熱休克蛋白70促進(jìn)急性肺損傷小鼠肺部炎癥反應(yīng)*

陳 艷， 王梓璇， 冀彩麗， 華夢晴， 宋傳旺

蚌埠醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，慢性疾病免疫學(xué)基礎(chǔ)與臨床安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蚌埠 233030

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是急性全身炎癥過程的肺部表現(xiàn)，ALI的主要特征為彌漫性肺泡損傷、肺水腫形成、中性粒細(xì)胞源性炎癥。臨床上表現(xiàn)為肺順應(yīng)性降低，嚴(yán)重低氧血癥，雙側(cè)肺浸潤。ALI是臨床上常見的危重癥，死亡率高達(dá)40%左右[1-2]。熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)是熱休克蛋白家族中最常見成員，分子量約70 kD。正常情況下HSP70在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平較低，而在高溫及各種有害應(yīng)激狀態(tài)下，HSP70的合成增加[3]。HSP70通常被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)分子伴侶，參與新生肽鏈的折疊與裝配、蛋白的跨膜運(yùn)送、熱變性蛋白的修復(fù)等[4]。但有研究發(fā)現(xiàn)HSP70也存在于細(xì)胞外，特別是在特定的應(yīng)激條件下，HSP70能刺激原代氣道上皮細(xì)胞的促炎反應(yīng)，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的釋放[5-6]。有學(xué)者在慢性阻塞性肺部疾病患者的肺組織中發(fā)現(xiàn)了與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)的HSP70表達(dá)升高，并且當(dāng)HSP70被分泌到細(xì)胞外時可引發(fā)炎癥反應(yīng)[7-8]。另有研究表明HSP70可從病毒感染的氣道上皮細(xì)胞釋放，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的募集和激活[9]。考慮HSP70與中性粒細(xì)胞的募集、激活及炎癥反應(yīng)有關(guān)，因此可能參與了ALI的發(fā)病，本研究構(gòu)建ALI模型小鼠，并鼻滴HSP70抗體(anti-HSP70)阻斷HSP70的作用，檢測小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤、肺干/濕重比和炎性因子產(chǎn)生情況，以觀察HSP70對ALI發(fā)病的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

胎牛血清為杭州四季青生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購自美國Sigma公司；重組小鼠HSP70蛋白、anti-HSP70購自美國Abcam公司；HSP70、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)ELISA檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司；GAPDH抗體、HSP70抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；胰酶組織細(xì)胞消化液、聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)凝膠配置試劑盒、NP-40蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、聚偏二氟乙烯膜膜(PVDF膜)購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 肺泡上皮細(xì)胞株MLE-12的培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)處理

小鼠肺泡上皮細(xì)胞株購于上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)公司。MLE-12細(xì)胞在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養(yǎng)液中，5%CO2和37℃培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，0.25%胰酶消化，隔日進(jìn)行1次傳代。實(shí)驗(yàn)前取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×105/mL接種12孔板，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后備用。

1.2.1 anti-HSP70作用的MLE-12細(xì)胞模型 培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞中加入LPS 500 ng/mL繼續(xù)刺激12 h，加入anti-HSP70(200 ng/mL)處理12 h，收集細(xì)胞上清，8000 r/min離心5 min，取上清液，使用ELISA法檢測促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的含量。

1.2.2 HSP70作用的MLE-12細(xì)胞模型 培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞中加入不同濃度(10～500 ng/mL)HSP70刺激24 h，加入與布孔細(xì)胞等量的FITC標(biāo)記的凋亡細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h，4%臺盼藍(lán)淬滅細(xì)胞外熒光10 min,PBS清洗3次，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測吞噬率的變化。

1.3 原代小鼠肺泡上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與處理

ICR小鼠(購于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)氣管插管后用PBS進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，盡可能去除支氣管肺泡中白細(xì)胞。然后通過肺動脈用PBS灌洗小鼠肺部，直至肺部變白。小心取出雙肺置于預(yù)冷的PBS液中，清洗2～3次，剪碎肺組織，加入胰酶(0.25%)、膠原酶(40 μg/mL)和DNA酶(100 μg/mL)37℃消化30 min，消化液1500 r/min離心10 min后棄上清，加入含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞懸液收集入培養(yǎng)皿中于5%CO2和37℃溫箱中培養(yǎng)2 h，將非粘附細(xì)胞收集后接種于預(yù)先鋪有膠原的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，持續(xù)觀察細(xì)胞生長的狀態(tài)和形態(tài)特征，約1周左右細(xì)胞狀態(tài)良好，采用磁珠分選法去除CD45陽性細(xì)胞。收集CD45陰性細(xì)胞即為肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells，AECs)，使用含10%FBS的DMEM重懸后進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種于預(yù)先鋪有膠原的6孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后以HSP70刺激24 h，再加入與接種細(xì)胞等量的FITC標(biāo)記的凋亡細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞使用流式細(xì)胞儀檢測吞噬率的變化。

1.4 急性肺損傷動物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組處理

雌性ICR小鼠(8～10周齡，25～30 g)隨機(jī)分為4組：正常對照組、ALI組、anti-HSP70+ALI組、同型IgG+ALI組。ALI模型小鼠采用LPS(5 mg/kg)經(jīng)鼻腔滴入1次激發(fā)形成；正常對照組使用等量磷酸鹽緩沖液PBS滴鼻；anti-HSP70+ALI組在小鼠用LPS滴鼻前2 h以及滴鼻后6 h，經(jīng)氣道滴入anti-HSP70(0.25 mg/kg)；同型IgG+ALI組則采用等劑量的同型IgG代替anti-HSP70對ALI模型小鼠進(jìn)行預(yù)處理。各組小鼠在氣道滴入PBS或LPS 24 h后，取支氣管肺泡灌洗液和肺組織進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.5 肺組織病理學(xué)檢測

取各組小鼠肺組織，4%多聚甲醛固定24 h，全自動組織脫水機(jī)脫水透明12 h，石蠟包埋，切片機(jī)上將石蠟塊切成5 μm厚的薄片。切片后使用不同濃度的二甲苯進(jìn)行脫蠟，高濃度到低濃度乙醇浸泡處理后行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察拍照。肺損傷評分采用Smith評分法對肺間質(zhì)水腫、中性粒細(xì)胞浸潤、肺泡與間質(zhì)出血、氣道上皮損傷、透明膜形成等方面分別進(jìn)行評分。無損傷為0分；損傷面積<25%為1分；損傷面積25%～為2分，損傷面積50%～為3分；損傷面積75%～為4分。每組選取5個高倍(×400)顯微鏡視野，取其平均值，計(jì)算肺組織學(xué)評分。

1.6 肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)與染色

用PBS灌洗小鼠肺組織，收集5 mL灌洗液，1500 r/min離心5 min，棄去上清，將細(xì)胞沉淀加入100 μL含10%血清的PBS，混勻后取10 μL滴加于玻片上，輕輕涂布均勻至1 cm2左右，在超凈臺中自然風(fēng)干，加入固定液覆蓋整個標(biāo)本，在超凈工作臺中自然風(fēng)干，隨后滴加改良瑞士染液，覆蓋整個標(biāo)本，洗耳球輕柔吹打充分混勻，染色5 min，細(xì)流水沖洗，待玻片晾干后于顯微鏡下進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。

1.7 小鼠肺組織濕/干重比測定

各組小鼠解剖后，小心取出其肺組織放置在PBS中，清洗2遍以去除其表面的血液。將肺組織放置在吸水紙上，除去其表面的水分，然后統(tǒng)一稱量右肺的質(zhì)量，記錄為濕重(W)；緊接著將右肺組織放置在干燥箱中48 h至肺組織質(zhì)量恒定后取出稱取質(zhì)量，記錄為干重(D)，計(jì)算各組小鼠肺組織的濕/干重比(W/D)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測吞噬作用

完成實(shí)驗(yàn)處理的MLE-12或原代AEC細(xì)胞用4%臺盼藍(lán)淬滅細(xì)胞外熒光10 min,PBS洗滌3次，再用0.25%胰酶消化，終止消化后離心，吸棄上清，4%多聚甲醛固定，使用DxP Athena流式細(xì)胞儀檢測吞噬凋亡細(xì)胞情況。

1.9 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

取小鼠肺組織，勻漿后采用NP-40裂解液提取蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白在8% SDS-PAGE凝膠中電泳(70 V，30 min轉(zhuǎn)110 V，1 h)，轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜上(200 mA，2 h)，以5%工業(yè)脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗(HSP70抗體，稀釋度1∶5000)4℃孵育過夜，TBST洗膜后以HRP標(biāo)記的二抗(HRP-山羊抗小鼠IgG，稀釋度1∶5000)孵育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影。以目的條帶和GAPDH條帶灰度比值對蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量。

1.10 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

收集小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的離心上清，及分組處理后的細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒操作說明，檢測其中HSP70、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。根據(jù)酶標(biāo)儀測得的A450 nm值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 急性肺損傷小鼠肺組織和BALF中HSP70產(chǎn)生增加

首先以免疫印跡法和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測ALI小鼠肺組織及BALF中HSP70含量。與對照組比較，ALI小鼠肺組織中HSP70的表達(dá)增加(P<0.01，圖1A)，BALF中HSP70分泌增多(P<0.01，圖1B)。這些結(jié)果提示本研究采用的ALI模型小鼠肺組織HSP70產(chǎn)生增加。

A：免疫印跡法檢測小鼠肺組織中HSP70表達(dá)；B：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測小鼠BALF中HSP70含量；與正常對照組(Control)比較，**P<0.01圖1 ALI模型肺組織和BALF中HSP70產(chǎn)生增加Fig.1 HSP70 was increased in lung tissues and BALF of ALI model

2.2 anti-HSP70減輕ALI模型小鼠的肺部炎癥

采用anti-HSP70滴鼻以阻斷HSP70的效應(yīng)，檢測肺組織病理改變及炎癥情況。HE染色結(jié)果顯示，與正常對照組小鼠比較，ALI小鼠肺組織中多形核中性粒細(xì)胞(PMN)明顯增加，肺泡充血和滲出明顯，炎癥細(xì)胞浸潤增加；與ALI組相比，anti-HSP70+ALI組小鼠肺組織中炎性細(xì)胞浸潤減少，肺泡充血與滲出情況有所好轉(zhuǎn)(圖2A)。肺泡灌洗結(jié)果顯示，anti-HSP70滴鼻處理后，與ALI組比較，anti-HSP70+ALI組小鼠BALF中HSP70的含量降低(圖2B，P<0.05)，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子的分泌減少，蛋白含量明顯減少(圖2C、2D，均P<0.05)，PMN數(shù)目減少(圖2E,P<0.05)。anti-HSP70滴鼻處理還使ALI小鼠肺濕/干重比值明顯降低(圖2F,P<0.05)。

1：Control；2：ALI；3：anti-HSP70+ALI；4：IgG+ALI；A：HE染色評價肺組織損傷(×200)；B：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測小鼠BALF中HSP70含量；C：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測小鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量；D：BALF中蛋白含量測定；E：BALF中多形核中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)；F：肺組織濕/干重比；與正常對照組(Control)比較，*P<0.05 **P<0.01；與ALI組比較，#P<0.05圖2 HSP70抗體對ALI模型小鼠肺部炎癥的影響Fig.2 Effect of HSP70 antibody on lung inflammation in ALI mouse model

2.3 anti-HSP70降低LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)顯示，與LPS組比較，HSP70抗體預(yù)處理的anti-HSP70+LPS組培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β含量下降(均P<0.05，圖3)。

1：Control；2：LPS；3：anti-HSP70+LPS；4：IgG+LPS；與Control組比較，**P<0.01；與LPS組比較，#P<0.05圖3 HSP70抗體對LPS刺激的MLE-12細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子的影響Fig.3 Effect of HSP70 antibody on inflammatory cytokine secretion of LPS stimulated MLE-12 cells

2.4 HSP70減弱肺泡上皮細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的作用

為探討HSP70促進(jìn)ALI小鼠肺部炎癥的可能機(jī)制，我們觀察了HSP70對肺泡上皮細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的影響。采用不同濃度(10～500 ng/mL)的HSP70刺激肺泡上皮細(xì)胞株MLE-12細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)100～500 ng/mL的HSP70可抑制MLE-12細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬，其中以200 ng/mL濃度組的抑制作用最為明顯(P<0.01，圖4A、4B)。進(jìn)一步觀察HSP70對原代AECs吞噬凋亡細(xì)胞作用的影響。首先提取分選的小鼠原代AECs經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，符合肺泡上皮細(xì)胞表型CD45-EPCAM+的細(xì)胞純度大于95%(圖5)；將分選得到的小鼠原代AECs培養(yǎng)貼壁后加入200 ng/mL HSP70刺激24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測其對凋亡細(xì)胞的吞噬變化，結(jié)果顯示原代AECs的吞噬率降低(P<0.01，圖6)。

A：檢測MLE-12細(xì)胞吞噬作用的流式圖；B：流式統(tǒng)計(jì)圖，與Control組比較，*P<0.05**P<0.01圖4 HSP70對MLE-12細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的抑制Fig.4 Inhibitory effect of HSP70 on phagocytosis of apoptotic cell by MLE-12 cells

A：普通光學(xué)顯微鏡下所見(×40)；B：流式檢測分選，顯示CD45-/EPCAM+細(xì)胞>95%圖5 原代培養(yǎng)肺泡上皮細(xì)胞的鑒定Fig.5 Identification of primary alveolar epithelial cells

與Control組比較，**P<0.01圖6 HSP70(200 ng/mL)對原代肺泡上皮細(xì)胞吞噬功能的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of HSP70(200 ng/mL)on phagocytosis function of primary alveolar epithelial cells

3 討論

HSP70是熱休克蛋白家族成員之一，分子量約為70 kD，是普遍存在的分子伴侶[10]。機(jī)體在高溫及微生物感染等應(yīng)激狀態(tài)下HSP70的產(chǎn)生會增加[11-12]，如高血壓、急性感染患者外周血液中HSP70含量增加[13-14]。最近有報道表明，在霉菌毒素刺激下，大鼠肺組織中HSP70的表達(dá)顯著增加[15]。本研究也證明HSP70在ALI小鼠中肺組織的表達(dá)和肺泡灌洗液中的分泌均增加，提示HSP70在ALI中可能有重要作用。本研究結(jié)果顯示，使用anti-HSP70滴鼻能減弱ALI導(dǎo)致的小鼠肺泡中性粒細(xì)胞數(shù)量增多及炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)生成的增加，并能降低肺蛋白含量，有助于減輕肺水腫，說明HSP70促進(jìn)ALI肺部炎癥進(jìn)展。肺泡上皮細(xì)胞在ALI進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，LPS可誘導(dǎo)小鼠肺上皮MLE-12細(xì)胞促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β)表達(dá)水平升高[16]。我們的結(jié)果顯示在LPS刺激的MLE-12細(xì)胞中加入anti-HSP70后TNF-α、IL-1β生成量減少。有研究表明，HSP70不僅能激活氣道上皮細(xì)胞促炎基因的表達(dá)，還可刺激其NLRP3炎癥小體、IL-1β和ATP的釋放，從而加重慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的病情并影響預(yù)后[9，17]。HSP70在中性粒細(xì)胞吞噬結(jié)核分枝桿菌過程中，觸發(fā)巨噬細(xì)胞釋放IL-6、TNF-α、IL-1β等促炎細(xì)胞因子，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[18]。另外，HSP70可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(ICAM-1)和IL-6的表達(dá)增加，引起心肌細(xì)胞的炎癥和收縮力下降[19]。這些研究均提示HSP70有促炎作用，本研究結(jié)果與之一致。

吞噬作用是宿主細(xì)胞對病原微生物和凋亡細(xì)胞的特異性識別和吞噬，是機(jī)體抗感染和維持組織穩(wěn)態(tài)的重要過程[20]。AECs參與構(gòu)成肺泡屏障，ALI發(fā)生時AECs受損，其損傷后釋放的炎性介質(zhì)啟動了復(fù)雜的炎性反應(yīng)，由于AECs數(shù)量較多，因此AECs在ALI/ARDS發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[21-22]。AECs通過吞噬作用清除凋亡細(xì)胞，減輕ALI的炎癥反應(yīng)，因此AECs對凋亡細(xì)胞的吞噬有助于ALI氣道炎癥的消退，從而有助于重塑肺泡屏障[23]。凋亡細(xì)胞的有效清除對維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，如果正常細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的清除能力受損或細(xì)胞死亡超過正常細(xì)胞的清除能力，凋亡細(xì)胞通過自身以及誘導(dǎo)正常細(xì)胞釋放促炎介質(zhì)(IL-1和TNF-α等)，進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)HSP70可抑制AECs對凋亡細(xì)胞吞噬，說明其延長了死亡細(xì)胞來源炎性內(nèi)容物的刺激時間，這也可能是HSP70促進(jìn)ALI肺部炎癥的原因。細(xì)胞外HSP70可以與上皮細(xì)胞RAGE受體相互作用，并且隨著RAGE表達(dá)降低，HSP70啟動的ERK1/2激活和和NF-κB轉(zhuǎn)錄及前炎癥因子產(chǎn)生減少，說明RAGE是上皮細(xì)胞表面識別HSP70的受體[25]。另外，有研究表明，CD91也是巨噬細(xì)胞識別HSP70的受體[26]。由于RAGE和CD91都是吞噬凋亡細(xì)胞時用來識別磷脂酰絲氨酸的受體[27]，因此可能是HSP70與這些受體相互作用后，占據(jù)了這些受體，影響了對凋亡細(xì)胞的識別和吞噬，這也可能是我們的研究中HSP70抑制AECs吞噬凋亡細(xì)胞的原因。

綜上所述，HSP70促進(jìn)了ALI小鼠肺部炎癥反應(yīng)，這可能是由于HSP70抑制了肺泡上皮細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬所致。