利用MiSeq技術(shù)研究調(diào)味面制食品中優(yōu)勢菌群及細菌多樣性分析

譚艷妮，施法，李欣蔚，李勇，張健，孫佳星，韓世寧，劉宏生

(1.遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院，沈陽 110036；2.沈陽市市場監(jiān)管事務(wù)服務(wù)與行政執(zhí)法中心，沈陽食品藥品檢驗所，沈陽 110136；3.遼寧省糧食科學(xué)研究所，沈陽 110032；4.遼寧省生物大分子模擬計算與信息處理工程研究中心，沈陽 110036)

調(diào)味面制食品，俗稱“辣條”、“面筋”、“素牛筋”，主要消費群體是青少年兒童，特別是中小學(xué)生[1]，年銷售額可高達500億元。它的主要原料是小麥粉，經(jīng)配料食鹽、食糖、麻辣香辛料以及食品添加劑，通過食品加工機械擠壓、膨脹、蒸煮、成型、調(diào)味、包裝等工藝后制成的一種常見的即食方便食品[2-3]。據(jù)悉，2015年5月國家食藥監(jiān)總局發(fā)布了關(guān)于嚴格加強調(diào)味面制品等休閑食品監(jiān)管工作的通知。總局通過組織專項監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，調(diào)味面制品普遍存在食品添加劑超范圍、超限量使用，微生物指示菌菌落總數(shù)也極易超高超標[4-5]。

長期以來，傳統(tǒng)的微生物菌群多樣性研究主要面臨耗時長、分離鑒定工作量較大等問題[6-8]，還有某些特定種群的微生物無法通過傳統(tǒng)的手段分離純化并培養(yǎng)出來[9]，令研究成果產(chǎn)生較大的偏差。

高通量宏基因組測序技術(shù)，是研究微生物菌群結(jié)構(gòu)多樣性的革命性技術(shù)，通過直接對樣品中微生物總的DNA進行提取測序，客觀地反映樣品中低豐度和不可培養(yǎng)的微生物。檢測樣品類別包括食品[10]、醫(yī)藥[11]、環(huán)境[12]、土壤樣品[13]、含菌空氣、植物果實、動物糞便[14-18]等，檢測結(jié)果準確快速。其中二代測序以Illumina MiSeq平臺應(yīng)用最為廣泛[19]，微生物菌群結(jié)構(gòu)多樣性分析主要選擇合適的測序平臺和測序區(qū)域。16S rDNA被認為是細菌分類研究和鑒定的指標，通常作為“分子鐘”，16S rDNA 擴增子測序是對高變區(qū)進行測序分析和菌種鑒定，其序列包含9個可變區(qū)(variable region)和10個保守區(qū)(constant region)?？勺儏^(qū)因微生物而異，不同的可變區(qū)域，分析微生物的能力也不同。目前已涉及一個可變區(qū)(V3、V4、V6)，兩個可變區(qū)(V1-V2、V3-V4、V4-V5)，以及3個可變區(qū)(V1-V3、V3-V5、V4-V6)。因此，可根據(jù)研究選擇特定的可變區(qū)域進行PCR擴增，通過檢測目的區(qū)域的序列變異和豐度，對特定樣本中微生物種群結(jié)構(gòu)多樣性等方面進行分析比較和研究。

本文采用目前國標方法中的均質(zhì)拍擊取樣法，選擇Illumina MiSeq測序平臺以及可變區(qū)域V3-V4進行測序，分析調(diào)味面制品中細菌多樣性，以及對未來改進加工工藝和控制微生物污染以及調(diào)味面制食品新國標的擬定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用隨機抽樣方式，于沈陽市學(xué)校周邊小食店選購調(diào)味面制食品1(樣品規(guī)格28 g，產(chǎn)地沈陽市)、2(樣品規(guī)格26 g，產(chǎn)地重慶市)、4(樣品規(guī)格30 g，產(chǎn)地廣州市)。均為預(yù)包裝食品，來自不同產(chǎn)地相同的流通環(huán)節(jié)，并且存放條件相同。由于調(diào)味面制品國標缺失，樣品均執(zhí)行企業(yè)標準，購買后保證樣品存儲條件符合要求，并在保質(zhì)期內(nèi)對樣品進行檢驗。

1.2 儀器與設(shè)備

拍擊式均質(zhì)機；恒溫水浴鍋；渦旋振蕩器；Eppendorf 5417R冷凍臺式高速離心機、BioPhotometer Plus核酸蛋白測定儀 德國艾本德公司；Model 200/2.0 Power Supply水平電泳儀、Bio-Rad S1000聚合酶鏈式反應(yīng)儀、Versa Doc凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

稱取25 g樣品置于盛有225 mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋內(nèi)，使用拍擊式均質(zhì)拍打1 min，制成1∶10的樣品勻液。靜置后，吸取上清液40 mL于離心管內(nèi)，2000 r/min離心10 min，去樣品雜質(zhì)沉淀；再吸取上清液20 mL，12000 r/min離心5 min，緩慢棄去上清，獲得菌體沉淀。每個樣品均設(shè)3個平行，樣品編號分別為1號、2號和4號。

1.3.2 提取樣品基因組DNA

使用細菌基因組DNA快速提取試劑盒(Bacterial DNA Kit，Omega Bio-Tek公司)，根據(jù)說明書進行細菌總基因組DNA的提取。提取后，檢測DNA提取的濃度，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測菌體DNA的完整性。

1.3.3 MiSeq高通量測序

9. D詞義辨析。A.副詞，太，也。B. 副詞，如此的；連詞，因此。C. 副詞，非常，很；形容詞，恰好是，十足的。D. 形容詞，如此的。結(jié)合語境可知此處指的是，你是如此了不起的一位父親，故選D。

在大量數(shù)據(jù)分析中16S rDNA包含高度保守、中度保守和高度變化的序列區(qū)域，大小適中，與全長序列測序相比較足以體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，同時可降低成本，提高效率。故采用細菌16S rDNA可變區(qū)域V3-V4通用引物：

正向引物為341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)，

反向引物為805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。

PCR反應(yīng)體系：15 μL 2×Taq Master Mix,1 μL Primer F,1 μL Primer R,20 ng DNA模版，加入ddH2O至30 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性20 s，55 ℃延伸20 s，72 ℃退火30 s，25個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，等濃度混樣，使用膠回收試劑盒回收純化產(chǎn)物，用于Illumina MiSeq PE250上機測序。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

為了更加準確地分析測序得到的數(shù)據(jù)，去除干擾數(shù)據(jù)，首先根據(jù)Barcode將下機數(shù)據(jù)(raw data)拆分為不同樣品數(shù)據(jù)，并截去Barcode序列和PCR擴增引物序列，利用Flash軟件進行過濾拼接，得到高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)[20-23]。并對上述數(shù)據(jù)也就是Effective Tags進行操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)聚類分析(相似性97%)[24]。

本次研究中主要針對的是細菌分析，將OTUs代表序列用RDP Classifier(Version 2.2，http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)[25]與Greengene 數(shù)據(jù)庫 (http://greengenes.lbl.gov/)[26]進行物種注釋分析，得到相應(yīng)的物種及物種豐度信息。

同時計算Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)以評估α-多樣性(Alpha diversity)，用豐度分布曲線(OTU rank curve)評價豐度及均度，用Venn圖展示不同樣品間特有以及共有OTUs，繪制微生物菌群分布圖和樣品聚類圖[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果及多樣性分析

本試驗將3個產(chǎn)地的調(diào)味面制品進行了16S rDNA測序，結(jié)果見表1。

表1 調(diào)味面制品樣品16S rDNA測序情況Table 1 16S rDNA sequencing situation of flavored flour foods

經(jīng)拼接、過濾[28]等處理，本次試驗采集的3個調(diào)味面制品樣品總共獲得139533條細菌序列，在97%相似度條件下進行劃分后，共得到3744個OTUs，每個樣品平均為1248個。由表1可知，2號樣品的Chao1指數(shù)為34479，即含有最多細菌物種種類，物種豐度最高。而1號樣品的Simpson指數(shù)為0.48，即物種均勻度最好。本次試驗覆蓋率(coverage)均在0.97～0.98之間，基本涵蓋樣品中絕大多數(shù)菌群，測序數(shù)據(jù)量滿足分析的需要。

將數(shù)據(jù)做成指數(shù)箱型圖(見圖1)更可直觀看出，這3個樣品的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均較高，而Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)則較低。因此，這3個樣品中的細菌豐度高，而多樣性低。

圖1 多樣性指數(shù)箱型圖Fig.1 The boxplots of diversity indexes

由圖2可知，來自廣州市的4號樣品物種豐度較高，并且它的物種組成也較為均勻。

圖2 豐度分布曲線Fig.2 OTU rank curve

2.2 樣品中核心細菌菌群及相對含量分析

本試驗測序經(jīng)過優(yōu)化平均序列讀長為429 bp，將所得到的全部OTU比對數(shù)據(jù)庫，共得到10門、14綱、23目、29科、56屬。本試驗中平均相對含量大于1%的細菌屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、銅綠假單胞菌屬(Pseudomonas)、泛菌屬(Pantoea)、布特菌屬(Buttiauxella)、勒克菌屬(Leclercia)。3個樣品中，1號樣品與2號樣品中芽孢桿菌屬(Bacillus)的相對含量均較高，分別為88.08%和50.64%。由圖3可知，調(diào)味面制品樣品初始菌群結(jié)構(gòu)中的優(yōu)勢細菌為芽孢桿菌屬和銅綠假單胞菌屬。

圖3 屬水平所有樣品菌群結(jié)構(gòu)分布圖Fig.3 The distribution of microflora structure of all samples at genus level

2.3 Venn圖分析

在相似度為97%的條件下，進一步統(tǒng)計了3個樣品中OTU出現(xiàn)的次數(shù)，利用Venn圖直觀展示了樣品間OTU的重疊情況。結(jié)合它所代表的物種，就可以發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地樣品中的核心微生物。

由圖4可知，出現(xiàn)1次和2次的OTU數(shù)為3621個和54個，分別占OTU總數(shù)的96.71%和1.44%，3組樣品的核心OTU數(shù)為15個，占OTU總數(shù)的0.40%。1號樣品與2號樣品共有26個OTU數(shù)；2號樣品與4號樣品共有34個OTU數(shù)；1號樣品與4號樣品共有24個OTU數(shù)，由此可見，不同產(chǎn)地樣品之間細菌的多樣性具有很大差異，但是又存在共同的OTU數(shù)，并且核心微生物大致相同，可見在加工工藝以及加工過程中存在相似的微生物污染風險。

圖4 OTU樣本分布韋恩圖Fig.4 OTU sample distribution Venn diagram

2.4 樣品中菌群在屬水平上的分類組成

本試驗自定義相對豐度≥10%的菌群為優(yōu)勢菌群。從屬的水平描述調(diào)味面制食品中微生物菌群結(jié)構(gòu)變化，包括59個菌屬：芽孢桿菌屬(Bacillus)、銅綠假單胞菌屬(Pseudomonas)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、泛菌屬(Pantoea)、布特菌屬(Buttiauxella)、勒克菌屬(Leclercia)、假芽孢桿菌屬(Falsibacillus)、氮單胞菌屬(Azomonas)、Pluralibacter、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、特布爾布爾西菌屬(Trabulsiella)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、拮抗菌(Terribacillus)、冷桿菌屬(Psychrobacter)、克呂沃爾菌屬(Kluyvera)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、Serpens、沙門氏菌(Salmonella)、陰溝腸桿菌(Enterobacter)、Kosakonia、Salirhabdus、Allobacillus、嗜氮根瘤菌屬(Azorhizophilus)、堆肥芽孢桿菌屬(Compostibacillus)、短小芽孢桿菌(Lysinibacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、克雷伯氏桿菌(Klebsiella)、Chryseolinea、少鹽芽孢桿菌屬(Paucisalibacillus)、無形體屬(Anaplasma)、Ornithinibacillus、約克氏菌(Yokenella)、索氏菌屬(Thauera)、支原菌屬(Mycoplasma)、中華芽孢桿菌屬(Sinibacillus)、Lelliottia、Siccibacter、枝芽孢桿菌(Viridibacillus)、康氏鹽漬芽孢桿菌(Salinibacillus)、太平洋海洋桿菌(Oceanobacillus)、Phenylobacterium、糖芽孢桿菌屬(Saccharibacillus)、弗氏檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、Samsonia、新衣原體屬(Neochlamydia)、海洋紅樹林菌屬(Mangrovibacterium)、弓形桿菌(Arcobacter)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、乳球菌屬(Lactococcus)、Thiopseudomonas、Halalkalibacillus、馬賽菌屬(Massilia)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、Fontibacillus、奇異單胞菌(Allomonas)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、根瘤菌屬(Mesorhizobium)、嗜麥芽窄食單胞菌屬(Stenotrophomonas)、Endozoicomonas。進化關(guān)系見圖5。

圖5 屬水平所有樣品群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig.5 The distribution of microflora structure of all samples at genus level

而利用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法檢驗調(diào)味面制品，僅發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬1個優(yōu)勢菌屬，包括糞嗜冷桿菌(Psychrobacterfaecalis)以及黃褐假單胞菌(Pseudomonasfulva)2株菌，雖然調(diào)味面制品產(chǎn)地不同，但是它們的優(yōu)勢菌中均包括假單胞菌屬，本次試驗共檢出50余種菌，由此可見，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法無法反映出樣本中低豐度物種，可能存在對樣本微生物的菌群及優(yōu)勢菌片面的分析和判斷[29]。

3 討論

本次試驗樣品均購于同一超市，流通環(huán)節(jié)以及存放方式相同，但產(chǎn)地不同。由圖5可知，各樣品之間的主要菌群結(jié)構(gòu)和比例不盡相同。很可能由于不同樣品的加工工藝以及產(chǎn)地環(huán)境各不相同。從門的水平上，3種調(diào)味面制食品中的微生物菌群主要為厚壁菌門(Firmicutes)與變形菌門(Proteobacteria)，占總菌數(shù)的50%～90%，此外還存在少量的擬桿菌門(Bacteroidetes)和螺旋體門(Spirochaetes)。3種調(diào)味面制食品在屬的水平上表現(xiàn)出一定的差異，圖3展示了樣品中物種豐度較高的前50個屬水平序列信息。在這些物種豐度較高的50個序列中，選取的3種調(diào)味面制食品樣品在菌群結(jié)構(gòu)上存在一定的相似性，3種均包含芽孢桿菌屬(Bacillus)、銅綠假單胞菌屬(Pseudomonas)、布特菌屬(Buttiauxella)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)。芽孢桿菌屬、泛菌屬、不動桿菌屬廣泛分布于自然界，而乳球菌屬和雙歧桿菌屬為益生菌，常用于乳制品發(fā)酵。值得注意的是，其中銅綠假單胞菌屬、沙門氏菌屬為致病菌，在調(diào)味面制食品中發(fā)現(xiàn)礦泉水中常見的致病菌——銅綠假單胞菌屬，極有可能是生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)產(chǎn)生了交叉污染、用水不衛(wèi)生等?？梢?，為保證產(chǎn)品的衛(wèi)生質(zhì)量，加強生產(chǎn)規(guī)范化，管理標準化，有效監(jiān)控微生物風險尤為重要。還有某些菌屬可能處于“活的不可培養(yǎng)狀態(tài)(viable but nonculturable state， VBNC)” ，即喪失細菌可培養(yǎng)的特征，但是細胞膜完整，有一定的代謝活力，遇到適宜條件，可恢復(fù)到可培養(yǎng)的狀態(tài)，例如生長溫度在37 ℃的泛菌屬、明串珠菌屬和不動桿菌屬。

高通量測序技術(shù)可以跳過傳統(tǒng)微生物耗時較長的培養(yǎng)步驟，直接提取多個樣品中微生物基因組信息，更全面客觀地反映樣品中微生物菌群結(jié)構(gòu)和多樣性，具有高效、準確、低成本的優(yōu)勢，但它同時具有相對的局限性。首先，高通量測序過程中產(chǎn)生海量的數(shù)據(jù)信息，要將這些數(shù)據(jù)加以總結(jié)歸類，建立微生物多樣性的模型，需要生物信息學(xué)的專業(yè)背景；其次，高通量測序技術(shù)雖然可以檢測出樣品中不可培養(yǎng)的微生物，但是并不能確定此微生物是否存活，需要結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)方法進行比較。

本文采用均質(zhì)拍擊法提取食品樣品的微生物基因組，利用高通量測序技術(shù)(MiSeq)對可變區(qū)域V3-V4區(qū)進行測序，為后續(xù)食品中微生物研究提供了新思路和方法。

研究表明，調(diào)味面制食品中微生物多樣性較低，3種調(diào)味面制食品中微生物菌群結(jié)構(gòu)具有一定相似性，其中值得引起重視的是致病菌銅綠假單胞菌屬的發(fā)現(xiàn)，由于此次未對真菌類進行測序，但仍有部分未確定的菌株，需要進一步研究，在食品安全問題可能發(fā)生之前，采取有效的預(yù)防措施，將危害系數(shù)降到最低。同時加強食品生產(chǎn)工藝流程衛(wèi)生標準化，保證食品質(zhì)量安全。