氣管滴注大氣細(xì)顆粒物構(gòu)建大鼠慢性阻塞性肺疾病模型*

王 榮， 李嘉瑞， 曹珊珊， 廉 婷， 劉 蓓， 岳晨星， 王娜娜， 秦 蓓△

（西安醫(yī)學(xué)院 1藥學(xué)院，2臨床醫(yī)學(xué)院，3醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710021）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以慢性炎癥、氣流受限為特征的一種進(jìn)行性肺部疾病［1］。因COPD 患病率和致死率逐年增高，預(yù)計(jì)將成為全球第三大死亡原因。大氣細(xì)顆粒物（fine particulate matter，PM2.5）是主要的大氣污染物，PM2.5擁有較小的粒徑和較大的表面積，其表面可富集大量有毒有害物質(zhì)，可對呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生長期而持續(xù)的病理作用，被認(rèn)為是呼吸系統(tǒng)疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。流行病調(diào)查顯示，PM2.5暴露可增加COPD 的發(fā)病率［2］，減少空氣污染可有效降低COPD 的患病風(fēng)險(xiǎn)［3］。目前，COPD 模型的建立主要采用煙霧暴露法［4-5］、脂多糖［6］和蛋白酶誘導(dǎo)法［7］等。PM2.5是一種室外有毒顆粒污染物，本項(xiàng)工作擬采用氣管滴注PM2.5顆粒建立大鼠COPD 模型，并從大鼠肺功能、炎癥指標(biāo)和病理學(xué)變化等方面對大鼠模型進(jìn)行綜合評價(jià)，為研究COPD 提供發(fā)病病因相似、簡便且便于再現(xiàn)的動(dòng)物模型。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF 級 SD 雄性大鼠 28只，體重（200±20）g，6~7周齡，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（川）2015-030。墊料和飼料均由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。自由飲用蒸餾水，飼養(yǎng)條件為溫度20~25 ℃，濕度為40%~55%，自然光照，正常飼養(yǎng)，隔天更換墊料。

2 主要試劑

大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素 6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；瑞氏-姬姆薩染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；染色緩沖液（深圳康泰生物制品股份有限公司）；戊巴比妥鈉（Merck）。

3 主要儀器

1510 自動(dòng)全波長酶標(biāo)儀和Biofuge Stratos 高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific）；超凈飼養(yǎng)單元（西安富康空氣凈化設(shè)備工程有限公司）；2120i 全自動(dòng)血液分析儀（SIEMENS）；VM-02U 數(shù)顯渦旋混勻器（上海珂淮儀器有限公司）；Buxco PFT 小動(dòng)物呼吸肺功能測量系統(tǒng)（普升科技有限公司）；RM2245輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（Leica）；Ci-L生物顯微鏡（Nikon）。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1 PM2.5的采樣及溶液配制 于2018 年冬季取暖季進(jìn)行采樣，采樣期PM2.5的平均濃度為（151.38±39.49）μg/m3。分別用分析天平稱取上述PM2.5粉末22.5、45和90 mg均加入9 mL生理鹽水，配制成2.5、5和10 g/L的PM2.5溶液，置于4 ℃，避光保存。

4.2 PM2.5誘導(dǎo)大鼠COPD 肺功能損傷模型 本研究選擇西安冬季PM2.5樣本，分別以我國環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中PM2.5日均濃度（75μg/m3）和西安冬季PM2.5濃度最高濃度（400 μg/m3）確定大鼠滴注低和高劑量［8］。通過大鼠每日呼吸量（0.105 m3/d）和上述PM2.5濃度計(jì)算，可設(shè)置PM2.5低、中、高的滴注劑量分別為 2.5 mg/kg、5.0 mg/kg 和 10.0 mg/kg［9］。28只大鼠隨機(jī)分為 4組：正常對照（control）組、2.5 mg/kg PM2.5組、5 mg/kg PM2.5組和 10 mg/kg PM2.5組，每組 7只。大鼠麻醉后進(jìn)行氣管插管，每3 d 滴注上述溶液，每只按1 mL/kg 進(jìn)行滴注，連續(xù)5 次。每次滴注后對大鼠進(jìn)行稱重。

4.3 肺功能的測定 大鼠末次氣管滴注后，禁食，麻醉，暴露氣管，進(jìn)行氣管插管。插管完成后將動(dòng)物放在測量腔內(nèi)，連接插管與呼吸檢測儀。待大鼠呼吸平穩(wěn)后，測定其呼吸頻率、潮氣量（tidal volume）、每分鐘通氣量（minute ventilation）、呼吸指數(shù)（respiratory index）、最大吸氣流速（peak inspiratory flow）、吸氣時(shí)間（inspiratory time）、呼氣時(shí)間（expiratory time）和肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性（pulmonary dynamic compliance）。

4.4 大鼠血清中炎癥指標(biāo)的測定 大鼠進(jìn)行肺功能指標(biāo)測定后，腹主動(dòng)脈采血，離心收取血清。采用ELISA 法檢測大鼠血清中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的含量。

4.5 大鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）炎癥細(xì)胞指標(biāo)測定 暴露大鼠氣管，夾閉左主支氣管，從測量呼吸剪開氣管端通過氣管中段小口將灌肺導(dǎo)管插入，每只大鼠緩慢注入5 mL 生理鹽水，收集大鼠BALF，使其回收率達(dá)到80%以上，對BALF進(jìn)行炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)。

4.6 大鼠肺組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 取大鼠肺臟，加入生理鹽水（質(zhì)量∶體積比=1∶9），勻漿獲得10%組織勻漿液，離心后取上清液，測定肺組織勻漿液中GSH-Px活性和MDA含量。

4.7 大鼠BALF 涂片染色 用瑞氏-姬姆薩染液對大鼠BALF進(jìn)行涂片染色。在載玻片表面涂上樣品，待其自然干燥，滴加瑞氏-姬姆薩染液（A液），讓染液覆蓋整個(gè)標(biāo)本染色1 min，再將染色緩沖液加于A 液上面（等量滴加），染色6 min，最后用流水沖洗染液，干燥，鏡檢。

4.8組織病理學(xué)檢查 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取大鼠右肺，置于10%多聚甲醛固定24 h，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE、Masson和彈性纖維染色。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大鼠 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖使用ELISAcalc 軟件進(jìn)行計(jì)算，擬合模型為logistic 曲線（四參數(shù)）。

結(jié) 果

1 氣管滴注對大鼠體重的影響

表1 顯示各組大鼠在實(shí)驗(yàn)期間體重的變化，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠體重均有所增長，其中正常組大鼠平均體重增長較PM2.5滴注組大鼠快，但無顯著差異。

表1 各組大鼠體重的變化Table 1. Changes in body weight of rats in each group（Mean±SD. n=7）

2 氣管滴注對大鼠呼吸指標(biāo)的影響

大鼠肺功能檢測結(jié)果見表2。與正常組大鼠對比，5 和10 mg/kg PM2.5滴注組大鼠呼吸頻率顯著增加（P＜0.05），肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性顯著下降（P＜0.05）。同時(shí)，10 mg/kg PM2.5滴注組大鼠呼吸指數(shù)顯著增加，最大吸氣流速顯著降低（P＜0.05）。

表2 PM2.5氣管滴注對大鼠肺功能的影響Table 2. Effect of tracheal infusion of PM2.5on lung function in rats（Mean±SD. n=7）

3 氣管滴注對大鼠血清炎癥指標(biāo)的影響

圖1 顯示氣管滴注PM2.5對大鼠血清中炎癥因子含量的影響。與正常組相比較，隨著PM2.5滴注濃度的升高，大鼠血清中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 含量隨之增加，其中5 mg/kg 和10 mg/kg PM2.5滴注組血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量顯著增高（P＜0.05）。

4 氣管滴注對大鼠BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

表3 顯示氣管滴注PM2.5對大鼠BALF 中炎癥細(xì)胞含量的影響。與正常組相比，2.5、5 和10 mg/kg PM2.5滴注組BALF 中白細(xì)胞和單核細(xì)胞比值均顯著增高（P＜0.05 或P＜0.01）。PM2.5滴注組顯著降低了大鼠BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞比值（P＜0.01）。與正常相比，PM2.5滴注對BALF 中淋巴細(xì)胞比值和中性粒細(xì)胞比值無顯著影響（P＞0.05）。

Figure 1. Effect of intratracheal instillation of PM2.5 on serum TNF-α（A），IL-1β（B）and IL-6（C）levels in rats. Mean±SD. n=7.*P＜0.05 vs control group.圖1 氣管滴注PM2.5對大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響

表3 PM2.5氣管滴注對大鼠BALF中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響Table 3. Effect of tracheal infusion of PM2.5 on inflammatory cell counts in BALF of rats（Mean±SD. n=7）

5 大鼠肺組織中氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)的檢測

圖2 顯示氣管滴注PM2.5對大鼠肺組織中抗氧化酶和脂質(zhì)過氧化的影響。結(jié)果顯示，與正常組相比較，PM2.5滴注濃度升高使大鼠肺組織中GSH-Px酶活力降低，5 mg/kg 和 10 mg/kg PM2.5滴注對 GSH-Px 酶活的降低作用顯著（P＜0.01）。PM2.5滴注對大鼠肺組織中MDA的含量無顯著影響（P＞0.05）。

Figure 2. Effect of intratracheal instillation of PM2.5 on the activity of GSH-Px（A）and the content of MDA（B）in rat lung tissues.Mean±SD. n=7.**P＜0.01 vs control group.圖2 氣管滴注PM2.5對大鼠肺組織中GSH-Px活力和MDA含量的影響

6組織學(xué)檢查結(jié)果

各組大鼠右肺經(jīng)HE、Masson 和彈力纖維染色顯示（圖3），隨著PM2.5滴注濃度的增加，可見大鼠支氣管管腔發(fā)生變形、支氣管上皮細(xì)胞排列紊亂，肺泡上皮細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤，見圖3A。Masson 染色顯示，5 mg/kg PM2.5滴注，肺組織纖維化程度增加，纖維組織表達(dá)增加（P＜0.05），見圖3B、4A。彈力纖維染色顯示，10 mg/kg PM2.5滴注，支氣管彈性纖維表達(dá)升高（P＜0.05），見圖3C、4B。

Figure 3. HE（A；scale bar=100 μm），Masson（B；scale bar=50 μm）and elastic fiber（C；scale bar=50 μm）staining of rat lung tissues. Black arrow：inflammatory cells；yellow arrow：fibrous tissue；red arrow：elastic fibers.圖3 大鼠肺臟HE、Masson和彈性纖維染色結(jié)果

Figure 4. The scores of Masson（A）and elastic fiber（B）staining of rat lung in each group. Mean±SD. n=7.*P＜0.05 vs control group.圖4 大鼠肺臟Masson和彈性纖維染色評分比較

7 大鼠BALF涂片染色結(jié)果

通過對大鼠BALF進(jìn)行涂片、染色、鏡檢，觀察到被染色的巨噬細(xì)胞（圖5A，紅色箭頭所指處）內(nèi)包含有黑色的PM2.5顆粒（圖5B，黑色箭頭所指處）。

討 論

當(dāng)前，以PM2.5為主要污染物的空氣污染受到廣泛關(guān)注。研究顯示，PM2.5是呼吸系統(tǒng)疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，PM2.5導(dǎo)致的COPD 已成為全球健康負(fù)擔(dān)［10］。建立合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是研究COPD 的基礎(chǔ)。目前COPD 的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，通常認(rèn)為有害顆粒與COPD 的發(fā)病有關(guān)。香煙煙霧是常見的室內(nèi)有害顆粒物，有報(bào)道采用單一煙霧暴露誘導(dǎo)或脂多糖/蛋白水解酶聯(lián)合煙霧暴露的方法構(gòu)造COPD 模型。以上方法常采用動(dòng)物自然吸入作為香煙煙霧的主要暴露方法，但該方法易造成動(dòng)物吸入劑量不準(zhǔn)確，且造模時(shí)間長［11］，文獻(xiàn)報(bào)道最長為40 周。而氣管滴注造模具有滴注劑量準(zhǔn)確和造模時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)。PM2.5是一種室外有害顆粒，流行病學(xué)調(diào)查顯示，PM2.5可導(dǎo)致COPD，故本文采用PM2.5暴露，將PM2.5配制成溶液對大鼠進(jìn)行氣管滴注，以提供與COPD發(fā)病病因相似的模型。本項(xiàng)工作所采用的非暴露式氣管滴注具有對動(dòng)物損傷小、可重復(fù)操作、染毒劑量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可有效提高模型的成功率。

Figure 5. The microscopic result of rat BALF（scale bar=50μm）. A：macrophages in rat BALF；B：PM2.5 particles in macrophages.Red arrow：macrophages；black arrow：PM2.5 particles.圖5 大鼠BALF鏡檢結(jié)果

COPD 模型的主要評價(jià)指標(biāo)為肺功能和肺組織病理改變。本研究采用Buxco PFT 動(dòng)物呼吸檢測儀測定大鼠肺功能的改變。呼吸頻率和潮氣量決定了每分鐘通氣量［12］，潮氣量越小，就需要增加呼吸頻率以保證足夠的通氣量。本研究顯示，PM2.5氣管滴注增加了大鼠的呼吸頻率，5 和10 mg/kg PM2.5滴注組大鼠呼吸頻率顯著增加。最大吸氣流速反映了吸氣肌的力量大小，最大吸氣流速減少提示吸氣肌收縮乏力。與空白組相比，10 mg/kg PM2.5氣管滴注顯著降低了大鼠的最大吸氣流速，提示PM2.5氣管滴注后大鼠吸氣肌疲勞。吸氣時(shí)間和呼氣時(shí)間可反映呼吸道阻塞情況，本研究中PM2.5氣管滴注尚未影響吸氣時(shí)間和呼氣時(shí)間。動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性受氣道阻力和肺組織彈性的影響，動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性降低提示氣道阻塞。本研究中，與空白組相比，2.5、5 和10 mg/kg PM2.5氣管滴注使大鼠的動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性均顯著降低，提示PM2.5經(jīng)氣管滴注增強(qiáng)了氣道阻力，降低了大鼠的肺通氣和換氣功能。病理學(xué)檢查結(jié)合肺功能測定對COPD 的評價(jià)更有意義。研究顯示，氣道重構(gòu)是COPD 主要的病理特征［13］。通過 HE、Masson 和彈性纖維染色觀察到，PM2.5滴注組大鼠氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管上皮細(xì)胞排列紊亂，氣道管腔變形，肺組織內(nèi)纖維組織和膠原纖維顯著增加，提示PM2.5氣管滴注導(dǎo)致了大鼠氣道重塑，而氣道重塑是COPD發(fā)展過程中氣道阻塞的病理生理基礎(chǔ)［14］。

炎癥和氧化應(yīng)激是PM2.5誘導(dǎo)COPD 的主要發(fā)病機(jī)制［15-16］，有害顆粒對氣道和肺組織可產(chǎn)生長期慢性炎癥。故本研究首先考察了血清和BALF 中炎癥指標(biāo)的改變。TNF-α 是機(jī)體最早分泌的細(xì)胞因子，是炎癥介質(zhì)連鎖反應(yīng)中最早啟動(dòng)的因子，也是很多炎癥反應(yīng)的中心介質(zhì)；IL-1β 是具有免疫調(diào)節(jié)功能的炎癥因子，當(dāng)機(jī)體受到感染時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的IL-1β；IL-6 是機(jī)體損傷和修復(fù)過程中產(chǎn)生的一種急性期反應(yīng)介質(zhì)，是一種炎癥反應(yīng)的早期指標(biāo)。本研究顯示PM2.5氣管滴注使大鼠血清中 TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量顯著增加。除此以外，我們還對BALF中的炎癥細(xì)胞進(jìn)行了分類和計(jì)數(shù)。本研究中PM2.5滴注組大鼠白細(xì)胞和單核細(xì)胞比值均增高（P＜0.05或P＜0.01）。PM2.5滴注組顯著降低了大鼠BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞比值，與空白組相比具有顯著差異（P＜0.01）。臨床研究顯示，嗜酸性粒細(xì)胞是慢性阻塞性肺病急性加重期的炎癥標(biāo)志物［17］，嗜酸性粒細(xì)胞減少可導(dǎo)致病原體清除障礙，降低機(jī)體正常的防御機(jī)制，COPD 患者的氣道阻塞情況更嚴(yán)重［18］。PM2.5表面攜帶的各種金屬元素和多環(huán)芳烴類可刺激肺上皮細(xì)胞釋放活性氧，增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)［19］。本研究中PM2.5氣管滴注使大鼠肺組織中GSH-Px酶活力顯著降低，提示PM2.5氣管滴注可致全身和局部炎癥反應(yīng)，并加重了大鼠肺組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)。巨噬細(xì)胞是肺組織內(nèi)直接與PM2.5顆粒相接觸的細(xì)胞，PM2.5粒徑小，部分可被巨噬細(xì)胞吞噬［20］。通過對滴注組大鼠BALF染色、鏡檢，可觀察到巨噬細(xì)胞內(nèi)包含PM2.5顆粒。

綜上所述，本研究采用大氣PM2.5氣管滴注構(gòu)建大鼠COPD 模型，該模型表現(xiàn)為大鼠肺功能降低、氣道重構(gòu)和炎癥等特征，符合COPD的病理生理特征。