表面活性劑對(duì)陜北富油煤微生物降解的影響

蔡昕原　申文盛　馬麗　劉向榮　吳燕　趙順省　楊再文

摘要：利用金雀兒根瘤蒼白桿菌對(duì)陜北李家畔富油煤進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)。通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)得到了最優(yōu)工藝條件為：加煤量為0.7 g/50 mL，接種量為20 mL/50 mL，降解時(shí)間為18 d，降解率為17.1%。在最優(yōu)工藝條件下研究十二烷基硫酸鈉（SDS）、直鏈烷基苯磺酸鹽（LAS）和聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）3種表面活性劑對(duì)煤樣生物降解率的影響，結(jié)果表明SDS不能促進(jìn)菌種對(duì)煤樣的降解，LAS和Triton X-100對(duì)降解過(guò)程有促進(jìn)作用，其中Triton X-100增加效果最為明顯，降解率提高至34.1%。GC-MS顯示降解液相產(chǎn)物的主要成分為烷烴類(lèi)、羧酸類(lèi)、酯類(lèi)和芳香類(lèi)等小分子物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：富油煤;金雀兒根瘤蒼白桿菌;微生物降解;表面活性劑;正交試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)：TD 849.2;TQ 536文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-9315（2022）02-0317-07

DOI：10.13800/j.cnki.xakjdxxb.2022.0216開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effects of surfactants on microbial degradation of

tar-rich coals from northern ShaanxiCAI Xinyuan SHEN Wensheng MA Li LIU Xiangrong WU Yan ZHAO Shunsheng YANG Zaiwen（1.College of Chemistry and Chemical? Engineering，Xian University of Science and Technology，Xian 710054，China;

2.Key Laboratory of Coal Resources Exploration and Comprehensive Utilization of MNR，Xian 710021，China）Abstract：Ochrobactrum cytisi was selected to degrade tar-rich coals from Northern Shaanxi.The optimal process conditions were obtained by single factor experiments and orthogonal experiments.The best degrading technological conditions were coal amount of 0.7 g/50 mL，inoculum size of 20 mL/50 mL，incubation time of 18 d and the biodegradation rate reaching 17.1%.Under the best technological conditions，the effects of SDS，LAS and Triton X-100 on biodegradation rates of coal samples were investigated.The results showed that SDS could not promote the degradation of coal samples by bacteria，while LAS and Triton X-100 could promote the degradation process.The increase of Triton X-100 was the most obvious with the degradation rate being 34.1%.GC-MS showed that the degradation liquid products under the action of Triton X-100 mainly contained small molecular substances such as alkanes，carboxylic acids，esters and aromatics.

Key words： tar-rich coal;ochrobactrum cytisi;microbial degradation;surfactant;orthogonal experiments

0引言

富油煤的焦油產(chǎn)率大于7%，主要賦存于中低階煤類(lèi)中，是一種寶貴的煤基油氣資源[1-2]。目前主要采用傳統(tǒng)的熱轉(zhuǎn)化方式提取焦油和其他高附加值化學(xué)品，但熱轉(zhuǎn)化技術(shù)因設(shè)備復(fù)雜、能耗高、污染大等原因，未能在工業(yè)上大規(guī)模利用[3-5]。

FAKOUSSA和COHEN認(rèn)為微生物能在煤上生長(zhǎng)，并產(chǎn)生黑色液體，這意味著微生物可將煤由固相轉(zhuǎn)化為液相，分離并加工成精細(xì)化學(xué)品和液體燃料等[6-7]。煤的微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程通常在常溫、常壓下進(jìn)行，條件溫和、能耗低、設(shè)備簡(jiǎn)單，被認(rèn)為是煤炭綠色轉(zhuǎn)化的途徑之一[8-13]。但是，微生物對(duì)煤的降解率低限制了其在工業(yè)上的推廣[14-16]。影響煤降解率的因素有煤種、菌種、煤的預(yù)處理方法、降解方式、添加表面活性劑等，其中添加適合的表面活性劑是一種較為有效的方法[17]。YIN等利用表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）改善了菌種對(duì)煤的吸附，提高了撫順褐煤的微生物溶解度[18]。袁紅莉等發(fā)現(xiàn)斜臥青霉P6分泌的生物表面活性劑可以促進(jìn)褐煤的液化[19]。POLMAN和STRANDBERG等研究表明，煤、表面活性劑與菌種的相互作用是微生物增溶的主要原因，表面活性劑不直接溶解煤[20-21]。筆者也進(jìn)行了相關(guān)探索實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)表面活性劑直鏈烷基苯磺酸鹽（LAS）和聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）均能提高神木褐煤的微生物降解率，其中Triton X-100的作用效果最好，使降解率提高到61.9%[22]。因此，深入研究表面活性劑在微生物降解煤過(guò)程中的促進(jìn)作用，將會(huì)推動(dòng)煤生物降解的工業(yè)化進(jìn)程。

筆者利用金雀兒根瘤蒼白桿菌降解陜北富油煤，通過(guò)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)探究了加煤量、接種量、降解時(shí)間對(duì)微生物降解煤樣的影響，得到最佳降解工藝條件。選擇三種表面活性劑SDS，LAS和Triton X-100，研究添加表面活性劑后，金雀兒根瘤蒼白桿菌對(duì)陜北富油煤降解能力的變化規(guī)律和降解液相產(chǎn)物的組成。

1實(shí)驗(yàn)

1.1煤樣

實(shí)驗(yàn)所選的煤樣是陜北李家畔富油煤。將煤樣進(jìn)行破碎、研磨、篩分，選取0.25～0.5 mm煤樣（原煤）。用硝酸對(duì)煤樣進(jìn)行氧化預(yù)處理（氧化煤）[23]。煤樣經(jīng)硝酸預(yù)處理后，灰分含量較原煤減少，揮發(fā)分較原煤增加，氧含量明顯增加，硫含量減少（表1），與文獻(xiàn)報(bào)道一致[24]，這有利于微生物對(duì)煤的降解。

1.2菌株與培養(yǎng)基

所用菌種為金雀兒根瘤蒼白桿菌對(duì)低階煤有較好的降解性[23]。菌種購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC），編號(hào)為：23890，采用營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行菌種培育[15]。

1.3工藝條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

1.3.1微生物降解實(shí)驗(yàn)

將20 mL液體培養(yǎng)基接入150 mL錐形瓶，加入煤樣，滅菌冷卻后接入菌種，于30 ℃，160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，中間不斷取樣將菌絲與煤樣分離，測(cè)定煤樣降解效果?？偱囵B(yǎng)時(shí)間為20 d，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2降解效果評(píng)價(jià)和降解率計(jì)算

1）降解效果評(píng)價(jià)[25]。培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)黑色降解液離心，過(guò)濾，以去離子水為參比，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定黑色降解液在450 nm處的吸光度（A450），通過(guò)A450的值來(lái)對(duì)微生物降解煤的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，A450值越大，表明降解效果越好。

2）降解率計(jì)算。降解結(jié)束將煤樣與培養(yǎng)液和菌絲分離，80 ℃烘干測(cè)定未降解煤樣（剩煤）質(zhì)量，然后計(jì)算降解率η，即

η=（m₁-m₂）/m₁×100%

式中η為降解率，%;m₁為起始加入的煤樣質(zhì)量，g;m₂為細(xì)菌作用后剩煤質(zhì)量，g。

1.3.3單因素試驗(yàn)

在1.3.1實(shí)驗(yàn)條件下，分別研究加煤量（0.3，0.5，0.7，0.9 g/50 mL）、接種量（5，10，15，20，25，30 mL）、降解時(shí)間（3，6，9，12，15，18 d）對(duì)煤樣降解效果的影響。

1.3.4正交試驗(yàn)

利用L9（3×3）正交設(shè)計(jì)表，對(duì)金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤樣的工藝條件進(jìn)行正交設(shè)計(jì)。取加煤量、接種量和降解時(shí)間3個(gè)因素，各因素分為3個(gè)水平，各因素間的交互作用不作考慮（表2）。

1.4表面活性劑對(duì)微生物降解煤過(guò)程的影響

在單因素、正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上獲得微生物降解煤樣的最佳工藝，在同等實(shí)驗(yàn)條件下，滅菌前加入50 mL濃度為0，100，200，300，400，500，600，700，800，900 mg/L的SDS液體，研究不同濃度SDS對(duì)降解率的影響。測(cè)定經(jīng)離心處理后的液相降解產(chǎn)物的A450值。采用同樣實(shí)驗(yàn)方法研究LAS，Triton X-100對(duì)微生物降解煤樣的影響。

1.5降解液相產(chǎn)物分析

依據(jù)1.4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定出對(duì)金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤起最大促進(jìn)作用的表面活性劑，通過(guò)離心分離得到在最優(yōu)表面活性劑添加下的降解液相產(chǎn)物，再利用3種不同極性的有機(jī)溶劑甲苯、二氯甲烷和乙酸乙酯萃取，最后采用安捷倫7890A/5975C型氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行液相產(chǎn)物的組成分析。

2結(jié)果與討論

2.1工藝條件優(yōu)化

2.1.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

加煤量、接種量和降解時(shí)間對(duì)降解液吸光度的影響分別如圖1、圖2和圖3所示。隨著加煤量增加，降解液的A450值先增加后降低，加煤量為0.5 g/50 mL時(shí)，A450值達(dá)到最大（圖1）。原因可能是加煤量小于0.5 g/50 mL，菌體生存環(huán)境好，能有效降解煤樣;而加煤量大于0.5 g/50 mL，細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境變差，生長(zhǎng)繁殖受限，不能很好地以煤為碳源生長(zhǎng)。

隨著接種量的增大，A450值先增大后趨于穩(wěn)定（圖2），接種量為15 mL/ 50 mL時(shí)，A450值達(dá)到最大，再增加接種量時(shí)，A450值變化甚微。這是因?yàn)槊簶颖砻媸枪潭ǖ?，?dāng)接種量達(dá)到15 mL/ 50 mL時(shí)，煤樣與菌種接觸面達(dá)到飽和，新增加菌種不能與煤接觸，降解效果變化甚微。

培養(yǎng)時(shí)間為15 d時(shí)，降解液A450值達(dá)到最大，15 d后波動(dòng)較小（圖3）。原因可能是菌種生存依賴(lài)于培養(yǎng)基，降解時(shí)間超過(guò)15 d時(shí)，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分耗盡，菌種停止代謝，煤樣不能繼續(xù)降解。

2.1.2正交試驗(yàn)結(jié)果分析

金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤樣的3個(gè)影響因素A，B，C對(duì)應(yīng)極差R分別為0.272，0.034，0.056，即A>C>B，可以得出加煤量（因素A）對(duì)降解效果影響最大，降解時(shí)間（因素C）次之，接種量（因素B）相對(duì)較小。此外，因素A所對(duì)應(yīng)A450值的3個(gè)均值K₁，K₂，K₃最大值為0.436，因素B為0.309，因素C為0.319，得出最佳工藝為A₃B₃C₃。即加煤量為0.7 g/50 mL，接種量為20 mL/50 mL，降解時(shí)間為18 d（表3），此時(shí)降解效果最好，降解率為17.1%。

2.2表面活性劑對(duì)微生物降解煤的影響

隨著3種表面活性劑濃度的增大，SDS作用下降解液A450值變小，LAS作用下降解液A450值先增加后趨平，Triton X-100作用下降解液A450值與LAS作用趨勢(shì)類(lèi)似（圖4）。表明SDS對(duì)金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤樣具有抑制作用，而LAS和Triton X-100具有促進(jìn)作用。

在Triton X-100作用下降解液A450值大于同濃度LAS試驗(yàn)組，Triton X-100加入濃度為800 mg/L時(shí)，降解液A450值達(dá)到最大值，微生物降解煤樣效果最好。Triton X-100加入后降解率為34.1%，比空白組增加了將近一倍（表4）。

康紅麗等研究SDS，LAS和Triton X-100對(duì)金雀兒根瘤蒼白桿菌生長(zhǎng)過(guò)程的影響（圖5）所示[22]。在不加表面活性劑時(shí)，金雀兒根瘤蒼白桿菌在第1天的生長(zhǎng)速率最快，2 d時(shí)就達(dá)到了生長(zhǎng)的最高峰，這意味者該細(xì)菌在2 d內(nèi)的降解能力較強(qiáng)，尤其是第1天，細(xì)菌的活性和降解能力更強(qiáng)。當(dāng)添加LAS和Triton X-100后，細(xì)菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本沒(méi)變，也就是說(shuō)LAS和Triton X-100基本不影響細(xì)菌的生長(zhǎng)。但是，添加SDS后，金雀兒根瘤蒼白桿菌在起始期的生長(zhǎng)基本被抑制，2 d后才快速生長(zhǎng)，錯(cuò)過(guò)了其降解煤的最佳時(shí)間。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上佐證了圖4的結(jié)論。

2.3表面活性劑作用下微生物降解煤樣液相產(chǎn)物分析相對(duì)其他2種表面活性劑，TritonX-100對(duì)于對(duì)金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤的促進(jìn)作用最大，并且當(dāng)Triton X-100加入濃度為800 mg/L時(shí)，降解率最大（圖4、表4），因此，選取此時(shí)的降解液相產(chǎn)物，分別用甲苯、二氯甲烷和乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取物主要組成見(jiàn)表5～表7。甲苯萃取液相產(chǎn)物檢測(cè)到24種化合物，相對(duì)分子量在134～422之間，組成為烷烴類(lèi)物質(zhì)（72.57%），芳香化合物（14.99%），羧酸類(lèi)、酯類(lèi)（12.44%）（表5）。二氯甲烷萃取液相產(chǎn)物共檢測(cè)出22種化合物，相對(duì)分子量在142～437之間，萃取物中主要含有烷烴類(lèi)（93.10%）和酯類(lèi)（5.76%），其中8號(hào)（二十五烷）含量為18.34%，14號(hào)（正二十七烷）含量為11.29%，16號(hào)（二十二烷）含量為16.41%（表6）。由表7可知乙酸乙酯萃取液相產(chǎn)物共檢測(cè)到11種化合物，相對(duì)分子量在142～390之間，鄰苯二甲酸二丁酯的含量高達(dá)71.03%?？傊鹑竷焊錾n白桿菌降解煤樣的液相產(chǎn)物種類(lèi)比較豐富，含有烷烴、羧酸類(lèi)、酯類(lèi)、芳香化合物，相對(duì)分子量在134～437之間。烷烴類(lèi)物質(zhì)是常用的工業(yè)燃料，二十二烷、二十五烷可制作潤(rùn)滑劑和防腐劑，鄰苯二甲酸二丁酯可用于硝化纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯等的增塑劑。

目前文獻(xiàn)報(bào)道表明SDS，LAS和Triton X-100都能降低微生物菌種和煤接觸時(shí)的界面張力，有利于菌種降解煤[18-22]。然而文中SDS對(duì)于金雀兒根瘤蒼白桿菌的起始生長(zhǎng)期抑制作用較大，降解率表現(xiàn)出降低的現(xiàn)象。因此，表面活性劑對(duì)于煤的微生物降解的影響取決于表面活性劑對(duì)于煤和微生物界面張力的影響以及對(duì)于微生物生長(zhǎng)的影響，是這兩方面綜合的結(jié)果。另外，表面活性劑雖然能夠促進(jìn)煤和微生物的相互吸附，影響微生物的生長(zhǎng)和分泌物的數(shù)量，對(duì)于煤的降解速率和產(chǎn)率影響較大，但不能改變煤的結(jié)構(gòu)和微生物分泌物的組成，對(duì)于煤微生物降解產(chǎn)物的組成影響不大。3結(jié)論

1）金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤樣過(guò)程中加煤量對(duì)降解效果影響最大，降解時(shí)間次之，菌液用量影響最小。加煤量為0.7 g/50 mL，接種量20 mL/50 mL，降解時(shí)間為18 d，降解效果最好，降解率為17.1%。

2）SDS對(duì)金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤樣有抑制作用，LAS和Triton X-100有促進(jìn)作用，Triton X-100增加效果最為明顯，降解率為34.1%。

3）金雀兒根瘤蒼白桿菌對(duì)煤樣的降解液相產(chǎn)物種類(lèi)比較豐富，含有烷烴、羧酸類(lèi)、酯類(lèi)、芳香化合物，相對(duì)分子量在134～437之間。利用微生物降解富油煤制備精細(xì)化學(xué)品，是富油煤清潔高效利用的有效途徑之一。

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