報(bào)道一條具有pH敏感解吸附特征的羥基磷灰石結(jié)合肽序列*

鄧 鑫， 李瑛傑，2， 魏 蔚， 楊 焰， 馬凈植， 謝三祥△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，武漢 430030 2華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院口腔科，深圳 518000

羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)是人類骨組織和牙齒等天然硬組織組成部分中最穩(wěn)定的磷酸鈣，其具有優(yōu)異的理化、生物性能，能與有機(jī)成分特異性結(jié)合[1]。而羥基磷灰石結(jié)合肽(hydroxyapatite binding peptides，HABPs)是指能識(shí)別并結(jié)合于HAP表面的生物活性肽。不少研究通過(guò)噬菌體展示技術(shù)鑒定HABPs，并研究其體外結(jié)合親和力[2-3]。眾所周知，HAP主要由Ca2+、PO43-組成，具有兩性離子的特征，靜電引力是導(dǎo)致HAP與蛋白質(zhì)之間發(fā)生吸附最主要的一種作用力，而蛋白質(zhì)分子往往帶有一定量的電荷，所以pH值是一項(xiàng)重要的生理環(huán)境參數(shù)，對(duì)蛋白質(zhì)在HAP表面的吸附具有重要影響[4]。我們前期通過(guò)噬菌體展示技術(shù)淘選目標(biāo)HABPs時(shí)獲得了一系列理想的HAP結(jié)合序列，因體外合成成品HABPs成本高、周期長(zhǎng)，我們嘗試?yán)肕13噬菌體作為載體以噬菌體展示狀態(tài)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本文報(bào)道了其中一條與HAP特異性結(jié)合力較好且解吸附特征對(duì)外界環(huán)境pH值改變敏感的HABPs序列YSLHWGE(YSL)，利用這種特質(zhì)可結(jié)合抗菌藥物制備口腔植入物的表面涂層，其可隨著口腔唾液pH值改變釋放抗菌藥物，起到控制牙菌斑的效果，具有一定的臨床應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料

羥基磷灰石生物陶瓷HAP(四川大學(xué)生物材料工程研究中心)；X射線衍射儀(德國(guó)Bruker AXS，D8-Focus)；倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS，TH4-200，日本TOKYO)；搖床(天呈，T-100C)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏，DNP-9082)；生物安全柜(蘇州智凈，BHC1300 ⅡA/B2型)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華，HH-4)；超聲波清洗機(jī)(新芝生物科技股份有限公司，SB-3200DTD)；pH計(jì)(奧豪斯，STARTER3100)。

1.2 羥基磷灰石生物陶瓷HAP物相鑒定

采用X射線衍射(X-ray diffraction，XRD)對(duì)HAP樣本進(jìn)行物相分析。將試樣磨成粉末，取適量制樣后放置于X射線衍射儀的載物臺(tái)上，連續(xù)掃描得到相對(duì)強(qiáng)度隨著2θ變化的分布曲線，測(cè)試結(jié)果與羥基磷灰石的標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較分析。

1.3 單克隆噬菌體儲(chǔ)液的制備及其展示肽序列的測(cè)定

利用噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)對(duì)HAP進(jìn)行篩選，經(jīng)多輪生物淘選和選擇、噬菌體擴(kuò)增獲得多組具有不同底物親和力的多肽序列，其中YSLHWGE(YSL)通過(guò)滴定測(cè)量回收后的噬菌體數(shù)量顯示對(duì)HAP的結(jié)合親和力較高用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取目標(biāo)序列(YSL)和隨機(jī)序列VTDSKPK(VTD)甘油存樣各1 μL，梯度稀釋到合適的倍數(shù)，于IPTG/Xgal藍(lán)白篩選平板上培養(yǎng)。取單個(gè)藍(lán)色噬菌斑進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)試擴(kuò)增液滴度并提取噬菌體DNA測(cè)序(QIAprep Spin M13，New England Biolabs，USA)以確定產(chǎn)物序列的準(zhǔn)確性。

1.4 HABPs單克隆噬菌體投入回收比初步鑒定HABPs親和力

將載有目標(biāo)序列YSL或隨機(jī)序列VTD的單克隆噬菌體分別與HAP結(jié)合，通過(guò)滴定測(cè)量回收后的噬菌體數(shù)量，計(jì)算最初投入的噬菌體與回收液的噬菌體之間的比值以評(píng)價(jià)這2個(gè)結(jié)合肽序列對(duì)HAP的結(jié)合親和力。隨著噬菌體與底物結(jié)合親和力的提高，噬菌體的投入回收比值變大。

1.4.1 載有YSL或VTD的單克隆噬菌體與HAP結(jié)合 配制pH=8.5的TBST緩沖液[含0.15(V/V)吐溫20]用于本實(shí)驗(yàn)。依照常規(guī)洗脫方案，將底物HAP依次使用去離子水、無(wú)水乙醇、去離子水超聲振蕩5 min后高溫高壓滅菌40 min，再置于90℃ 10%氫氧化鈉溶液中浸泡1 h后使用大量去離子水清洗HAP至中性，加入10 mL TBST緩沖液中37℃溫和搖床過(guò)夜，吸取過(guò)夜液體加入封閉液1 mL，37℃溫和搖床封閉1 h，吸取封閉液后使用TBST緩沖液清洗HAP數(shù)次，分別于管中投入等量1.2×1011pfu的目標(biāo)肽序列YSL及隨機(jī)肽序列VTD單克隆噬菌體，37℃溫和搖床進(jìn)行孵育1 h后吸去管中未結(jié)合的噬菌體，然后用10 mL新鮮配置的TBST緩沖液清洗多次以去除殘余未結(jié)合的噬菌體，加入非特異性緩沖液1 mL 37℃溫和搖床10 min后加入150 μL Tris-HCl緩沖液。通過(guò)滴度測(cè)試測(cè)得目標(biāo)肽序列YSL和隨機(jī)肽序列VTD用非特異性洗脫液洗脫的滴度結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.2 單克隆噬菌體滴定測(cè)試 挑選目標(biāo)序列和隨機(jī)序列的LB/Tet培養(yǎng)基平板上分離培養(yǎng)的宿主菌ER2738的單克隆菌斑，于含10 μL四環(huán)素的10 mL LB培養(yǎng)液中37℃劇烈振蕩6～8 h培養(yǎng)至感染狀態(tài)備用。同期微波融化頂層瓊脂后分裝于新鮮滅菌的離心管中，48℃溫浴備用。將待滴度測(cè)試的噬菌體用LB培養(yǎng)液做適當(dāng)?shù)南♂尯蠹尤刖嚎焖倩靹虻谷胄迈r配置的LB/IPTG/Xgal平板，室溫靜置3 min后倒置放入培養(yǎng)箱內(nèi)37℃過(guò)夜培養(yǎng)。外膜蛋白上含有展示肽噬菌體能在LB/IPTG/Xgal平板上形成藍(lán)色的噬菌斑。

計(jì)算大約含有100個(gè)噬菌體計(jì)數(shù)平板上藍(lán)色噬菌體的數(shù)量，按照下列公式計(jì)算噬菌體的滴度：噬菌體的滴度(pfu/10 μL)=藍(lán)色噬菌斑數(shù)量×稀釋因子

1.5 免疫熒光法驗(yàn)證HABPs親和力

通過(guò)免疫熒光技術(shù)再次驗(yàn)證2種結(jié)合肽與HAP的親和力。取等量HAP粉高壓滅菌消毒備用。用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的抗M13單克隆抗體(RL-ph2，sc-53005 FITC)對(duì)結(jié)合于HAP表面的噬菌體進(jìn)行標(biāo)定，對(duì)M13噬菌體-HABPs的親和力進(jìn)行半定量分析[5]。實(shí)驗(yàn)組分別為投入等量的目標(biāo)肽序列和隨機(jī)肽序列，以不加任何肽序列作為空白對(duì)照組，同時(shí)暴露于1 mL PBST緩沖液2 h，溫和搖床。吸走目標(biāo)序列組和隨機(jī)肽序列組未結(jié)合的噬菌體后，3組樣本同時(shí)加入200 μL FITC標(biāo)記的抗噬菌體外殼蛋白pVⅢ的抗M13單克隆抗體避光溫育1 h，最后用新鮮配置的PBST緩沖液洗滌5次。依次將等量粉末懸浮液轉(zhuǎn)移到顯微鏡載玻片上，使用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，使用Image J軟件大致計(jì)算噬菌體顆粒表面被熒光覆蓋面積，將熒光圖像中噬菌體的覆蓋面積與白光下圖像中粉末的近似表面積進(jìn)行比較[6]，得到粉末被熒光點(diǎn)亮的面積比值(熒光視野下的噬菌體覆蓋面積/白光視野下的粉末面積)和其平均吸光度(A)值。

1.6 環(huán)境pH值變化對(duì)HABPs解吸附行為的影響

為了測(cè)定目標(biāo)肽序列YSL與隨機(jī)肽序列VTD在不同pH值TBST緩沖液浸泡洗脫1 h后的解吸附性能，配制pH值為8.5、7.5、6.5、5.5和4.5的TBST緩沖液(含0.15[V/V]吐溫20)，依照常規(guī)洗脫方案，將底物HAP依次使用去離子水、無(wú)水乙醇、去離子水超聲振蕩5 min后高溫高壓滅菌40 min，再置于90℃ 10%氫氧化鈉溶液中浸泡1 h后使用大量去離子水清洗HAP至中性，加入10 mL pH=8.5 TBST緩沖液中37℃溫和搖床過(guò)夜，吸取過(guò)夜液體加入封閉液1 mL，37℃溫和搖床封閉1 h，吸取封閉液后使用pH=8.5 TBST緩沖液清洗HAP數(shù)次，分別于管中投入等量2×1010pfu的目標(biāo)肽序列YSL及隨機(jī)肽序列VTD單克隆噬菌體，37℃溫和搖床進(jìn)行孵育1 h后吸去管中未結(jié)合的噬菌體，然后用10 mL新鮮配置的pH=8.5 TBST緩沖液清洗多次以去除殘余未結(jié)合的噬菌體，再換新鮮配置的1150 μL pH=7.5 TBST緩沖液浸泡1 h后回收全部液體，再依次換用新鮮配置的1150 μL pH為6.5、5.5、4.5的TBST緩沖液重復(fù)上述操作回收浸泡液，最后再用1150 μL非特異性洗脫液洗脫并回收終末洗脫液。通過(guò)滴度測(cè)試測(cè)得目標(biāo)肽序列YSL和隨機(jī)肽序列VTD在這4組pH值(7.5、6.5、5.5、4.5)TBST緩沖液浸泡洗脫1 h后回收液及終末非特異性洗脫液的滴度結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)分析均使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行。計(jì)量資料組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)的非配對(duì)雙側(cè)檢驗(yàn)分析均值之間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 羥基磷灰石生物陶瓷HAP物相鑒定

從HAP的XRD圖結(jié)果可得其與羥基磷灰石的(002)、(112)、(300)和(202)晶面的特征吸收峰匹配良好，表明粉末主要物相為羥基磷灰石。

2.2 HABPs單克隆噬菌體投入回收比初鑒HABPs親和力

YSL和VTD噬菌體投入回收比結(jié)果顯示，YSL噬菌體回收率為VTD噬菌體回收率的17.5倍，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0027)，表明YSL對(duì)底物HAP具有較強(qiáng)結(jié)合力。

2.3 免疫熒光法驗(yàn)證HABPs親和力

為了進(jìn)一步驗(yàn)證HABPs對(duì)HAP的親和力，本研究通過(guò)免疫熒光技術(shù)分析FITC標(biāo)記的YSL和VTD及空白對(duì)照組與HAP表面結(jié)合的熒光面積及強(qiáng)度。結(jié)果顯示(圖1)：YSL組HAP表面與熒光結(jié)合的面積比例顯著高于VTD組與熒光結(jié)合的面積比例[(71.98±2.30)%vs.(49.95±2.28)%，P<0.01]，且YSL平均吸光度值同樣明顯高于VTD組[(0.10090±0.00544)vs.(0.04637±0.00117)，P<0.01]。這一數(shù)據(jù)與噬菌體投入回收比值結(jié)果一致，表明YSL與HAP表面結(jié)合親和力顯著強(qiáng)于VTD。

A：YSL、VTD及對(duì)照組免疫熒光實(shí)驗(yàn)圖像；B：YSL、VTD及對(duì)照組HAP粉末熒光面積比；C：YSL、VTD及對(duì)照組平均吸光度結(jié)果；與YSL組比較，*P<0.05；與VTD組比較，#P<0.05圖1 免疫熒光法驗(yàn)證HABPs親和力Fig.1 Verification of affinity of HABPs by immunofluorescence assay

2.4 噬菌體單克隆測(cè)序

根據(jù)生工生物工程(上海)有限公司提供的噬菌體測(cè)序分析報(bào)告得到目標(biāo)序列和對(duì)照組序列分別為YSLHWGE和VTDSKPK，并通過(guò)登錄Novopro網(wǎng)站輸入序列查詢[5]得到其物理化學(xué)特性見(jiàn)表1。

表1 YSL、VTD序列的物理化學(xué)性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of YSL and VTD sequence

從表1我們可以得到Y(jié)SL等電點(diǎn)<7，屬于酸性氨基酸，包含1個(gè)帶負(fù)電荷的堿性氨基酸Leu和1個(gè)帶正電荷的酸性氨基酸Glu，整體帶電量為0，呈中性；而VTD等電點(diǎn)>7，屬于堿性氨基酸，包含1個(gè)帶正電荷的酸性氨基酸Asp和2個(gè)帶負(fù)電荷的堿性氨基酸Lys，整體帶電量為-1，呈堿性；YSL和VTD的分子量分別為890.93 g/mol、773.87 g/mol，YSL和VTD的PI值經(jīng)計(jì)算分別為5.14和9.88；另外，根據(jù)計(jì)算所得親水性的總平均值，這2個(gè)肽序列均具有親水性，且VTD較YSL更為親水。

2.5 不同pH值緩沖液中HABPs的解吸附行為

為分析YSL和VTD于不同pH值緩沖液中在HAP表面的解吸附行為，我們對(duì)比兩者在新鮮配置的pH=7.5、6.5、5.5、4.5 TBST緩沖液中依次浸泡1 h后各回收液的滴度測(cè)試結(jié)果(圖2)，發(fā)現(xiàn)YSL在各pH值緩沖液中釋放的噬菌體數(shù)量占原吸附總量的比例均明顯高于VTD(均P<0.05)，表明在相同pH值緩沖液中YSL較VTD有明顯的解吸附行為。同時(shí)我們還注意到，YSL在不同pH值緩沖液洗脫下釋放的噬菌體數(shù)量也有差異(P<0.05)，表明其對(duì)生理環(huán)境pH值的改變反應(yīng)敏感且明顯。在pH=6.5緩沖液洗脫下釋放的噬菌體數(shù)量最多，而后隨著緩沖液pH值降低，回收液中的噬菌體數(shù)量逐漸減少。而VTD在不同pH值緩沖液中釋放的噬菌體數(shù)量無(wú)明顯差別。

與YSL組比較，*P<0.05；同組不同pH間比較：與pH=7.5比較，aP<0.05；與pH=6.5比較，bP<0.05；與pH=5.5，比較cP<0.05圖2 YSL和VTD在不同pH值緩沖液洗脫后解吸附量占原吸附總量的比值Fig.2 The ratio of desorption capacity to total adsorption capacity of HABPs after elution in buffer with different pH values for both YSL and VTD

非特異性洗脫液回收YSL和VTD的滴度測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖3，YSL噬菌體回收量明顯高于VTD(P<0.01)，再次表明YSL對(duì)底物HAP親和力高于VTD，與上述親和力測(cè)試結(jié)果一致。

圖3 YSL和VTD在終末非特異性洗脫液回收后滴度測(cè)試結(jié)果Fig.3 Titer test results of YSL and VTD after recovery of terminal nonspecific eluent

3 討論

HAP作為一種重要的生物醫(yī)學(xué)材料，在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，因其自身的復(fù)雜性使得其與多肽之間的作用機(jī)制一直都是該領(lǐng)域的研究難點(diǎn)。隨著以噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)與展示技術(shù)為代表的生物文庫(kù)技術(shù)的出現(xiàn)，這一高通量的篩選與平臺(tái)技術(shù)為研究HAP等生物材料與多肽相互作用的機(jī)制提供了可能和便利條件[7]。大部分研究通過(guò)噬菌體展示技術(shù)獲得理想的肽序列之后往往會(huì)通過(guò)體外合成成品HABPs進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，但人工合成HABPs往往存在成本高、周期長(zhǎng)的問(wèn)題，而噬菌體展示狀態(tài)下的肽序列因噬菌體自身可增殖的生物特征可通過(guò)擴(kuò)增的方法不斷重復(fù)獲得，具有成本低且周期短的優(yōu)勢(shì)。本研究直接使用通過(guò)噬菌體展示技術(shù)分離得到的一條對(duì)HAP表面有較強(qiáng)親和力的新七肽序列YSLHWGE(即HABPs)，通過(guò)噬菌體滴度測(cè)試和免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定出該序列較隨機(jī)肽序列與HAP底物有更強(qiáng)的結(jié)合力。再利用不同pH值的TBST緩沖液(pH=7.5、6.5、5.5、4.5)作為洗脫液依次浸泡1 h，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)序列YSL較隨機(jī)肽序列VTD更容易受環(huán)境pH值變化發(fā)生解吸附行為，具有一定的緩釋能力?；谶@一系列結(jié)果我們嘗試探討該結(jié)合肽序列有較高親和力且具有敏感解吸附特征的原因，以期為深入理解蛋白在HAP表面的吸附行為提供參考。

HAP的表面很復(fù)雜，目前我們得知HAP等電點(diǎn)在pH=7左右，整體上偏中性，同時(shí)表面帶有電荷[8]。而蛋白質(zhì)的HAP界面吸附是一個(gè)十分普遍、非常復(fù)雜而又極其重要的現(xiàn)象，受材料和蛋白質(zhì)的自身性質(zhì)以及溶液環(huán)境等內(nèi)外因素綜合影響，其主要驅(qū)動(dòng)力包括氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用和范德華力等。除了蛋白質(zhì)多肽鏈段上的自由氨基和羧基基團(tuán)被認(rèn)為是影響蛋白質(zhì)界面吸附的主要因素外，蛋白質(zhì)多肽鏈段的氨基酸組分和序列也被認(rèn)為對(duì)蛋白質(zhì)的界面吸附有主導(dǎo)作用[9]。同時(shí)有研究表明，吸附體系中pH值的改變能夠調(diào)節(jié)HAP的表面電荷量，進(jìn)而改變HAP與蛋白質(zhì)分子之間靜電作用的類型和強(qiáng)度[10]。

HAP表面有2種不同類型的結(jié)合位點(diǎn)，分別為帶正電的C位點(diǎn)(富含鈣離子)和帶負(fù)電的P位點(diǎn)(富含磷酸根離子)，被認(rèn)為是蛋白質(zhì)在HAP表面的結(jié)合位點(diǎn)并提供蛋白質(zhì)吸附的主要驅(qū)動(dòng)力；其中蛋白質(zhì)的羧基基團(tuán)和氨基基團(tuán)分別結(jié)合帶正電荷的C位點(diǎn)和帶負(fù)電荷的P位點(diǎn)，C位點(diǎn)對(duì)負(fù)電荷的親和力比P位點(diǎn)對(duì)正電荷的親和力更強(qiáng)。除此以外，酸性氨基酸基團(tuán)能夠強(qiáng)烈地結(jié)合HAP表面的鈣離子，這也是大多數(shù)富含γ-羧基化谷氨酸、聚谷氨酸以及磷酸化氨基酸等酸性氨基酸基團(tuán)的非膠原類蛋白質(zhì)或多肽可參與礦化過(guò)程的原因[10]。同時(shí)，除靜電力外，疏水相互作用是誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表面親和力增加的另一個(gè)重要途徑。一般來(lái)說(shuō)，疏水表面對(duì)蛋白質(zhì)的吸附作用比中性荷電的親水表面強(qiáng)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的兩親結(jié)構(gòu)中存在疏水的殘基結(jié)構(gòu)，通過(guò)疏水作用使蛋白質(zhì)傾向于吸附在疏水表面[11]。因此具有疏水性的HAP本身對(duì)蛋白質(zhì)就有一定的吸附能力。而經(jīng)研究鑒定出來(lái)的目標(biāo)肽序列YSLHWGE與隨機(jī)序列VTD相比較含有酸性氨基酸Glu(谷氨酸)且位于序列末端，意味著序列末端有2個(gè)羧基能與HAP中C位點(diǎn)的Ca2+多一個(gè)相結(jié)合的位點(diǎn)，同時(shí)目標(biāo)肽序列YSL其親水性平均系數(shù)(GRAVY)大于隨機(jī)組VTD，意味著目標(biāo)肽序列YSL親水性小于隨機(jī)組VTD，與HAP的疏水作用更強(qiáng)。此外，有報(bào)道表明，較大的蛋白質(zhì)有更多的結(jié)合位點(diǎn)與底物表面相互作用[11]。因此，較大的分子有可能被更多地吸附在表面上。所以從分子量對(duì)比，YSL可能比VTD有更多的結(jié)合位點(diǎn)，以上這些都有可能是YSL較VTD對(duì)HAP親和力更強(qiáng)的原因。

生理環(huán)境是影響蛋白質(zhì)吸附的重要因素，而pH值是影響生理環(huán)境中電學(xué)性能的重要參數(shù)。研究表明，pH值的降低會(huì)增加酸性蛋白的吸附。之前很多研究表明在不同pH值環(huán)境下，HAP表面Zeta電位均為負(fù)電位[12]，同時(shí)有報(bào)道表明，HAP顆粒對(duì)BSA的吸附能力隨pH值增大而減弱[10]。原因是隨著體系pH值增大，溶液中OH-濃度增大，HAP表面吸附OH-逐漸增多；而BSA蛋白分子等電點(diǎn)為4.7，在pH>pI時(shí)帶負(fù)電荷，HAP與BSA之間存在靜電斥力，使BSA分子難以擴(kuò)散到HAP微粒表面發(fā)生吸附，導(dǎo)致BSA在HAP表面的吸附量逐漸減小。我們研究的YSL與BSA情況相似，等電點(diǎn)為5.14，所以當(dāng)用pH大于pI的TBST浸泡1 h后，YSL因緩沖液中OH-濃度不同程度的增加從而帶有不等量的負(fù)電荷，與HAP存在靜電斥力而發(fā)生解吸附行為，導(dǎo)致釋放在浸泡回收液中噬菌體數(shù)目增多。當(dāng)用pH值(4.5)小于pI的TBST緩沖液浸泡1 h時(shí)，YSL帶有少量正電荷，與HAP之間發(fā)生靜電引力，因此對(duì)YSL的吸附量逐漸增加，此時(shí)釋放到溶液中的噬菌體數(shù)量明顯減少。此外，HAP的溶解度也是影響溶液性能的重要參數(shù)。研究表明[13]，HAP在緩沖液pH值降低過(guò)程中會(huì)伴隨HAP的溶解，隨著酸性加強(qiáng)，H+增多，HAP的溶解量隨之加大，大量的羥基發(fā)生脫離并停留在HAP附近，加上Ca2+的遠(yuǎn)游破壞電中性以及磷酸根基團(tuán)的脫離，使得HAP表面Zeta電位仍呈負(fù)電性，隨著酸性再增加，脫離的羥基、磷酸基團(tuán)和Ca2+數(shù)量進(jìn)一步增加，則Zeta負(fù)電位絕對(duì)值又將有所增大。所以這兩方面機(jī)制使得吸附于HAP表面帶有目標(biāo)肽序列YSL的噬菌體數(shù)量隨著pH值降低而減少。

因此，我們可以利用這種解吸附特征隨生理環(huán)境pH值改變的HABPs序列與某些抗菌物質(zhì)相結(jié)合用作口腔植入物的表面涂層，在口腔唾液因進(jìn)食等生理活動(dòng)變化導(dǎo)致pH值改變時(shí)可釋放該抗菌復(fù)合物，起到控制菌斑的效果，這將具有一定的臨床應(yīng)用前景。