發(fā)酵葛根與水提葛根的抗氧化活性與延緩線蟲衰老的作用研究

趙 丹，吳 迪，李 萌，王昌濤，張佳嬋，王冬冬

北京工商大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院 北京市植物資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048

葛根(Puerarialobata)為豆科葛屬植物的根，在我國(guó)分布廣泛。作為傳統(tǒng)的中藥材，葛根具有治療金瘡、解熱生津的作用，在《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草拾遺》《中國(guó)藥典》中均有記載[1,2]。隨著中藥理論的不斷完善，以及人們追求健康的意識(shí)不斷提高，許多藥食同源的植物被開發(fā)并制成飲料、保健食品。當(dāng)前研究具有抗衰老功效的植物很多，包括人參、葛根、沙棘、枸杞等[3]。其中葛根的抗衰老活性成分主要包含葛根異黃酮、葛根素、葛根多糖和生物堿。Zhou等[4]發(fā)現(xiàn)葛根素能夠顯著改善淀粉樣前體蛋白/早老蛋白-1小鼠的認(rèn)知障礙，降低腦組織中的氧化應(yīng)激水平，葛根異黃酮能夠增加大鼠血液和肝臟中抗氧化酶的活性，降低丙二醛的含量。Shao等[5]發(fā)現(xiàn)葛根多糖具有延長(zhǎng)線蟲壽命的功效。Li等[6]研究表明復(fù)方葛根片具有保護(hù)血管，抵抗氧化應(yīng)激損傷，減緩血管老化的作用。

為使葛根功效成分更好地被吸收利用，當(dāng)前葛根提取的方法多種多樣，如水浴提取[7]、超聲提取[8]、酶法提取[9]等。利用發(fā)酵技術(shù)對(duì)中草藥進(jìn)行提取，通過(guò)微生物代謝產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物與中藥成分共同作用可達(dá)到協(xié)同增效的效果，同時(shí)由于微生物胞外酶的作用，有助于中草藥活性成分的釋放[10]。

線蟲是研究衰老的典型模式生物，具有易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)周期短、進(jìn)化高度保守等特點(diǎn)，同時(shí)與人類基因的同源性較高，因此常用線蟲進(jìn)行抗衰老天然產(chǎn)物的篩選[11,12]。本文利用發(fā)酵法和水提法對(duì)葛根活性物質(zhì)進(jìn)行提取，并從抗氧化能力，對(duì)線蟲壽命、產(chǎn)卵、熱應(yīng)激的影響，探究葛根發(fā)酵液與葛根水提液的抗氧化與抗衰老功效。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃酒酵母，由實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌EscherichiacoliOP50、野生型秀麗隱桿線蟲由北京市農(nóng)林科學(xué)院提供。葛根，購(gòu)于北京同仁堂藥店。

七水硫酸鎂(批號(hào)：20170522)、無(wú)水氯化鈣(批號(hào)：20200817)、磷酸二氫鉀(批號(hào)：20190324)、膽固醇(批號(hào)：20180916)、氯化鈉(批號(hào)：20200415)、次氯酸鈉(20191008)、氫氧化鈉(批號(hào)：20180215)、葡萄糖(批號(hào)：20190713)、亞硝酸鈉(批號(hào)：20190602)、硝酸鋁(批號(hào)：20190421)、硫酸亞鐵(批號(hào)：20160613)、水楊酸(批號(hào)：20180527)、雙氧水(批號(hào)：20191120)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯酚(批號(hào)：20180821)、甲醇(批號(hào)：20180506)、濃硫酸(批號(hào)：20190615)購(gòu)自北京化工廠；蛋白胨(批號(hào)：20201102)、酵母浸粉(批號(hào)：20200713)購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；維生素C(批號(hào)：L2017033)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Trizol試劑(批號(hào)：S0147)，總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：S0119)、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：S0131S)購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；cDNA合成試劑盒(批號(hào)：011228)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器和設(shè)備

BXM-30R高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；TGL-20br高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；Multiskan FC酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾儀器公司)；Real-time PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；DQHZ-2001A恒溫震蕩培養(yǎng)箱(太倉(cāng)華美生化儀器廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葛根發(fā)酵液與水提液的制備

制備葛根水提液：取10 g葛根粉末加入200 mL去離子水，70 ℃水浴提取3 h，4 800 r/min離心30 min，取上清液，得到葛根水提液，使用0.22 μm濾膜過(guò)濾。

制備葛根發(fā)酵液：取10 g葛根粉末加入200 mL去離子水，121℃高壓滅菌，冷卻后，接種黃酒酵母，于28 ℃培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液于4 800 r/min離心30 min，得到上清液，使用0.22 μm濾膜備用。

1.2.2 活性成分檢測(cè)

黃酮含量檢測(cè)采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法，多酚檢測(cè)采用福林酚還原比色法[13]，葛根素含量檢測(cè)采用高效液相色譜法[14]。

1.2.3 抗氧化活性測(cè)試

1.2.3.1 總抗氧化能力檢測(cè)

取96微孔板，每孔加入20 μL過(guò)氧化氫酶工作液；標(biāo)準(zhǔn)曲線孔加入10 μL不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品檢測(cè)孔內(nèi)加入10 μL不同濃度的樣品；接著每孔加入170 μL ABTS工作液，混合均勻；室溫孵育6 min后于414 nm測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的總抗氧化能力。

1.2.3.2 羥自由基清除能力檢測(cè)

取0.5 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液于試管中，依次加入1 mL 0.15 mol/L PBS和0.5 mL蒸餾水，接著加入0.5 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液，混勻后加入0.01%雙氧水0.5 mL。37 ℃水浴1 h后，于536 nm測(cè)量吸光值測(cè)得數(shù)值為A1。

式中，A2為將蒸餾水代替雙氧水測(cè)得吸光度值；A樣品為樣品代替蒸餾水測(cè)得的吸光度。

1.2.3.3 超氧陰離子清除能力檢測(cè)

取0.05 mol/L 的Tris-HCl(pH 8.2)緩沖液2.25 mL于試管中，置于25 ℃水浴中預(yù)熱20 min；分別加入不同濃度的樣品0.05 mL和0.2 mL的25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混合均勻后于25℃水浴中反應(yīng)5 min；加入0.5 mL 8 mol/L鹽酸終止反應(yīng)，測(cè)量299 nm處吸光值，計(jì)算清除率?？瞻讓?duì)照組以0.05 mL試樣溶劑代替樣品。

式中，A1為空白的吸光度，A2為樣品的吸光度。

1.2.4 葛根發(fā)酵液和水提液對(duì)線蟲生長(zhǎng)及基因表達(dá)的影響

1.2.4.1 線蟲的培養(yǎng)及同期化

配制NGM培養(yǎng)基涂平板，待凝固后，向NGM平板加入200 μLE.coliOP50菌液并涂布均勻，將平板皿置于37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。將L4期線蟲轉(zhuǎn)移至NGM平板，20 ℃培養(yǎng)。

同期化線蟲的培養(yǎng)：選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的線蟲，用4.5 mL無(wú)菌水將其收集至離心管中。加入2 mL裂解液，每隔2 min渦旋振蕩一次，重復(fù)4～6次，至線蟲裂解完全。將裂解后的混合溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，3 000 r/min離心1 min，棄上清。再加入無(wú)菌水沖洗線蟲，離心后棄上清，重復(fù)3次。吸取離心管底部蟲卵，滴在涂有E.coliOP50的NGM平板無(wú)菌區(qū)，直至吹干，20 ℃培養(yǎng)48 h后受精卵發(fā)育成L4期線蟲，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)備用。

1.2.4.2 葛根水提液、葛根發(fā)酵液對(duì)線蟲壽命的影響

配制含有不同濃度樣品的平板，使葛根水提液、葛根發(fā)酵液在E.coliOP50菌液中的終濃度為1、5 μg/mL，對(duì)照組為M9緩沖液。將同期化后的線蟲挑至含有樣品的培養(yǎng)基中于20 ℃培養(yǎng)，每板30條線蟲，每組做三個(gè)平行。每天將線蟲挑至新的相應(yīng)培養(yǎng)皿中并記錄線蟲的存活和死亡數(shù)量，直到所有線蟲死亡。若線蟲刺激兩次無(wú)反應(yīng)，判斷其死亡。線蟲發(fā)生逃逸、干死、生殖道外翻，則被剔除。根據(jù)實(shí)驗(yàn)記錄數(shù)據(jù)制作線蟲壽命曲線。

1.2.4.3 葛根水提液、葛根發(fā)酵液對(duì)線蟲生殖能力的影響

配制含有葛根水提液、葛根發(fā)酵液的培養(yǎng)基，使得在E.coliOP50菌液中終濃度為5 μg/mL(壽命實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳濃度)，對(duì)照組為M9緩沖液。將同期化后的線蟲挑至平板中，每個(gè)平板1條線蟲，共10個(gè)平行，置于20 ℃培養(yǎng)。每天將線蟲挑至新的平板中，直至產(chǎn)卵期結(jié)束，統(tǒng)計(jì)每條線蟲的產(chǎn)卵量。

1.2.4.4 葛根水提液、葛根發(fā)酵液對(duì)線蟲抗熱應(yīng)激的影響

配制含有葛根水提液、葛根發(fā)酵液的培養(yǎng)基，使得在E.coliOP50菌液中終濃度為5 μg/mL(壽命實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳濃度)，對(duì)照組為M9緩沖液。將同期化線蟲挑至平板中，每板挑30條線蟲，共10個(gè)平行。置于35 ℃培養(yǎng)，開始計(jì)時(shí)為0 h。每隔2 h將線蟲快速取出，記錄存活和死亡數(shù)量。由于平板從培養(yǎng)箱取出，溫度發(fā)生變化會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，取出后即丟棄平板。

1.2.4.5 線蟲衰老相關(guān)基因檢測(cè)

配制含有葛根水提液、葛根發(fā)酵液的培養(yǎng)基，使得在E.coliOP50菌液中終濃度為5 μg/mL(壽命實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳濃度)，對(duì)照組為M9緩沖液。將同期化線蟲挑至平板中。每個(gè)平板30條線蟲，共3個(gè)平行組。每天將線蟲挑至新的平板中，培養(yǎng)5天后，將成蟲沖洗收集至離心管中，3 500 r/min離心1 min，棄去上清液后用M9緩沖液將秀麗隱桿線蟲重懸，于3 500 r/min離心1 min，重復(fù)三次。液氮速凍之后，保存于-80 ℃冰箱備用。使用Trizol法提取線蟲RNA。使用cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行熒光定量檢測(cè)?；蛞镄蛄幸姳?。

表1 基因引物序列表

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)均做三個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)分析使用SPSS statistics 軟件。兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多重比較使用單因素ANOVA，顯著性標(biāo)準(zhǔn)：*P<0.05，**P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根發(fā)酵液與水提液成分分析

葛根富含異黃酮類成分，包含葛根素、大豆苷元和大豆苷等[15]。如表2所示經(jīng)過(guò)發(fā)酵，葛根發(fā)酵液(fermented broth ofP.lobata，F(xiàn)BP)與葛根水提液(aqueous extract ofP.lobata，AEP)活性成分有明顯區(qū)別，其中總黃酮含量有較大增加，增加率約為38.3%，總酚含量降低，葛根素含量增加4.51%。這可能是由于發(fā)酵過(guò)程中微生物代謝產(chǎn)生的酶將植物細(xì)胞壁分解，有助于功效成分的釋放[16]，從而使葛根發(fā)酵液中葛根素和黃酮含量增加。

表2 樣品成分含量

2.2 葛根發(fā)酵液與水提液的抗氧化功效

2.2.1 葛根水提液、葛根發(fā)酵液的總抗氧化能力的檢測(cè)

如圖1a所示，當(dāng)葛根發(fā)酵液體積濃度低于5%時(shí)，葛根水提液的總抗氧化能力較高，隨著濃度的增加，相同體積濃度的葛根發(fā)酵液總抗氧化能力高于葛根水提液，當(dāng)體積濃度為20%時(shí)葛根發(fā)酵液的總抗氧化能力最強(qiáng)，約與1.62 mmol/L Trolox標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)。因此葛根水提液、葛根發(fā)酵液均具有一定的抗氧化能力，且在高濃度時(shí)葛根發(fā)酵液的總抗氧化能力更強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照為Vc，其總抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1b，200 μg/mL Vc的總抗氧化能力為0.86 mmol/L，與6.67%的葛根發(fā)酵液相近。

圖1 不同樣品的總抗氧化能力

2.2.2 葛根水提液、葛根發(fā)酵液對(duì)羥自由基清除能力的檢測(cè)

如圖2a所示，葛根水提液與葛根發(fā)酵液對(duì)羥自由基的清除能力呈劑量相關(guān)。當(dāng)體積濃度低于5%以內(nèi)時(shí)，兩者清除羥自由基的能力接近，當(dāng)體積濃度在6.67%～20%之間時(shí)，葛根發(fā)酵液清除羥自由基的能力大幅增加。葛根發(fā)酵液與葛根水提液清除超氧陰離子的IC50分別為5.66%、11.35%。因此兩種發(fā)酵液均具有良好的清除羥自由基的能力，且葛根發(fā)酵液在高體積濃度時(shí)清除羥自由基的能力更強(qiáng)。陽(yáng)性對(duì)照Vc對(duì)羥自由基的清除作用與濃度呈正相關(guān)，如圖2b所示，Vc清除羥自由基的IC50為39.32 μg/mL。

圖2 不同樣品對(duì)羥自由基的清除作用

2.2.3 葛根水提液、葛根發(fā)酵液對(duì)超氧陰離子清除能力的檢測(cè)

如圖3a所示，當(dāng)樣品體積濃度在4%～20%時(shí)，葛根發(fā)酵液清除超氧陰離子能力始終高于葛根水提液，當(dāng)體積濃度達(dá)到20%時(shí)，葛根發(fā)酵液、葛根水提液對(duì)超氧陰離子清除率分別為97.5%、82.5%。葛根發(fā)酵液和水提液清除超氧陰離子的IC50分別為4.21%和6.68%。陽(yáng)性對(duì)照Vc清除超氧陰離子的效果如圖3b所示，其對(duì)超氧陰離子的清除能力與作用濃度呈正相關(guān)，IC50為23.8 μg/mL。

圖3 不同樣品對(duì)超氧陰離子的清除作用

2.3 葛根發(fā)酵液與水提液延緩線蟲衰老的功效

2.3.1 葛根水提液、葛根發(fā)酵液對(duì)線蟲壽命的影響

葛根水提液、葛根發(fā)酵液對(duì)線蟲壽命的影響如表3所示。1 μg/mL葛根發(fā)酵液作用組線蟲的平均壽命為14.56±1.01天，最大壽命為26.39±1.44天，均高于對(duì)照組。5 μg/mL葛根發(fā)酵液作用線蟲的平均壽命為17.38±1.08天，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，最大壽命為30.82±1.61天，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。葛根水提液實(shí)驗(yàn)組中，與對(duì)照組相比，1 μg/mL和5 μg/mL實(shí)驗(yàn)組線蟲的平均壽命和最大壽命均無(wú)顯著性差異。由此可知，5 μg/mL葛根發(fā)酵液能夠顯著延緩線蟲的衰老，增加線蟲的壽命。

表3 葛根水提液、葛根發(fā)酵液對(duì)線蟲壽命的影響

由線蟲的生存曲線可以得知，實(shí)驗(yàn)的第1天至第8天，線蟲均處于良好的生存狀態(tài)，運(yùn)動(dòng)靈活。從第8天開始線蟲開始出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象，其運(yùn)動(dòng)緩慢，感應(yīng)外部刺激能力降低，5 μg/mL葛根發(fā)酵液延長(zhǎng)線蟲壽命效果均優(yōu)于1 μg/mL(見圖4)。

圖4 葛根發(fā)酵液和水提液對(duì)線蟲存活率的影響

2.3.2 葛根水提液、葛根發(fā)酵液對(duì)線蟲生殖能力的影響

線蟲的產(chǎn)卵能力和線蟲的生長(zhǎng)發(fā)育狀況有關(guān)，通常線蟲長(zhǎng)至成蟲才能產(chǎn)卵[17]。葛根發(fā)酵液、葛根水提液對(duì)線蟲生殖能力的影響如表4所示。實(shí)驗(yàn)選用延長(zhǎng)線蟲壽命較為顯著的5 μg/mL為作用濃度，統(tǒng)計(jì)線蟲第1天至第5天的產(chǎn)卵量。葛根水提液作用后，線蟲的總產(chǎn)卵量為262.27±17.25個(gè)，與對(duì)照組相比，產(chǎn)卵量變少，減少率為9.54%，但變化并不顯著。葛根發(fā)酵液作用后，線蟲的總產(chǎn)卵量為303.85±20.16個(gè)，與對(duì)照組相比，增加率為4.8%，產(chǎn)卵量顯著增加(P<0.05)。有衰老理論認(rèn)為，壽命的延長(zhǎng)以生殖減少或喪失為代價(jià)[18]，但是葛根發(fā)酵液在延長(zhǎng)線蟲壽命的同時(shí)并未對(duì)線蟲的生殖造成損傷。

表4 葛根水提液、葛根發(fā)酵液對(duì)線蟲生殖的影響

2.3.3 葛根水提液、葛根發(fā)酵液對(duì)線蟲抗熱應(yīng)激的影響

由圖5和表5可知，葛根水提液作用線蟲后，線蟲的平均耐熱時(shí)間為24.03±1.08 h，與對(duì)照組相比增加率為5.72%，最長(zhǎng)耐熱時(shí)間為38.33±3.67 h，最長(zhǎng)耐熱時(shí)間增加率為11.1%。葛根發(fā)酵液作用線蟲后，線蟲的平均耐熱時(shí)間為25.57±1.26 h，最長(zhǎng)耐熱時(shí)間為39.04±2.35 h，與對(duì)照組相比，平均耐熱和最長(zhǎng)耐熱時(shí)間均顯著延長(zhǎng)(P<0.05)，分別增加12.49%和13.16%。

表5 葛根水提液、葛根發(fā)酵液對(duì)線蟲耐熱時(shí)間的影響

圖5 熱應(yīng)激條件下葛根發(fā)酵液和水提液對(duì)線蟲存活率的影響

2.3.4 葛根發(fā)酵液對(duì)線蟲衰老相關(guān)基因的表達(dá)的影響

秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑Insulin/IGF對(duì)于線蟲的衰老的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵性作用[19]。此通路中的daf-2基因是線蟲衰老的關(guān)鍵基因，發(fā)育過(guò)程中daf-2通過(guò)抑制daf-16表達(dá)從而影響線蟲的壽命[20-22]。hsp-16.2和sod-3基因是位于daf-16的下游效應(yīng)因子，在線蟲受到外界熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激時(shí)，daf-16會(huì)在這些逆境信號(hào)的刺激下迅速向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，進(jìn)而誘導(dǎo)這些下游效應(yīng)元件的高表達(dá)，以此抵抗外界脅迫造成的壓力[23-25]。由圖6可知葛根發(fā)酵液能夠顯著增加線蟲體內(nèi)daf-16(P<0.05)、hsp-16.2(P<0.01)、sod-3(P<0.01)的表達(dá)量，同時(shí)下調(diào)daf-2表達(dá)。由此說(shuō)明，在熱應(yīng)激條件下，葛根發(fā)酵液作用下的線蟲可能通過(guò)抑制daf-2的表達(dá)，促進(jìn)daf-16進(jìn)入細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄，從而促使daf-16下游基因sod-3、hsp-16.2的表達(dá)，其中sod-3基因表達(dá)量上調(diào)顯著，表明線蟲在葛根發(fā)酵液的作用下超氧化物歧化酶過(guò)量表達(dá)，因此能夠更加高效的清除線蟲體內(nèi)的活性氧和自由基，進(jìn)而延長(zhǎng)線蟲壽命。

圖6 葛根發(fā)酵液和對(duì)線蟲基因表達(dá)的影響

3 討論與結(jié)論

葛根作為藥食兩用的中草藥，具有清除自由基、退熱生津、預(yù)防心腦血管疾病等功效，其中葛根黃酮類和異黃酮類物質(zhì)是其主要功效成分，具有良好的抗氧化性。本文通過(guò)發(fā)酵和水提兩種方式對(duì)葛根的活性成分進(jìn)行提取，比較發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)發(fā)酵得到的提取液中黃酮含量為4.8±0.32 mg/mL，顯著高于水提法得到的黃酮含量3.47±0.23 mg/mL(P<0.01)，發(fā)酵法提取獲得的葛根素含量略高、總酚含量略低，但是均無(wú)顯著性差異。為進(jìn)一步對(duì)兩種提取液的抗氧化和抗衰老效果進(jìn)行評(píng)估，首先采用3種體外的自由基的清除模型對(duì)提取物的抗氧化能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示6.8%體積濃度的葛根發(fā)酵液在總抗氧化能力、對(duì)羥自由基和超氧陰離子的清除能力均強(qiáng)于葛根水提液，葛根發(fā)酵液抗氧化效果更佳。

線蟲作為衰老的模式生物，廣泛用于中藥提取物延緩衰老的評(píng)價(jià)。將發(fā)酵液與葛根水提液分別作用于秀麗隱桿線蟲，在正常培養(yǎng)條件下與對(duì)照組相比，葛根發(fā)酵液能夠顯著延長(zhǎng)線蟲的壽命(P<0.05)，在熱應(yīng)激條件下，葛根發(fā)酵液培養(yǎng)的線蟲耐熱時(shí)間顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)表明葛根發(fā)酵液在延長(zhǎng)線蟲壽命的同時(shí)不以犧牲線蟲的產(chǎn)卵為代價(jià)，其產(chǎn)卵量高于葛根水提液組?；驒z測(cè)結(jié)果顯示葛根發(fā)酵液通過(guò)下調(diào)促衰老基因daf-2，上調(diào)抗衰老基因daf-16、抗氧化基因sod-3以及熱應(yīng)激基因hsp-16.2的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)高溫的耐受性以及更高的抗氧化能力，從而實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)線蟲壽命的作用，葛根發(fā)酵液延長(zhǎng)線蟲壽命作用機(jī)制見圖7。

圖7 葛根發(fā)酵液延長(zhǎng)線蟲壽命作用機(jī)制示意圖

Zhang等[26]將葛根黃酮喂食線蟲的存活率顯著高于對(duì)照組。Shao[5]研究顯示葛根水提多糖作用能夠保護(hù)線蟲抵御熱應(yīng)激損傷，同時(shí)增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力，延長(zhǎng)線蟲壽命。Jeon[27]研究結(jié)果表明葛根素對(duì)結(jié)腸炎小鼠有抗炎和抗氧化功效。由此可知葛根發(fā)酵液延緩線蟲衰老的功效是由發(fā)酵液中黃酮、多糖、葛根素等多種物質(zhì)共同作用的結(jié)果。結(jié)合本課題組此前研究結(jié)果[28]，葛根水提液中總糖含量(3.46±0.18 mg/mL)高于葛根發(fā)酵液(2.52±0.5 mg/mL)，但是葛根水提液在延緩線蟲衰老效果并不顯著。推斷葛根發(fā)酵液中的主要功效成分黃酮在延緩線蟲衰老方面起關(guān)鍵作用。

本課題組[28]從生化水平和細(xì)胞水平對(duì)葛根水提液與葛根發(fā)酵液的抗氧化和抗衰老功效進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示葛根發(fā)酵液在生化水平具有良好的清除DPPH自由基的效果，并能增加成纖維細(xì)胞中抗氧化酶活性，促進(jìn)膠原蛋白的表達(dá)。為了更加全面地評(píng)價(jià)其抗氧化功效，本篇文章在生化水平補(bǔ)充了葛根兩種提取液對(duì)羥自由基、超氧陰離子的清除效果以及總抗氧化能力水平的測(cè)試。由于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的局限性，為進(jìn)一步對(duì)葛根發(fā)酵液的抗衰老效果進(jìn)行驗(yàn)證，本篇文章使用衰老模式生物秀麗隱桿線蟲作為研究對(duì)象，從動(dòng)物水平檢測(cè)了葛根發(fā)酵液延緩線蟲壽命的效果和機(jī)制，因此更具備參考價(jià)值。結(jié)果表明葛根發(fā)酵液具有良好的抗氧化效果以及延緩線蟲衰老的作用，其通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路Insulin/IGF中關(guān)鍵基因的表達(dá)發(fā)揮抗衰老功效。以上結(jié)果可為葛根發(fā)酵液在抗衰老食品、化妝品領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供一定的參考。