基于二代測(cè)序技術(shù)的常染色體隱性遺傳性多囊腎病家系胚胎植入前遺傳學(xué)分析

何天文， 盧 建， 陳創(chuàng)奇， 劉 頓， 丁紅珂， 劉 玲， 杜 麗， 鄭毅春， 尹愛華

（1.廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511442；2.廣東省婦幼保健院生殖中心，廣東 廣州 511442）

常染色體隱性遺傳性多囊腎?。╝utosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD）是一種罕見的常染色體隱性遺傳的單基因病，致病基因?yàn)槎嗄夷I/多囊肝病變1（polycystic kidney and hepatic disease 1，PKHD1）基因[1]。ARPKD在臨床上比較罕見，發(fā)病率僅為1/40 000～1/20 000，以腎臟和肝臟為主要累及器官，臨床表型為雙側(cè)腎臟均勻?qū)ΨQ性增大，并常伴有肝脾腫大、肝硬化及膽管擴(kuò)張等癥狀，多數(shù)患兒于圍產(chǎn)期或嬰幼兒時(shí)即發(fā)病死亡[2-3]。ARPKD發(fā)病早、預(yù)后極差，目前臨床尚無(wú)根治的辦法，主要通過(guò)植入前遺傳學(xué)檢測(cè)（preimplantation genetic testing，PGT）或產(chǎn)前診斷預(yù)防ARPKD患兒的出生。近年來(lái)，二代測(cè)序[又稱下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）]技術(shù)飛速發(fā)展，測(cè)序成本不斷降低，應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。NGS的準(zhǔn)確性好、精度高，目前已經(jīng)成為胚胎PGT的主要方法之一，能檢測(cè)染色體非整倍性、染色體結(jié)構(gòu)異常和單基因遺傳病[4-5]。國(guó)內(nèi)外運(yùn)用NGS技術(shù)對(duì)ARPKD家系進(jìn)行PGT的報(bào)道較少，目前僅發(fā)布了《應(yīng)用胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)阻斷常染色體顯性多囊腎病遺傳的中國(guó)專家共識(shí)》[6]。為此，本研究對(duì)1個(gè)ARPKD家系進(jìn)行PKHD1基因測(cè)序，在明確PKHD1基因致病突變的情況下，運(yùn)用NGS技術(shù)對(duì)胚胎PKHD1基因突變位點(diǎn)進(jìn)行直接測(cè)序，并構(gòu)建胚胎PKHD1基因突變位點(diǎn)連鎖單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)單倍型，為胚胎PTG和ARPKD產(chǎn)前診斷提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

先證者父親（Ⅰ1）：35歲，表型正常，既往體健。先證者母親（Ⅰ2）：33歲，表型正常，既往體健，G2P1A2，2012年8月剖宮產(chǎn)一足月女（先證者）；2016年12月孕8周胚胎停育，藥物流產(chǎn)，未對(duì)絨毛進(jìn)行相關(guān)基因檢測(cè)。先證者（Ⅱ1）：女，5歲，因血尿、蛋白尿以及B超顯示腎臟有多發(fā)性囊狀改變、肝臟囊性病變進(jìn)行遺傳性腎病相關(guān)基因檢測(cè)，外院檢測(cè)結(jié)果顯示PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G雙重雜合突變，見圖1。為了避免再次妊娠ARPKD患兒，該夫婦于2017年8月在廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心和生殖醫(yī)學(xué)中心就診咨詢要求行PGT。向該夫婦充分解釋PGT過(guò)程及相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)后，該夫婦簽署知情同意書并接受PGT。本研究經(jīng)廣東省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

圖1 ARPKD家系圖

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及基因組DNA提取 采集先證者父母和先證者的靜脈血各2 mL，乙二胺四乙酸抗凝，采用磁珠法血液基因組提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取外周血基因組DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。PGT后，先證者母親于孕18～24周時(shí)在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水10 mL。采用Qiamp DNA Blood Mini Kit（德國(guó)Qigen公司）提取羊水基因組DNA，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提取操作。

1.2.2 Sanger測(cè)序調(diào)查家系成員PKHD1基因突變情況 采用Oligo6軟件（美國(guó)Oligo公司）設(shè)計(jì)針對(duì)PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變位點(diǎn)的特異性聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增引物。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序儀器為ABI3730遺傳分析儀（美國(guó)ABI公司）。采用SeqMan軟件進(jìn)行序列分析，觀察PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G的突變情況。

1.2.3 構(gòu)建父母雙方和先證者SNP單倍型 以PKHD1基因編碼區(qū)為目標(biāo)區(qū)域，在該基因上下游2M區(qū)域內(nèi)選擇120個(gè)高密度緊密連鎖的SNP作為遺傳連鎖標(biāo)記，在Ion AmpliSeq Designer網(wǎng)站（https：//www.ampliseq.com）上設(shè)計(jì)多重PCR引物。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、建庫(kù)、NGS后，選擇有效SNP位點(diǎn)構(gòu)建先證者父母和先證者的SNP單倍型，連鎖分析后確定先證者父母攜帶PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變的風(fēng)險(xiǎn)染色體。

1.2.4 胚胎培養(yǎng)及胚胎活檢 常規(guī)促排卵取卵后，采用卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）方式進(jìn)行授精，受精后轉(zhuǎn)入分裂期胚胎培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)第3、5、6天觀察胚胎發(fā)育情況。胚胎發(fā)育第3天時(shí)用激光脈沖在透明帶上切割出1個(gè)直徑約20 μm的裂口，將胚胎轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。胚胎發(fā)育第5天、第6天時(shí)觀察到囊胚形成且脫出裂口滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)為2～9個(gè)時(shí)進(jìn)行活檢。用活檢針吸取脫出裂口的滋養(yǎng)層細(xì)胞，在磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）液滴中清洗后轉(zhuǎn)入PCR反應(yīng)管中。對(duì)活檢的囊胚編號(hào)后進(jìn)行玻璃化冷凍處理，待遺傳學(xué)檢測(cè)完成后再行解凍移植。

1.2.5 胚胎PGT 對(duì)活檢獲得的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行基于等溫多重置換擴(kuò)增（multiple displacement amplification，MDA）技術(shù)的全基因組擴(kuò)增。全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)多重PCR擴(kuò)增PKHD1基因編碼區(qū)和高密度緊密連鎖的SNP。多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化和建庫(kù)后進(jìn)行NGS。采用NGS對(duì)胚胎PKHD1基因突變位點(diǎn)進(jìn)行直接測(cè)序，構(gòu)建PKHD1基因突變連鎖SNP單倍型并進(jìn)行連鎖分析。采用Sanger測(cè)序驗(yàn)證胚胎PKHD1基因突變位點(diǎn)的NGS結(jié)果。針對(duì)正常和雜合攜帶的胚胎進(jìn)行低深度的染色體非整倍性篩查，以排除攜帶染色體拷貝數(shù)異常的胚胎。

1.2.6 胚胎移植和產(chǎn)前診斷 選擇未檢測(cè)到突變且發(fā)育良好的整倍體胚胎于凍融胚胎周期進(jìn)行移植。胚胎移植14 d后查血人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）確定是否妊娠；胚胎移植4周后行經(jīng)陰道B超確定是否臨床妊娠。孕18～24周時(shí)行羊膜腔穿刺，進(jìn)行染色體核型分型和PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變產(chǎn)前診斷，以驗(yàn)證PGT結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 ARPKD家系成員攜帶PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G.突變情況

Sanger測(cè)序結(jié)果顯示，ARPKD家系成員中，父親攜帶PKHD1基因c.5935G＞A，為雜合子；母親攜帶PKHD1基因c.10058T＞G，為雜合子；先證者攜帶PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G雙重雜合突變，分別遺傳自父親和母親。見圖2。

圖2 先證者及其父母PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變Sanger測(cè)序圖

2.2 先證者父母和先證者的SNP單倍型

以PKHD1基因編碼區(qū)為目標(biāo)區(qū)域，在上下游2M區(qū)域內(nèi)選擇120個(gè)高密度緊密連鎖的SNP位點(diǎn)作為遺傳連鎖標(biāo)記。經(jīng)過(guò)多重PCR和NGS檢測(cè)后，選擇69個(gè)有效SNP位點(diǎn)構(gòu)建先證者父母和先證者的SNP單倍型，確定先證者父母攜帶PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變的風(fēng)險(xiǎn)染色體。見表1。

表1 先證者父母有效SNP位點(diǎn)數(shù)和分布

2.3 植入前遺傳學(xué)診斷

培養(yǎng)第5天觀察到5個(gè)胚胎達(dá)到活檢標(biāo)準(zhǔn)，即對(duì)囊胚進(jìn)行活檢和胚胎玻璃化冷凍保存，將活檢產(chǎn)物標(biāo)記為D501、D502、D503、D504和D505，每個(gè)樣本活檢細(xì)胞數(shù)為2～9個(gè)。采用NGS對(duì)胚胎PKHD1基因突變位點(diǎn)進(jìn)行直接測(cè)序、胚胎單倍型連鎖分析，同時(shí)采用Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，5個(gè)胚胎中，D501和D502未檢測(cè)到突變，D503和D505攜帶PKHD1基因c.5935G＞A突變（雜合子），D504攜帶PKHD1基因c.10058T＞G突變（雜合子）。見表2、圖3。

圖3 胚胎單倍型連鎖分析結(jié)果

表2 5個(gè)胚胎PKHD1基因c.472C＞T突變NGS和Sanger測(cè)序結(jié)果

對(duì)5個(gè)胚胎進(jìn)行低深度染色體非整倍體篩查，結(jié)果顯示，D501、D503和D505為整倍體胚胎，D502和D504為非整倍體胚胎。見表3。

表3 胚胎PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變PGT結(jié)果

2.4 等位基因脫扣率（allele drop-out，ADO）分析

5個(gè)活檢胚胎的PKHD1基因致病突變位點(diǎn)c.5935G＞A（chr6：51799094）和c.10058T＞G（chr6：51609281）未發(fā)生脫扣。根據(jù)5個(gè)活檢胚胎的2個(gè)致病突變位點(diǎn)和69個(gè)SNP位點(diǎn)的脫扣等位基因數(shù)得出復(fù)合ADO率為0.81%。

2.5 胚胎移植及產(chǎn)前診斷

囊泡活檢后，在第3個(gè)月經(jīng)周期行囊胚解凍移植。參考PGT結(jié)果選擇遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果為未檢測(cè)到突變且發(fā)育良好的整倍體胚胎（D501）進(jìn)行移植。移植14 d后檢測(cè)外周血hCG為陽(yáng)性，移植50 d后經(jīng)陰道超聲檢查見單個(gè)孕囊，大小為34 mm×22 mm，胚芽長(zhǎng)9 mm，可見心管搏動(dòng)。孕18周經(jīng)羊膜腔穿刺產(chǎn)前診斷結(jié)果顯示，胎兒染色體核型分型無(wú)異常，未檢測(cè)到PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變（圖4），與PGT結(jié)果一致。孕38周順產(chǎn)一正常嬰兒，健康狀況良好。

圖4 胎兒PKHD1基因c.5935和c.10058位點(diǎn)的Sanger測(cè)序

3 討論

ARPKD是一種罕見的常染色體隱性遺傳的單基因病，致病基因?yàn)镻KHD1基因。PKHD1基因是目前所知人類ARPKD的唯一致病基因，定位于人類染色體6p21，約為472 kb，包含67個(gè)外顯子，編碼1個(gè)由4 074個(gè)氨基酸組成的單次跨膜受體樣蛋白——纖維素蛋白[7-8]。PKHD1基因以編碼區(qū)的點(diǎn)突變致病為主，非編碼區(qū)突變、大片段缺失、重復(fù)或重排只是致病原因的極少數(shù)。目前，基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.humgen.rwth-aachen.de）中報(bào)道的PKHD1突變種類已達(dá)748種，其中約60%為錯(cuò)義突變，40%為截短突變（無(wú)義突變、剪切突變和移碼突變）[9]，其中c.107C＞T（p.Thr36Met）和c.9689delA（p.Asp3230ValfsX9）是相對(duì)常見的突變，約占20%[10-11]。PKHD1基因發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致該蛋白結(jié)構(gòu)或功能異常，從而影響腎臟集合系統(tǒng)及肝臟膽管系統(tǒng)發(fā)育及成熟。ARPKD以腎臟和肝臟為主要受累器官，臨床表型為雙側(cè)腎臟均勻?qū)ΨQ性增大，并常伴有肝脾腫大、肝硬化及膽管擴(kuò)張等癥狀，多數(shù)患兒于圍產(chǎn)期或嬰幼兒時(shí)即發(fā)病死亡。ARPKD與大多數(shù)單基因疾病一樣，尚無(wú)有效的根治方法。攜帶PKHD1基因突變的夫婦每次生育下一代都有25%的概率患ARPKD，通過(guò)產(chǎn)前診斷雖然可以防止ARPKD患兒的出生，但是絨毛活檢、羊水穿刺、臍帶血穿刺等傳統(tǒng)的介入性產(chǎn)前診斷技術(shù)具有創(chuàng)傷性，孕婦有一定的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。如果通過(guò)傳統(tǒng)的介入性產(chǎn)前診斷確診胎兒為ARPKD，則攜帶PKHD1突變基因的夫婦就需要選擇終止妊娠。因此，在胚胎植入前進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)，并選擇正常胚胎進(jìn)行移植，可以避免妊娠ARPKD胚胎，從而阻斷PKHD1基因突變?cè)诩蚁抵械膫鬟f。同時(shí)還可以對(duì)胚胎進(jìn)行低深度的染色體非整倍體篩查，以排除攜帶染色體拷貝數(shù)異常的胚胎，避免選擇非整倍體胚胎而導(dǎo)致的流產(chǎn)。因此，PGT與傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)[11-12]。

由于每個(gè)胚胎活檢所得細(xì)胞數(shù)很少，提取的DNA量達(dá)不到分子檢測(cè)所需的水平，需要通過(guò)全基因組擴(kuò)增的方法來(lái)擴(kuò)增基因組DNA?；贛DA技術(shù)的全基因組擴(kuò)增技術(shù)[13]不但克服了單細(xì)胞水平分子檢測(cè)DNA模板量過(guò)少的問(wèn)題，也極大地提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和單細(xì)胞水平基因檢測(cè)的可靠性，但全基因組擴(kuò)增技術(shù)會(huì)增加檢測(cè)結(jié)果擴(kuò)增不均勻或等位基因脫扣的風(fēng)險(xiǎn)[14]。NGS將單堿基測(cè)序成本降至了最低，也給PGT帶來(lái)了革命性的改變[15]。有學(xué)者應(yīng)用基于微衛(wèi)星連鎖分析的方法進(jìn)行多囊腎病的PGT[16]，相比之下，通過(guò)NGS完成植入前檢測(cè)的時(shí)間周期更短、更高效。與傳統(tǒng)的PGT技術(shù)，如熒光原位雜交和比較基因組雜交等相比，NGS具有明顯優(yōu)勢(shì)，目前已逐漸成為PGT的主要檢測(cè)方法[17]。本研究以PKHD1基因編碼區(qū)為目標(biāo)區(qū)域，在上下游2M區(qū)域內(nèi)選擇120個(gè)高密度緊密連鎖的SNP作為遺傳連鎖標(biāo)記，選擇了69個(gè)有效SNP位點(diǎn)構(gòu)建先證者父母的單倍型，確定其攜帶PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變的風(fēng)險(xiǎn)染色體，減少了基因重組或全基因組擴(kuò)增脫扣導(dǎo)致的檢測(cè)結(jié)果錯(cuò)誤。本研究統(tǒng)計(jì)了5個(gè)活檢胚胎的2個(gè)致病突變位點(diǎn)和69個(gè)SNP位點(diǎn)的脫扣等位基因數(shù)，得出復(fù)合ADO率為0.81%。

綜上所述，本研究成功應(yīng)用NGS技術(shù)對(duì)ARPKD家系進(jìn)行PGT，阻斷了該單基因病在該家系中的再次發(fā)生，避免了選擇非整倍體胚胎而導(dǎo)致的流產(chǎn)問(wèn)題，是ARPKD出生缺陷的有效預(yù)防方法。