有更好的線性關系，線性方程為y=7.7692x+0.1196，相關系數(shù)R2=0.9953。綜合考慮李輝等運用ESR對DPPH的優(yōu)化試驗與不同濃度DPPH的二次積分值與濃度關系曲線圖，因此，選用0.5 mmol/L的DPPH用于MRPs對DPPH·清除率的測定。

由圖2可知，在混合DPPH與MRPs后，DPPH·數(shù)量急速下降(DPPH·數(shù)量亦可用DPPH的ESR譜圖的第3個特征峰峰高強度值表示[24])，因此，MRPs對DPPH·的清除是一種極為快速的反應過程。反應5～140 min，DPPH的ESR譜圖的第3個特征峰的強度隨著時間的增加緩慢降低，這可能是毛細石英管中的DPPH·與空氣中的氧氣反應所致。結合單次實際試驗檢測樣品的數(shù)量以及總共消耗時間(約為20 min，20～40 min強度值極差為0.059)，因此選定暗反應時間為20 min。

圖2 DPPH·第3個特征峰強度隨反應時間變化關系圖Fig.2 The relationship between the intensity of the third characteristic peak of DPPH· and the reaction time

2.2 單因素試驗(電子順磁共振法測定MRPs對DPPH·的清除率)

單因素pH、反應溫度、反應時間和料液比對DPPH·清除率的影響見圖3～圖6。

圖3 不同pH下MRPs對DPPH·清除率的影響Fig.3 Effects of MRPs on DPPH· scavenging rates at different pH values

圖4 不同溫度下MRPs對DPPH·清除率的影響Fig.4 Effects of MRPs on DPPH· scavenging rates at different temperatures

圖5 不同時間下MRPs對DPPH·清除率的影響Fig.5 Effects of MRPs on DPPH· scavenging rates at different time

圖6 不同料液比下MRPs對DPPH·清除率的影響Fig.6 Effects of MRPs on DPPH· scavenging rates at different solid-liquid ratios

由圖3可知，MRPs對DPPH·的清除率隨著pH值的增大而增大。在pH為12時，MRPs對DPPH·的清除率達到最大。在酸性條件下(pH 3～7)MRPs對DPPH·的清除率呈緩慢增加趨勢，當模擬MRPs反應體系變?yōu)閴A性條件時，MRPs對DPPH·的清除率迅速增大，這說明堿性條件更有利于美拉德反應產物中抗氧化活性物質的生成。由圖4可知，反應溫度低于80 ℃時，MRPs緩慢產生，在所測溫度范圍內隨著反應溫度的升高持續(xù)增大，并在200 ℃時達到最大清除率，這說明高溫有利于MRPs中抗氧化活性物質的生成。由圖5可知，MRPs對DPPH·的清除率隨著反應時間的增加而增大，反應60～160 min時MRPs生成較為迅速，在180～200 min時，MRPs對DPPH·的清除率基本無太大變化，這說明MRPs中具有抗氧化活性的物質形成于反應的初始階段，同時在后期的反應過程中，MRPs中具有抗氧化活性的物質不會隨著反應時間的增長而分解，MRPs在模擬美拉德反應體系中具有一定的穩(wěn)定性。由圖6可知，MRPs對DPPH·的清除率隨著核糖或精氨酸在模擬體系中的增加而增大，核糖∶精氨酸為3∶1時，MRPs的抗氧化活性最強。

2.3 均勻試驗結果

根據(jù)均勻試驗表(見表2)，模擬不同條件下精氨酸與核糖發(fā)生的美拉德反應并得到相應的MRPs，根據(jù)1.3.5.1的方法進行DPPH·清除率測定，試驗結果見表2。

表2 均勻試驗結果Table 2 The uniform test results

以ESR清除率為指標，均勻試驗結果采用Mathematics 4.0軟件分析，結果如下：

ln[1];=<< Statistics `Linear Regression`

ln[2];=data ={{20, 5, 2.5, 120, 6.55}, {40, 8, 0.5, 200, 21.28}, {60, 11, 1, 100, 35.42}, {80, 3, 3, 190, 7.11}, {100, 6, 0.4, 80, 6.07}, {120, 9, 1.5, 180, 34.53}, {140, 12, 3.5, 60, 37.49}, {160, 4, 0.333, 160, 17.06}, {180, 7, 2, 40, 8.51}, {200, 10, 0.667, 140, 55.66}};

ln[3];=(regress=Regress[data, {1, x1, x2, x4^2, x4}, {x1, x2, x3, x4}];

Chop[regress, 10^(-6)])

Out[3];={Parameter Table→

估計標準誤差T檢驗值P值1-69.12628.08978.544970.000361448X10.1151240.02031485.666990.00237995X24.889890.40974111.93410.0000728167X42-0.001987620.000480516-4.136430.00902832X40.6335560.1200545.277260.00325227

R2→0.976958，RAdj2→0.958524，

Estimated Variance→12.0821

ANOVA Table→

自由度平方和均方F比P值模型42561.33640.33452.99870.000277436誤差560.410312.0821總和92621.74

由數(shù)據(jù)分析結果可得出：反應時間(X1)、pH(X2)、反應溫度(X4)對清除率有極顯著的影響(P<0.01，分別為0.0024，0.000073，0.0033)，影響順序為pH>反應時間>反應溫度。反應底物的料液比(X3)無顯著影響。自由基清除率Y與各個影響因素的回歸方程為：

Y=-69.13+0.1151X1+4.8899X2+0.633556X4-0.001988X42，回歸方程P=0.0002774，所以回歸方程有效，對應的方差分析表見表3。

表3 方差分析表Table 3 The analysis of variances

從回歸方程結合試驗實際，得到最佳反應條件：反應時間為200 min，pH為12，反應溫度為160 ℃，此時理論最佳清除率為63.04%(比優(yōu)化前最佳的值55.66%提高了13.27%)，料液比的均勻試驗結果為不顯著，綜合考慮試驗成本等因素，因此模擬美拉德反應最優(yōu)條件為：核糖∶精氨酸1∶1、pH 12、反應時間200 min、反應溫度160 ℃。經(jīng)試驗驗證，在此優(yōu)化條件下得到的DPPH·清除率為64.34%，理論值與實際值的相對誤差為2.02%，且DPPH·清除率遠超過其余各項單因素以及均勻試驗試驗值。說明按均勻試驗優(yōu)化后的最優(yōu)條件組合進行模擬的美拉德反應生成的MRPs具有最強的抗氧化活性，優(yōu)化結果可靠。

3 結論

本試驗以精氨酸與核糖為美拉德反應模型，模擬了不同反應時間、反應溫度、料液比、pH后得到的MRPs，用DPPH·清除率來表征，運用電子順磁共振波譜法對其抗氧化活性進行研究。結果表明，DPPH·在一定濃度范圍內和ESR譜圖的二次積分值具有良好的線性關系，適用于DPPH·清除率的測定。MRPs與DPPH·反應迅速，DPPH·在外部環(huán)境影響下，也會影響測量結果的準確性，因此應該合理選取暗反應時間，從而減少了試驗誤差。

ESR的單因素結果表明，MRPs的抗氧化活性隨著反應溫度的升高和反應時間的延長而逐漸增強，在溫度低于80 ℃和酸性條件下MRPs的抗氧化活性較低，高溫和堿性條件更有利于MRPs反應。通過增大反應物的濃度能夠提高MRPs的抗氧化活性。均勻試驗表明，反應時間、pH、反應溫度對清除率有極顯著影響(P<0.01，分別為0.0024，0.000073，0.0033)，影響順序為pH>反應時間>反應溫度。反應底物的料液比無顯著影響。綜合考慮試驗成本等因素，因此模擬美拉德反應最優(yōu)條件為：核糖∶精氨酸1∶1、pH 12、反應時間200 min、反應溫度160 ℃。經(jīng)試驗驗證，在此優(yōu)化條件下得到的DPPH·清除率為64.34%，理論值與實際值的相對誤差為2.02%，優(yōu)化結果可靠。