達格列凈通過上調(diào)SIRT1增強糖尿病腎病大鼠腎臟細(xì)胞自噬從而抑制足細(xì)胞損傷*

熊哲學(xué)， 唐明娟， 李凝旭

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北 武漢 430000）

糖尿病腎臟疾?。╠iabetic kidney disease，DKD），也稱為糖尿病腎病，是由糖尿病引發(fā)的一類重大腎臟并發(fā)癥，長期高糖狀態(tài)對腎臟足細(xì)胞的損傷加速了DKD 的進展，臨床上會以尿蛋白的形式表現(xiàn)出來［1-2］。足細(xì)胞是腎小球濾過屏障不可或缺的一部分，它們是一類高度分化的細(xì)胞群，損傷丟失后無法增殖，自噬作為維持足細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的防御機制，其活躍程度成為了保持足細(xì)胞完整性的關(guān)鍵［3］，然而現(xiàn)有研究表明自噬在糖尿病和肥胖癥等營養(yǎng)過剩的能量狀態(tài)下是被抑制的，在饑餓或營養(yǎng)剝奪狀態(tài)下則被激活［4-6］，因此DKD 的發(fā)展與腎臟自噬的缺失存在緊密聯(lián)系。達格列凈是一種鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2 抑制劑（sodium-glucose cotransporter 2 inhibitors，SGLT2i），最初適用于降低血糖，因其極大的腎臟保護作用而受到廣泛關(guān)注。有學(xué)者推測［7］，在SGLT2i的使用過程中，通過加大尿液葡萄糖的排泄，不僅僅降低了血糖，更模擬了一種營養(yǎng)剝奪或能量丟失的機體生理狀態(tài)，通過上調(diào)能量感受器沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（silent information regulator factor 2-related enzyme 1，SIRT1）的表達，刺激了腎臟自噬流量，從而抑制了高糖對足細(xì)胞的持續(xù)損傷，延緩了DKD 的進展。目前對于此方向的研究幾乎是空白的，本實驗的目的是通過對DKD 大鼠的喂養(yǎng)與治療，觀察各組目的蛋白的表達情況，探討達格列凈是否通過上調(diào)SIRT1 的表達來增強腎臟自噬通量，并抑制足細(xì)胞損傷，遏制DKD的進一步發(fā)展。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 實驗試劑及設(shè)備 達格列凈片購自AstraZeneca；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自Sigma；抗SIRT1 抗體、抗微管相關(guān)蛋白 1 輕鏈 3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3，LC3）抗體、抗 beclin-1 抗體、抗 NPHS2 抗體、抗 GAPDH 抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG 抗體均購自Proteintech；BCA 檢測試劑盒、SDS 制膠試劑盒及DAPI 染色劑均購自武漢賽維爾生物科技有限公司。全自動生化檢測分析儀（BECKMAN COULTER AU5800）；ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)（Bio-Rad）；熒光顯微鏡（Nikon Eclipse C1）；透射電子顯微鏡（HITACHI）。

1.2 實驗動物及飼料 20只SPF 級雄性SD 大鼠，4~5 周齡，體重75~105 g，訂購于三峽大學(xué)動物實驗中心，許可證號SCXK（鄂）2017-0012。高脂飼料及普通飼料購自武漢市萬千佳興生物科技有限公司。本研究已通過華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會審批［倫審字（S822）號］。

2 實驗方法

2.1 DKD 模型構(gòu)建 20只 4~5 周齡 SD 雄性大鼠被飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)的12 h 光/暗周期的籠子里，可以自由獲取食物和水，恒定室溫為（23±2）℃，相對濕度為（45±10）%，隨機分選出6只大鼠作為對照組，另14只大鼠用作后續(xù)糖尿病模型構(gòu)建。對照組飼以普通飼料，準(zhǔn)備用作造模的大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)4 周，然后連續(xù)3 日空腹腹腔注射鏈STZ（35 mg/kg，溶于pH 4.2 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中）［8-9］，注射 STZ 前后記錄大鼠體重、進水量、血糖。一周后對大鼠進行血糖檢測，空腹血糖≥16.7 mmol/L 及觀察到顯著“三多一少”癥狀的大鼠確定為糖尿病成功模型動物，14只大鼠中造模成功12只。成模后的糖尿病大鼠繼續(xù)給予高脂高糖飼料，兩周后將其隨機分為糖尿病組及達格列凈組，每組6只，達格列凈組大鼠按照達格列凈 1 mg·kg-1·d-1每日 17 時定時灌胃治療，糖尿病組大鼠用生理鹽水1 mg·kg-1·d-1每日17 時定時灌胃治療。治療4 周后在代謝籠中收集每只大鼠24 h 尿液，之后所有大鼠麻醉，取血、摘除腎臟（稱重），將部分腎組織固定在4%甲醛中進行組織化學(xué)分析，部分腎組織置于2.5%的戊二醛固定液中進行電子顯微鏡檢查。最后將其余腎組織立即冷凍在液氮中，并保存在-80 ℃中，直到進一步分析。

2.2 生化分析指標(biāo) 血液及尿液標(biāo)本于4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清液送華中科技大學(xué)附屬梨園醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)科行全自動分析儀檢測，檢測內(nèi)容包括空腹血糖、空腹胰島素、肌酐、尿總蛋白和尿白蛋白。

2.3 透射電鏡 麻醉處死各組大鼠前準(zhǔn)備好電鏡固定液，取出新鮮腎臟標(biāo)本，用手術(shù)刀片切割至黃豆大小，再將切割好的小塊腎臟轉(zhuǎn)移至裝有新的電鏡固定液的EP 管內(nèi)固定。依次經(jīng)過后固定、漂洗、脫水、包埋、過夜后制成樹脂塊備用。樹脂塊于超薄切片機中行60~80 nm 超薄切片，150 目方華膜銅網(wǎng)撈片，銅網(wǎng)切片放入銅網(wǎng)盒內(nèi)室溫干燥過夜。最后置于透射電子顯微鏡下觀察并采集圖像進行分析。使用Image J 軟件（Madison，WI）分別對每組大鼠中的某一個腎臟截面電鏡圖的隨機7 個腎小球視野進行腎小球結(jié)構(gòu)參數(shù)分析。

2.4 Western blot 首先使用RIPA 裂解液與蛋白酶抑制劑Cocktail 從腎臟皮質(zhì)區(qū)組中提取總蛋白；然后用BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試盒定量測定蛋白濃度，在配置好的10 孔SDS-PAGE 凝膠中上樣，之后電泳分離，將目的蛋白轉(zhuǎn)致PVDF 膜；然后用指定的Ⅰ抗（SIRT1、LC3、beclin-1、NPHS2）及內(nèi)參照 GAPDH 抗體4 ℃下孵育過夜，之后將膜與Ⅱ抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠IgG 抗體）于室溫下孵育，最后用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，于多功能數(shù)字凝膠成像分析系統(tǒng)暗箱中曝光，觀察免疫反應(yīng)條帶并采集圖像。使用ImageJ 軟件進行各目的蛋白表達的相對豐度分析，每組樣本均進行3次獨立重復(fù)實驗取平均值。

2.5 免疫熒光檢測 將待染組織切片置于65 ℃恒溫箱烤片1 h，依次進行脫蠟、抗原修復(fù)、封閉非特異性抗原表位等步驟。按所需目的抗體孵育特異性Ⅰ抗（LC3、NPHS2）于4 ℃濕盒中靜置過夜。次日取出切片，室溫下復(fù)溫30 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min，選取相應(yīng)的免疫熒光Ⅱ抗滴加于腎臟組織上，PBS洗滌3 次，每次5 min。避光條件下，DAPI 染液染細(xì)胞核后用PBS 洗滌3 次，每次5 min。最后使用熒光顯微鏡在相同曝光時間下進行觀察拍照。使用Image J 軟件進行腎小球區(qū)域熒光半定量分析，我們隨機截取了每組大鼠中的某一個腎臟熒光切面圖中50個腎小球區(qū)域進行測量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析及圖形制作。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 造模前后大鼠血糖、體重和飲水量變化

適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將準(zhǔn)備用于造模糖尿病的大鼠開始行高脂飼料喂養(yǎng)4 周，在第6 周開始注射STZ 造模，造模前后兩周內(nèi)（第5、7 周）3組大鼠的體重、血糖以及進水量變化趨勢如表1 所示，可以觀察到注射STZ 7 周后的糖尿病組大鼠相對于對照組體重減輕、血糖顯著升高及飲水量顯著增多（P＜0.05）。

表1 注射STZ前后大鼠血糖、體重和飲水量變化Table 1. Changes of fasting blood glucose，body weight and water drinking before and after STZ injection（Mean±SD）

2 大鼠一般生理指標(biāo)

經(jīng)過4 周治療后，腎重在3組大鼠中無顯著差異；與糖尿病組比較，達格列凈組大鼠的體重和尿量顯著增加（P＜0.05）；與糖尿病組比較，達格列凈組大鼠腎重/體重比降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠體重、腎重、腎重/體重比和尿量比較Table 2. Comparison of body weight（BW），kidney weight（KW），kW/BW ratio and urine volume among groups（Mean±SD. n=6）

3 大鼠各項生化指標(biāo)

如表3 所示，達格列凈組大鼠經(jīng)過治療，血肌酐（serum creatinine，SCr）較糖尿病組增加（P＜0.05）；24 h 尿總蛋白（total urinary protein，UTP）、24 h 尿白蛋白（urinary albumin,UAlb）、空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)Ins）和穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR；HOMA-IR=FBG×FIns/22.5［10］）較糖尿病組顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組生化指標(biāo)比較Table 3. Comparison of biochemical indexes among groups（Mean±SD. n=6）

4 電鏡下腎小球結(jié)構(gòu)參數(shù)變化

如圖1 所示，透射電鏡下可觀察到糖尿病大鼠腎小球基底膜增厚，足細(xì)胞足突融合、消失。這兩項指標(biāo)通過量化分析后觀察到，相對于糖尿病組，在經(jīng)過治療的達格列凈組中顯著降低（P＜0.05），其中達格列凈組足細(xì)胞足突寬度與對照組無顯著差異。

Figure 1. Transmission electron microscope of glomeruli and quantitative analysis of each group（scale bar=2μm）. The thickening of the glomerular basement membrane（white arrows）and the fusion and disappearance of podocytes foot processes（black arrows）in diabetic rats can be observed. GBM：glomerular basement membrane；FPs：foot processes. Mean±SD. n=7.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs diabetes group.圖1 各組腎小球電鏡及量化分析圖

5 Western blot 實驗檢測 SIRT1、beclin-1、LC3 和NPHS2蛋白表達情況

如圖2所示，達格列凈組大鼠中SIRT1表達量顯著高于另外兩組，而且在糖尿病組表達最低（P＜0.05）；自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-II/LC3-I比值和beclin-1 蛋白表達呈現(xiàn)達格列凈組、對照組、糖尿病組依次降低的趨勢（P＜0.05）；足細(xì)胞標(biāo)記蛋白NPHS2 在達格列凈組的表達量低于對照組，高于糖尿病組（P＜0.05）。

6 免疫熒光實驗檢測NPHS2及LC3蛋白表達情況

Figure 2. Comparison of SIRT1，beclin-1，NPHS2 and LC3 protein expression in each group. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs diabetes group.圖2 各組SIRT1、beclin-1、NPHS2和LC3蛋白表達的比較

如圖3 所示，使用抗NPHS2 抗體（紅色）免疫染色以鑒定足細(xì)胞，使用抗LC3 抗體（綠色）免疫染色以鑒定自噬。量化后的達格列凈組中由LC3 標(biāo)記的綠色熒光總量高于糖尿病組（圖3B），考慮到截取的每個腎小球區(qū)域大小不一，可能對統(tǒng)計的熒光總量造成誤差，我們分別將每組截取的50 個腎小球中每個腎小球的熒光量與其區(qū)域面積的比值在圖3C 中展現(xiàn)了出來，達格列凈組腎小球單位區(qū)域上的LC3表達量顯著高于糖尿病組（P＜0.05）；NPHS2 蛋白顯示的紅色熒光總量對照組中是最高的，達格列凈組也是優(yōu)于糖尿病組的，同樣的方式換算后各組腎小球單位面積的NPHS2表達趨勢仍然與前者相似。

討 論

在本研究中，高脂飲食配合低劑量鏈脲佐菌素連續(xù)注射的大鼠模型與人類2 型糖尿病有很大的相似性，而且導(dǎo)致了DKD 的發(fā)生。在表1中可觀察到，注射STZ 的大鼠前后兩周在體重、血糖和飲水量與對照組大鼠產(chǎn)生了差異，表現(xiàn)出“三多一少”糖尿病癥狀。表2中糖尿病組腎重/體重比與對照組產(chǎn)生顯著差異，表明糖尿病組大鼠腎臟出現(xiàn)了肥大；而且表3中對照組和糖尿病組的各項生化指標(biāo)血肌酐、尿總蛋白、尿白蛋白及HOMA-IR 的差異表明模型大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗和腎臟病變。

Figure 3. Immunofluorescence staining showed the changes of autophagy and podocyte marker fluorescence intensity in each group（scale bar=50 μm）. A：the red fluorescence represents NPHS2，the green fluorescence represents LC3；B：the total amount of immunofluorescence in each group；C：mean fluorescence of glomerular region in each group. Mean±SD. n=50.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs diabetes group.圖3 免疫熒光染色顯示各組大鼠自噬與足細(xì)胞標(biāo)志物熒光強度變化

鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2（sodium-glucose cotransporter 2，SGLT2）表達于近曲小管上皮細(xì)胞的管腔表面［2］，它主動重吸收小管液中的鈉與葡萄糖，SGLT2 抑制劑最初適用于降低血糖，隨后其明顯的腎臟保護作用成為研究的焦點。在本次實驗中，使用達格列凈對糖尿病大鼠進行為期4 周的治療，治療結(jié)束后，我們觀察到電鏡下的腎小球基底膜厚度與足細(xì)胞足突寬度經(jīng)過量化之后在達格列凈組與糖尿病組之間表現(xiàn)出顯著差異，在超微結(jié)構(gòu)下便顯示出達格列凈對腎臟足細(xì)胞的保護作用。而且通過檢測各組大鼠的血液及尿液生化指標(biāo)，觀察到經(jīng)過達格列凈治療的糖尿病大鼠，尿總蛋白、尿白蛋白及胰島素抵抗相較于糖尿病組均有不同程度的減輕，血肌酐的差異表明達格列凈對DKD 早期腎小球的超濾狀態(tài)也有一定的緩解。在表2 腎臟的一般情況中，達格列凈組的腎重/體重比優(yōu)于糖尿病組，說明經(jīng)過治療后的達格列凈組大鼠腎臟肥大也有所減輕。這些結(jié)果與各組之間的超微結(jié)構(gòu)變化趨勢一致。

sirtuins 是一類依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的脫乙酰酶，廣泛存在于胚胎和眾多動物組織中，是細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)劑［11］。SIRT1 是sirtuins 家族中表達廣泛、研究廣泛的成員，它對LC3 的去乙?；龠M了核質(zhì)轉(zhuǎn)運和自噬體的形成，因此它與自噬的發(fā)生存在緊密聯(lián)系［12］。SIRT1 作為一種能量感受器，其活性的變化受能量代謝狀態(tài)的影響，在衰老及過量營養(yǎng)供應(yīng)的情況下，NAD+/NADH 比率的降低會導(dǎo)致SIRT1 在腎臟表達下降；在禁食或營養(yǎng)剝奪時，大鼠體內(nèi)顯示出NAD+生物合成酶-煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的增加，線粒體NAD+隨之增加［13］，SIRT1的表達則被上調(diào)，進而促進自噬發(fā)生。

自噬是一種保守的分解代謝機制，它將細(xì)胞內(nèi)的各種成分，如蛋白質(zhì)聚集體和受損的細(xì)胞器運送到溶酶體進行降解、清除和循環(huán)，以維持體內(nèi)平衡和細(xì)胞的完整性［4］。足細(xì)胞是一類特殊的腎小球上皮細(xì)胞，高度分化且無法增殖，它附著在腎小球基底膜的外側(cè)，與內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜一起形成腎小球濾過屏障，是腎小球濾過屏障不可或缺的一部分［14］。足細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下就保持較高的自噬率來維持自身穩(wěn)定，如果它受損，濾過屏障被破壞，臨床上則會表現(xiàn)出蛋白尿的特征［15-16］，故自噬對于維持足細(xì)胞的功能意義尤為重要。為了對足細(xì)胞進行檢測，我們應(yīng)用足細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白NPHS2（一種在動物體內(nèi)由Nephrosis2基因編碼的蛋白質(zhì)）進行其定量評估，為了確保對自噬準(zhǔn)確和客觀的評估，我們選擇兩種分子來客觀評估足細(xì)胞自噬狀態(tài)：自噬基因becn1編碼蛋白beclin-1 與LC3。beclin-1 是最早被檢測的哺乳動物自噬蛋白之一［17］，是自噬特異性Ⅲ類磷脂酰肌醇3 激酶復(fù)合物的一部分，形成自噬小體的必需分子，可介導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白定位于吞噬泡［18］；LC3 前體被半胱氨酸蛋白酶裂解，轉(zhuǎn)化為LC3-I，LC3-I 與新生自噬小體表面的磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)形式LC3-II，因此，LC3-II 與自噬小體和自溶酶體具有相對特異性［19-20］，故可以通過檢測 LC3-I 到 LC3-II 的轉(zhuǎn)化以及beclin-1蛋白的表達情況來評估自噬水平。

我們通過Western blot 實驗進行相關(guān)蛋白定量檢測，免疫熒光實驗定位觀察及半定量佐證，在Western blot 實驗結(jié)果中觀察到，達格列凈組LC3-II/LC3-I 比值及beclin-1 蛋白的表達高于對照組，對照組高于糖尿病組；NPHS2蛋白表達呈現(xiàn)對照組、達格列凈組、糖尿病組依次降低的趨勢。這說明經(jīng)過治療后的達格列凈組大鼠腎臟自噬通量增強，足細(xì)胞穩(wěn)態(tài)得以維持，損失減少，而糖尿病組則表現(xiàn)出自噬不足，足細(xì)胞穩(wěn)態(tài)破壞，數(shù)量減少。而免疫熒光實驗中我們隨機對各組大鼠腎臟標(biāo)本進行LC3 與NPHS2雙標(biāo)，得到了定位及半定量結(jié)果，通過量化分析，觀察到各組的NPHS2、LC3 熒光總量和每個腎小球的單位平均熒光值的統(tǒng)計分析呈現(xiàn)對照組、達格列凈組、糖尿病組依次升高趨勢。這跟Western blot 實驗結(jié)果趨勢一致，而且我們在熒光圖片上可直接觀察到LC3 標(biāo)記的綠色自噬熒光相對集中的表達于NPHS2 標(biāo)記的代表足細(xì)胞的紅色熒光周圍，這說明腎臟自噬通量增強主要的受益者是足細(xì)胞。理論上足細(xì)胞表面并不存在SGLT2，那么達格列凈對足細(xì)胞周圍自噬的誘導(dǎo)作用是否是通過其對全身能量代謝的影響而實現(xiàn)？這正是我們思考的方向。

在Western blot 實驗中SIRT1蛋白的表達在達格列凈組中最高，對照組中次之，糖尿病組中最低。由此可以肯定的是達格列凈組大鼠體內(nèi)的SIRT1 被上調(diào)，從能量代謝角度分析，說明達格列凈的使用導(dǎo)致大鼠尿液葡萄糖大量排泄，模擬了饑餓或能量剝奪狀態(tài)，促使腎臟細(xì)胞中NAD+增加，上調(diào)SIRT1在腎臟中的表達，進而增強了腎臟自噬，維護了足細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，最終減輕其損傷；而糖尿病組大鼠體內(nèi)葡萄糖蓄積，表現(xiàn)出營養(yǎng)過剩的特點，故SIRT1 被抑制，腎臟自噬減弱，足細(xì)胞丟失最多；對照組大鼠體內(nèi)無異常能量狀態(tài)波動，則足細(xì)胞保存完好，這符合我們的實驗預(yù)期。

在已經(jīng)發(fā)表過的相關(guān)研究中，目前只有1 篇文獻探討過關(guān)于SGLT2 抑制劑對腎臟足細(xì)胞的影響，Korbut 等［21］證明了恩格列凈能通過促進db/db小鼠的腎小球自噬來減輕腎小球損傷。但遺憾的是并沒有深入對其分子機制進行探討。在本實驗中，我們結(jié)合能量代謝與自噬的調(diào)節(jié)機制，從SIRT1-自噬途徑探究了達格列凈對DKD 大鼠足細(xì)胞的保護作用。從我們的實驗結(jié)果可以總結(jié)出，達格列凈通過上調(diào)SIRT1 的表達，增強了腎臟的自噬通量，減輕了DKD大鼠足細(xì)胞的丟失，減少了蛋白尿，發(fā)揮了腎臟保護作用。

綜上所述，達格列凈可通過增強糖尿病腎病大鼠腎臟細(xì)胞自噬從而抑制足細(xì)胞損傷，其中SIRT1信號通路可能成為其促進自噬的潛在途徑。