卵黃抗體3種提取方法比較

王玉霞 許方方 李梁梁 李鳳華

（山東迅達(dá)康獸藥有限公司，山東濟(jì)南 250000）

隨著社會經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，禽畜業(yè)規(guī)?；潭仍絹碓礁?，抗生素濫用也越來越頻繁，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性及抗生素殘留問題突出[1]。因此，如何尋找和使用安全可靠的產(chǎn)品替代抗生素成為當(dāng)今行業(yè)的熱點問題。目前，市場上已經(jīng)出現(xiàn)很多抗生素替代品，如抗體、噬菌體、抗菌肽、有機(jī)酸、植物提取物等[2]，其中卵黃抗體在禽畜的預(yù)防、治療和促生長等方面有廣泛應(yīng)用。

抗體對動物的預(yù)防、治療及促生長具有重要作用，其特異性和高效性遠(yuǎn)高于其他疾病防治手段。卵黃抗體作為一種免疫球蛋白，由2條相同的重鏈與2條相同輕鏈通過二硫鍵連接組成[3]。其有很高的耐酸、耐堿、耐熱、抗高壓等特性，在pH值為4.0～11.0環(huán)境下生物活性均具有較高的穩(wěn)定性[4]。卵黃抗體作為一種無耐藥性、無公害、無殘留新型綠色藥物，對于養(yǎng)殖業(yè)防治疾病具有重要意義。

卵黃抗體具有中和病毒、凝集細(xì)菌等功能，可以抵御病毒感染宿主細(xì)胞，主要有以下幾個方面原因：一是卵黃抗體可以黏附在病毒外殼上，從而抑制病毒的繼續(xù)繁殖；二是抗體可以引起病毒表面受體破壞，從而影響病毒與受體細(xì)胞表面的融合，進(jìn)而阻止病毒核酸進(jìn)入細(xì)胞復(fù)制。此外，卵黃抗體還可以提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增加巨噬細(xì)胞數(shù)量，以避免抗原擴(kuò)散，消除局部感染[5]?？傊?，隨著抗生素耐藥性的逐漸增強(qiáng)，將會有更多的卵黃抗體產(chǎn)品被研發(fā)使用，卵黃抗體具有廣闊的發(fā)展前景。

隨著卵黃抗體研究的不斷深入，卵黃抗體作為替抗產(chǎn)品在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中的應(yīng)用越來越廣泛，是一種比較理想的抗生素替代品。卵黃抗體的優(yōu)勢在于細(xì)菌不會對其產(chǎn)生耐藥性，無藥物殘留，不易誘發(fā)病毒變異，而且還具有治療效果迅速、特異性強(qiáng)等特點。在卵黃抗體的大規(guī)模生產(chǎn)上，由于管理不規(guī)范，一些稀釋后的樣品未去除脂肪和磷酸便直接用于動物免疫，從而對動物產(chǎn)生毒害作用。因此，卵黃抗體的去脂效果好壞就顯得極其重要，好的去脂效果可以更好地發(fā)揮卵黃抗體的作用。本研究主要對不同方法提取卵黃抗體進(jìn)行比較，綜合比較其優(yōu)缺點并找出最優(yōu)的提取方法，以期為今后大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

SPF雞、高免蛋由長清某養(yǎng)殖場提供；新城疫、禽流感H9標(biāo)準(zhǔn)抗原均購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司；辛酸、泊洛沙姆等試劑均購自天津市精細(xì)化工研究所；96孔板購自比克曼生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

雞卵黃主要由蛋白質(zhì)和脂類組成。由于卵黃中含有大量脂類，而脂類中的磷脂和不飽和脂肪酸等極易變質(zhì)，導(dǎo)致抗體保存時間縮短，禽畜注射了變質(zhì)的脂肪很容易造成死亡。因此，提取卵黃抗體關(guān)鍵在于去除卵黃中的脂類，保留水溶性的卵黃抗體。提取方法主要有沉淀法、超濾法、反復(fù)凍融法及層析法等。

1.2.1 卵黃液的收集。由于雞蛋表面附著很多雜菌，為防止產(chǎn)品受到污染，首先將收集的高免蛋用0.1%新潔爾滅浸泡15min，自然晾干后再用75%乙醇擦拭干凈，將雞蛋打碎、蛋清和蛋黃分離，棄蛋清和蛋黃膜，保留蛋黃，分別用下列方法提取卵黃抗體。

1.2.2 泊洛沙姆法提取卵黃抗體。泊洛沙姆經(jīng)常被用作藥品添加劑，無毒副作用，是一種表面活性劑，其作用機(jī)理主要是打破卵黃的乳化狀態(tài)，導(dǎo)致其中的脂類可以相互凝結(jié)自發(fā)沉淀[6]，沉淀結(jié)實易分離，進(jìn)而減少后續(xù)操作。具體方法是將卵黃液與水按1∶6體積比例混合均勻，加入1.5%泊洛沙姆后調(diào)節(jié)pH值至5.0～5.2，置于4℃冰箱靜置過夜，次日將過夜分層的卵黃液棄去沉淀并保留上清液。

1.2.3 水稀釋法提取卵黃抗體。水稀釋法是將卵黃與水以一定比例混合均勻，讓卵黃中水溶性的蛋白溶于水，離心后的上清液即為卵黃抗體。其具體方法是將卵黃液與水按1∶8體積比例混合均勻，調(diào)節(jié)pH值至5.0～5.2，置于4℃冰箱中靜置過夜，次日以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心20min，棄去沉淀取上清液。

1.2.4 辛酸法提取卵黃抗體。將卵黃液與0.07mol/L乙酸鈉緩沖液按1∶8比例混合均勻，調(diào)節(jié)pH值至4.5，加入2.5%辛酸攪拌30min，以6 000 r/min離心20min，棄去沉淀取上清液。

1.2.5 抗體效價檢測。

（1）血凝試驗。在反應(yīng)板中每孔加入25μL生理鹽水，在第1孔中加入25μL抗原，反復(fù)抽打3～5次。從第1孔吸取25μL至第2孔，反復(fù)抽打。依次稀釋至第11孔，從第11孔吸取25μL棄去。每孔依次加入生理鹽水25μL、1%雞紅細(xì)胞25μL，室溫下靜置30min后觀察。完全無淚珠水流淌的最高稀釋倍數(shù)為血凝效價。

（2）血凝抑制試驗。首先根據(jù)血凝試驗結(jié)果，計算4個血凝單位抗原，將血凝效價除以4即為4個血凝單位抗原稀釋倍數(shù)。在反應(yīng)板中第1～11孔加入25μL生理鹽水，第12孔加入50μL生理鹽水，第1孔加入25μL樣品，混勻之后依次稀釋至第10孔，第10孔棄去25μL，在第1～11孔中加入4個單位抗原，室溫靜置30min后，每孔加入1%雞紅細(xì)胞，室溫下靜置40min觀察。以完全抑制4個單位抗原的稀釋倍數(shù)為該樣品的血凝抑制效價。

1.2.6 雞的安全試驗。選取10日齡健康的SPF雞做安全試驗，將雞分為4組，每組5只。其中3組分別注射上述3種不同提取方法提取液5mL；另外1組設(shè)為對照組，注射等量生理鹽水。連續(xù)觀察數(shù)日，記錄有無異常情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵黃抗體物理性質(zhì)比較

不同提取方法中，由于加入的試劑不同，提取液的物理性質(zhì)也不同。通過對提取液的顏色、氣味及沉淀的結(jié)實程度比較分析不同提取方法的優(yōu)缺點。由表1可知，采用水稀釋法和泊洛沙姆法提取的卵黃抗體均為無色、無味液體，且透明度均較好、較清澈；采用辛酸法提取的卵黃抗體呈現(xiàn)淡黃色，伴有辛酸味，透明度亞于水稀釋法。泊洛沙姆法沉淀較結(jié)實、易分離、易操作，另外2種方法沉淀疏松不易分離。

表1 3種方法提取卵黃抗體的物理性質(zhì)

2.2 蛋白濃度檢測

卵黃抗體蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行檢測，該方法操作簡便、快捷。將不同濃度的試樣加入考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)樣品中，在596 nm波長下檢測吸光值，根據(jù)不同濃度的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)牛血清標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到不同提取方法卵黃抗體的蛋白濃度含量。檢測結(jié)果表明，用泊洛沙姆方法提的取蛋白含量最高，為24.12mg/mL；其次是水稀釋法，為19.89mg/mL；辛酸法蛋白含量最低，為16.56mg/mL。

2.3 抗體效價檢測

新城疫和禽流感是當(dāng)前禽畜養(yǎng)殖業(yè)中主要兩大疾病，抗體效價的高低對疾病的預(yù)防與治療具有極其重要的作用，因而提取抗體效價的高低可起到關(guān)鍵性作用。本試驗采用血凝試驗和血凝抑制試驗檢測不同提取方法卵黃抗體的新城疫和禽流感H9效價。由表2可知，水稀釋法的新城疫及禽流感效價最高，辛酸法效價最低。水稀釋法抗體溶液體積最高，為68mL；辛酸法次之，為65mL；泊洛沙姆法最低，為32mL。

表2 3種方法提卵黃抗體效價及溶液體積

2.4 雞的安全性試驗

連續(xù)觀察5 d，雞的糞便、飲食及精神狀態(tài)都無異常，與對照組相同；繼續(xù)觀察至14 d，均無死亡發(fā)生，存活率100%。這表明提取的卵黃抗體安全、無毒害。

3 結(jié)論與討論

本試驗研究中3種提取卵黃抗體的方法所用試劑均無毒、無污染，辛酸、泊洛沙姆也廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，提取方法各有優(yōu)缺點。本文從物理性質(zhì)、蛋白含量、抗體效價及安全性等方面展現(xiàn)了3種不同方法的優(yōu)缺點。其中泊洛沙姆法沉淀結(jié)實，上清液易于分離，但是提取液體積較少，不如水稀釋法提取液體積多，而且新城疫和禽流感效價不如水稀釋法效價高。水稀釋法的新城疫和禽流感效價均可達(dá)10以上，均高于另外2種卵黃抗體的提取方法，這對防治家禽疾病具有重要作用，而且水提取法操作簡單、化學(xué)試劑使用較少、蛋白提取率高，比較符合當(dāng)代社會便捷的提取理念。綜合考慮，采用水提法提取卵黃抗體效果比較好、性狀穩(wěn)定，適合車間大規(guī)模生產(chǎn)。