牡荊素對(duì)1型糖尿病小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性及相關(guān)基因表達(dá)的影響

張澤鵬，徐興軍，劉佳人，張偉偉，邵淑麗

齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，齊齊哈爾 161006

牡荊素(vitexin)是一種在山楂中含量很高的黃酮類化合物[1]，具有明確的抗炎、抑制脂肪氧化酶等多種藥理活性作用[2]。其化學(xué)分子式為C21H20O10，分子量為432.377 5，呈黃色粉末狀。

Yuan等[3]研究表明，牡荊素通過Sirt1/p53信號(hào)通路保護(hù)乙醇誘導(dǎo)的肝損傷。Chen等[4]報(bào)道牡荊素可通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化抑制結(jié)腸炎相關(guān)的小鼠癌變；國外也有研究發(fā)現(xiàn)[5]，白癜風(fēng)與氧化應(yīng)激有關(guān)，牡荊素可激活MAPK-Nrf2/ARE通路，進(jìn)而保護(hù)黑色素細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，從而改善白癜風(fēng)癥狀。Wang等[6]發(fā)現(xiàn)牡荊素可經(jīng)過抑制HMGB1的釋放緩解脂多糖誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞損傷。還有研究[7]表明了牡荊素能夠抑制小腸刷狀緣的α-葡萄糖苷酶，從而減少碳水化合物的分解和吸收。研究和開發(fā)牡荊素具有重要的意義。

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，其患病率在全球逐年增長，現(xiàn)已成為第四位需要優(yōu)先考慮的疾病[8]。血糖濃度過高會(huì)引起機(jī)體代謝紊亂，導(dǎo)致組織損傷和功能障礙[9]。糖尿病根據(jù)體內(nèi)胰島素水平可分為1型和2型，其中，1型糖尿病的發(fā)病原因是胰島β細(xì)胞被破壞，導(dǎo)致胰島素分泌嚴(yán)重不足[10]，使肝糖原不能作為直接能源物質(zhì)被分解和利用。當(dāng)機(jī)體維持生命活動(dòng)所需能量供應(yīng)不足時(shí)，體內(nèi)中性脂肪分解，分解產(chǎn)物主要為游離脂肪酸，游離脂肪酸含量過高會(huì)增加活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的生成。1型糖尿病患者由于體內(nèi)ROS含量過多，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激反應(yīng)是指體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)不足以平衡促氧化的狀態(tài)，是自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的消極作用，對(duì)所有生物的生命活動(dòng)都具有嚴(yán)重的影響，甚至可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、器官組織變性以及癌癥的發(fā)生。由于胰島β細(xì)胞抗氧化酶含量較低，對(duì)ROS更為敏感，被ROS攻擊會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能損傷，胰島β細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)一步引起胰島β細(xì)胞功能衰竭，最終導(dǎo)致糖尿病的形成[11]。2型糖尿病患者體內(nèi)具備產(chǎn)生胰島素的能力，甚至胰島素含量多于正常個(gè)體。

本研究以不同劑量的牡荊素連續(xù)灌胃1型糖尿病小鼠4周，檢測小鼠血清和肝臟中SOD、GSH-PX、T-AOC、MDA酶活性，利用qRT-PCR方法檢測小鼠肝臟組織中抗氧化基因銅鋅超氧化物歧化酶(SOD-1)、錳超氧化物歧化酶(SOD-2)、谷胱甘肽過氧化物酶-1(GPX-1)、谷胱甘肽過氧化物酶-4(GPX-4)的mRNA的相對(duì)表達(dá)量，從酶學(xué)及基因水平研究其對(duì)小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性及抗氧化基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠84只(22.00 ± 2.00)g，購自長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(吉)-2020-0001。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

牡荊素(南京道斯夫生物科技有限公司，98%，批號(hào)：200713M)；鏈脲佐菌素(STZ，上海懋康生物科技有限公司，批號(hào)：MS1601)；BCA蛋白定量試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)：CR2101016)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(合肥萊爾生物科技有限公司，批號(hào)：20191022)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：B012010020)。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

7220G可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋DK-S26(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)；DYY-7C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；BS124S電子天平(德國賽多利斯股份公司)；TSE-240(-80 ℃)超低溫冰箱(賽默飛世爾科技公司)；TS-DI-20L/H實(shí)驗(yàn)室超純水設(shè)備(陶氏水處理設(shè)備工程有限公司)；Applied biosystems PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；三諾血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司，GA-3型)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥

實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，測定小鼠初始血糖及體質(zhì)量，按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對(duì)照組、水模型對(duì)照組、DMSO模型對(duì)照組、牡荊素高劑量組(以下簡稱高牡組)、牡荊素中劑量組(以下簡稱中牡組)、牡荊素低劑量組(以下簡稱低牡組)、陽性對(duì)照組，每組12只，組間體質(zhì)量差異不顯著。各模型組小鼠按150 mg/kg腹腔注射濃度為1%的鏈脲佐菌素，構(gòu)建1型糖尿病小鼠模型，空白對(duì)照組注射等量的檸檬酸鈉溶液，注射前禁食12 h，注射后可自由飲食、飲水，并于注射72 h后測定小鼠空腹血糖濃度，小鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L，造模成功[12,13]。模型制備成功后，每天定時(shí)灌胃，設(shè)置灌胃梯度劑量[14]，高牡組、中牡組、低牡組分別灌胃40、20、10 mg/kg的牡荊素，陽性對(duì)照組灌胃300 mg/kg的鹽酸二甲雙胍，DMSO模型對(duì)照組灌胃DMSO，水模型對(duì)照組及空白對(duì)照組灌胃等量蒸餾水。各組小鼠自由飲食、飲水，自然光照，室溫下灌胃4周。

1.2.2 生化指標(biāo)檢測

末次灌胃結(jié)束后，小鼠禁食禁水12 h后，各組小鼠摘眼球取血后脫頸處死，用試劑盒法測定各組動(dòng)物血清及肝臟中SOD、MDA、T-AOC、GSH-PX含量水平，用試劑盒法測定小鼠血清和肝臟組織中SOD、GSH-PX、T-AOC酶活性。

1.2.3 抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)測定

引物根據(jù)Collin[15]和Bult[16]設(shè)計(jì)(見表1)，由上海生物工程有限公司進(jìn)行合成。qRT-PCR反應(yīng)體系見表2。

表1 引物信息

表2 qRT-PCR反應(yīng)體系

利用Trizol法提取各組小鼠肝臟的總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并作為模板。

按照表2的反應(yīng)體系，以肝臟cDNA為模板，GAPDH引物為內(nèi)參，使用熒光定量PCR進(jìn)行測定，兩步法流程：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸30 s，重復(fù)上述，循環(huán)40次，循環(huán)結(jié)束后檢測其溶解曲線，計(jì)算2-△△Ct。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 牡荊素對(duì)1型糖尿病小鼠血糖的影響

不同劑量牡荊素對(duì)1型糖尿病小鼠血糖的影響見表3。實(shí)驗(yàn)期間，DMSO對(duì)照組和水模型對(duì)照組小鼠血糖濃度持續(xù)上升，各牡荊素實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組小鼠血糖濃度總體呈下降趨勢。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各牡荊素實(shí)驗(yàn)組小鼠血糖均極顯著低于DMSO模型對(duì)照組和水模型對(duì)照組(P<0.01)，并且中牡組和低牡組與陽性對(duì)照組相比組間差異不顯著(P>0.05)。

表3 不同劑量牡荊素對(duì)1型糖尿病小鼠血糖的影響

2.2 牡荊素對(duì)1型糖尿病小鼠血清中SOD、T-AOC、GSH-PX和MDA的影響

不同劑量牡荊素對(duì)1型糖尿病小鼠血清中SOD、T-AOC、GSH-PX和MDA的影響見表4。小鼠血清中各牡荊素實(shí)驗(yàn)組SOD和T-AOC酶活性極顯著高于空白對(duì)照組、DMSO模型對(duì)照組和水模型對(duì)照組(P<0.01)，GSH-PX酶活性極顯著高于DMSO模型對(duì)照組和水模型對(duì)照組(P<0.01)，MDA含量極顯著低于DMSO模型對(duì)照組和水模型對(duì)照組(P<0.01)。

表4 不同劑量牡荊素對(duì)1型糖尿病小鼠血清中SOD、T-AOC、GSH-PX和MDA的影響

2.3 牡荊素對(duì)1型糖尿病小鼠肝臟中SOD、T-AOC、GSH-PX和MDA的影響

不同劑量牡荊素對(duì)1型糖尿病小鼠肝臟中SOD、T-AOC、GSH-PX和MDA的影響見表5。小鼠肝臟中各牡荊素實(shí)驗(yàn)組SOD、T-AOC、GSH-PX酶活性均極顯著高于DMSO模型對(duì)照組和水模型對(duì)照組(P<0.01)，其中T-AOC酶活性極顯著高于陽性對(duì)照組(P<0.01)；各牡荊素實(shí)驗(yàn)組MDA含量比DMSO模型對(duì)照組和水模型對(duì)照組極顯著降低(P<0.01)。

表5 不同劑量牡荊素對(duì)1型糖尿病小鼠肝臟中SOD、T-AOC、GSH-PX和MDA的影響

2.4 牡荊素對(duì)1型糖尿病小鼠體內(nèi)抗氧化基因相對(duì)表達(dá)量的影響結(jié)果

不同劑量牡荊素對(duì)1型糖尿病小鼠體內(nèi)抗氧化基因相對(duì)表達(dá)量的影響結(jié)果見圖1、2。小鼠肝臟中各牡荊素實(shí)驗(yàn)組SOD-1、SOD-2、GPX-1、GPX-4基因的表達(dá)量均極顯著高于DMSO模型對(duì)照組和水模型對(duì)照組(P<0.01)，其中中牡組SOD-2和GPX-4基因表達(dá)量與陽性對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。

圖1 不同劑量牡荊素對(duì)Ⅰ型糖尿病小鼠SOD-1基因和SOD-2基因的表達(dá)

圖2 不同劑量牡荊素對(duì)1型糖尿病小鼠GPX-1和GPX-4基因的表達(dá)

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)牡荊素能降低1型糖尿病小鼠血糖濃度，明顯增強(qiáng)總抗氧化能力T-AOC，顯著增加SOD、GSH-PX的酶活性及相關(guān)基因的表達(dá)，極顯著降低MDA含量。

血糖是身體細(xì)胞、組織、器官重要的能量來源[17]。Ayeh等[18]研究表明，槲皮素具有降糖作用。也有研究表明，魚腥草總黃酮能降低1型糖尿病小鼠的血糖。上述研究均表明黃酮類化合物具有降糖作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，牡荊素可降低1型糖尿病小鼠血糖濃度，與上述研究結(jié)果相一致。胰島素是體內(nèi)唯一降糖激素[19]，通過其含量可判斷糖尿病病變程度。糖尿病患者體內(nèi)自由基含量多于正常個(gè)體，過多的自由基攻擊胰島β細(xì)胞使胰島素含量嚴(yán)重不足，導(dǎo)致葡萄糖無法被利用，使得糖尿病患者體內(nèi)血糖濃度上升。牡荊素之所以能夠降低1型糖尿病小鼠血糖濃度，其原因可能是牡荊素可清除體內(nèi)自由基，抑制自由基對(duì)胰島β細(xì)胞的攻擊，從而減少胰島素含量的下降，增加葡萄糖的利用率，從而達(dá)到降血糖的作用，體內(nèi)葡萄糖含量降低。

高糖狀態(tài)下可升高機(jī)體氧化應(yīng)激，增加體內(nèi)自由基含量，下調(diào)抗氧化能力。由于心臟代謝活性很高，抗氧化能力很低，所以更容易造成氧化損傷，糖尿病患者體內(nèi)一氧化氮合酶(NOS)和NO含量顯著增加或是糖尿病心肌病產(chǎn)生的原因之一。氧化應(yīng)激可通過多種途徑改變血流動(dòng)力學(xué)，對(duì)腎臟造成損傷，造成腎功能異常。過多的自由基會(huì)攻擊胰島β細(xì)胞造成胰腺損傷，并隨著體內(nèi)自由基含量的增多，胰島β細(xì)胞逐漸減少，胰島素含量下降，導(dǎo)致機(jī)體抑制肝糖原分解的能力下降，使肝糖原含量降低，故而造成肝臟損傷，除此之外，過多的自由基還會(huì)增加炎癥因子含量，使機(jī)體免疫力降低，造成脾臟損傷的同時(shí)也會(huì)造成肺臟損傷。牡荊素對(duì)各器官具有保護(hù)作用的原因可能是牡荊素可抑制體內(nèi)自由基的產(chǎn)生，減少NOS和NO含量，從而起到保護(hù)心臟的作用，自由基的減少還可削弱對(duì)胰島β細(xì)胞的攻擊，保護(hù)胰腺并增加胰島素含量，使葡萄糖利用率提高，抑制肝糖原糖異生，使肝糖原含量得到有效提高，從而起到保護(hù)肝臟的效果。由于體內(nèi)自由基含量的減少，體內(nèi)的炎癥因子含量也逐漸減少，降低了炎癥因子對(duì)肺臟的攻擊，由于機(jī)體免疫力逐漸恢復(fù)，參與免疫調(diào)節(jié)的脾臟也得到了很好的改善?？寡趸芰Φ玫接行嵘?，氧化應(yīng)激降低，血流動(dòng)力學(xué)得到改善，從而降低腎臟的損傷。

目前研究顯示，糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其重要的發(fā)病機(jī)制為活性氧自由基積累使機(jī)體抗氧化能力下降[20]。Luo等[21]研究表明，牡荊素可抑制自由基生成。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，牡荊素均能顯著提高血清和肝臟中SOD、GSH-PX以及T-AOC酶活性，并降低MDA含量，其原因可能有以下幾個(gè)方面，一是自由基能與牡荊素中的酚羥基發(fā)生反應(yīng)，生成半琨式自由基，由于其性質(zhì)較穩(wěn)定，自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)被終止，機(jī)體抗氧化能力提高。二是自由基過多會(huì)引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使MDA含量增加，牡荊素可抑制脂質(zhì)過氧化，從而降低血清和肝臟中MDA的含量，提高機(jī)體抗氧化作用。三是在細(xì)胞中存在Fenton反應(yīng)(Fe2++ H2O2→Fe3++·OH+·OH-)，牡荊素可與Fe2+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，絡(luò)合位點(diǎn)在4-羰基和5-羥基之間，絡(luò)合Fe2+可有效減少·OH的生成，形成絡(luò)合物沉淀，減少自由基，提高機(jī)體抗氧化能力。牡荊素可提高1型糖尿病小鼠肝臟和血清中SOD、GSH-PX以及T-AOC的酶活性，降低MDA含量，使機(jī)體抗氧化能力得到有效提高。抗氧化酶的抗氧化作用與其基因表達(dá)密切相關(guān)。

機(jī)體氧化程度超出氧化物清除能力，氧化和抗氧化系統(tǒng)穩(wěn)定性被破壞，造成氧化損傷[22]。低水平氧化應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體的抗氧化蛋白在抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant-response element，ARE)或親電反應(yīng)元件(electrophilic response element，EpRE)的順式作用元件介導(dǎo)下被激活。ARE可從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控抗氧化酶對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)下的反應(yīng)[23]。正常生理情況下，核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)相結(jié)合于胞漿中，活性被抑制，在泛素蛋白酶作用下降解，以保持在生理狀態(tài)下Nrf2的低轉(zhuǎn)錄活性[24]，當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下時(shí)，原本相結(jié)合的Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，活化了的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核后與小Maf蛋白形成二聚體，進(jìn)而識(shí)別并結(jié)合ARE元件，啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄，機(jī)體抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄活性因此被提高，故而平衡機(jī)體氧化損傷[25]。

在本實(shí)驗(yàn)中，1型糖尿病小鼠經(jīng)牡荊素灌胃4周后，肝臟中SOD-1、SOD-2、GPX-1及GPX-4四種抗氧化基因的表達(dá)量均有極顯著提升，其原因可能有兩方面，一方面可能由于1型糖尿病小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激較為嚴(yán)重，使機(jī)體抗氧化系統(tǒng)不足以平衡自由基的攻擊，導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重氧化損傷，機(jī)體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)不足以清除自由基，牡荊素不但可消除體內(nèi)自由基，亦可與金屬離子發(fā)生絡(luò)合作用，減少自由基和金屬離子對(duì)細(xì)胞的氧化損傷，促進(jìn)Nrf2的核內(nèi)轉(zhuǎn)位，增加Nrf2的表達(dá)，進(jìn)而增加1型糖尿病小鼠肝臟中SOD-1、SOD-2、GPX-1及GPX-4基因的表達(dá)量。另一方面可能由于1型糖尿病小鼠SOD、GSH-PX、T-AOC酶活性降低，導(dǎo)致體內(nèi)自由基增加，造成細(xì)胞氧化損傷，引起線粒體系統(tǒng)供能不足以及DNA、RNA轉(zhuǎn)錄受阻，使患病小鼠肝臟中抗氧化基因的表達(dá)量極顯著降低。由于牡荊素具有清除體內(nèi)自由基的作用，灌胃后，小鼠細(xì)胞中DNA、RNA轉(zhuǎn)錄得到改善，使1型糖尿病小鼠肝臟中SOD-1、SOD-2、GPX-1及GPX-4基因的表達(dá)量得到提高。Deng等[26]研究表明，槲皮素可激活乙醇孵育的人原代肝細(xì)胞中Nrf2的核轉(zhuǎn)位表達(dá)。Ganesan等[27]研究表明，牡荊素通過激活β細(xì)胞調(diào)節(jié)凋亡的關(guān)鍵蛋白，包括NF-κB和Nrf2，從而改善胰島素分泌。以上研究結(jié)果均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

結(jié)果表明，牡荊素能極顯著提高1型糖尿病小鼠血清和肝臟中SOD、GSH-PX以及T-AOC酶活性，降低MDA含量；顯著上調(diào)1型糖尿病小鼠肝臟中SOD-1、SOD-2、GPX-1、GPX-4基因的表達(dá)量。綜上，牡荊素可改善1型糖尿病氧化損傷，具有良好的抗氧化作用。