高產(chǎn)己酸梭狀芽孢桿菌的誘變及篩選育種

屈 慧，王海英，王 慧，徐 芳，屈 宇，郝禎燕

（1.河套酒業(yè)集團(tuán)股份有限公司技術(shù)中心，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015400；2.臨河區(qū)人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000；3.臨河區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000）

己酸菌是窖泥中的主要功能性微生物，而窖泥在北方濃香白酒發(fā)酵中起到了舉足輕重的作用。故己酸菌在白酒發(fā)酵中享有不可或缺的地位。

己酸菌就本身特性而言屬于比較“嬌氣”型菌種，在發(fā)酵的過程中對(duì)發(fā)酵條件的要求比較嚴(yán)苛，且具有自身容易老化衰退、種間差異性較大等特點(diǎn)。這就需要科研人員對(duì)己酸菌進(jìn)行持續(xù)的、更加深入的研究。

針對(duì)己酸菌以上特性，選擇實(shí)驗(yàn)室保藏菌種209#己酸菌作為出發(fā)菌株，采取物理和化學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行誘變，篩選出發(fā)生正向突變的菌株。同時(shí)對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行遺傳性狀穩(wěn)定性的檢測(cè)和代謝產(chǎn)物變化規(guī)律的跟蹤分析。確保誘變后的菌種遺傳性狀穩(wěn)定，產(chǎn)物代謝規(guī)律清晰。作為生產(chǎn)使用菌種應(yīng)用到大生產(chǎn)中，以達(dá)到提高釀酒材料中己酸乙酯的目的。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌種

實(shí)驗(yàn)室保藏菌種209#己酸菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

巴氏（改良）培養(yǎng)基：無水乙酸鈉0.5%、酵母浸粉0.4 %、硫酸銨0.05 %、磷酸氫二鉀0.04 %、硫酸鎂0.02%、酒精2%、碳酸鈣1%、pH 值6.5～7.0、蒸餾水1000 mL。121 ℃高壓滅菌30 min。（備注：碳酸鈣干熱滅菌，酒精在接種前加入。）

己酸菌富集培養(yǎng)基：氯化鎂200 mg、硫酸錳2.5 mg、硫酸亞鐵5 mg、生物素5 μg、乙酸鈉8 g、氯化銨500 mg、硫酸鈣10 mg、鉬酸鈉2.5 mg、對(duì)氨基苯甲酸100 μg、乙醇25 mL、營(yíng)養(yǎng)瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL。pH 值自然，121 ℃滅菌20 min，冷卻后無菌加入25 mL乙醇。

車間生產(chǎn)工藝培養(yǎng)基：三水醋酸鈉1.5%、酵母粉0.6%、硫酸銨0.05%、磷酸氫二鉀0.04%、硫酸鎂0.02 %、土1.5 %、酒精2 %、碳酸鈣0.5 %、pH 值自然、純凈水1000 mL；罐體及物料蒸汽滅菌30 min。酒精接種時(shí)加入，34 ℃培養(yǎng)7 d。

1.1.3 儀器設(shè)備

電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）、生物安全柜（蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司）、奧林巴斯BX51 顯微鏡（奧林巴斯（北京）銷售服務(wù)有限公司）、數(shù)顯電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)驗(yàn)有限公司）、醫(yī)用冷藏箱（中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司）、立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、YQX 型厭氧培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、島津GC-8A 氣相色譜儀、單道可調(diào)量程移液槍（普德蘭上海貿(mào)易有限公司）等儀器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

1.2.1.1 菌種復(fù)壯

對(duì)保藏菌種209#己酸菌進(jìn)行熱處理。處理?xiàng)l件為80 ℃，水浴振搖處理10 min，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)接于新鮮富集培養(yǎng)基中，34 ℃培養(yǎng)5～7 d。

1.2.1.2 菌種繼代培養(yǎng)

對(duì)復(fù)壯的菌種進(jìn)行2 次繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)基使用巴氏改良培養(yǎng)基，34 ℃培養(yǎng)5～7 d。讓菌種活力和健壯程度達(dá)到最佳，菌體濃度達(dá)到×10。

1.2.2 菌種誘變

1.2.2.1 紫外線誘變

1.2.2.1.1 菌懸液制備

吸取5 mL 菌液，5000 r/min，離心10 min，棄去上清液，加入5 mL 生理鹽水振蕩均勻后再離心棄去上清液，如此反復(fù)2 遍。第3 遍時(shí)加入5 mL 生理鹽水充分振蕩均勻待用（備注：菌液洗脫需在超凈工作臺(tái)中操作）。

1.2.2.1.2 誘變條件

19 W紫外燈、波長(zhǎng)245 nm、照射距離38 cm、照射時(shí)間2 min、4 min、6 min。

1.2.2.1.3 誘變步驟

誘變前采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)制備好的菌懸液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，將1.2.2.1.1 制備好的菌懸液倒入φ=90 mm 的無菌平皿中，使用無菌接種環(huán)將其均勻涂開，使液體平鋪于皿中，提前15 min 預(yù)熱的紫外燈垂直照射于菌液。在整個(gè)誘變過程中不能照射白熾光。誘變后吸取1 mL 菌液用于菌落計(jì)數(shù)，其余菌液全部轉(zhuǎn)接于10 mL 具塞試管中，加入新鮮巴氏改良液體培養(yǎng)基，34 ℃密封、避光培養(yǎng)5～7 d。誘變后菌種需進(jìn)行3～4 次繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后待用。

1.2.2.1.4 誘變后菌種分離

平板傾注法：在無菌條件下吸取1 mL 1.2.2.1.3中的待用菌液，進(jìn)行梯度稀釋，選擇10～10梯度進(jìn)行平板轉(zhuǎn)接。將提前高壓滅菌的己酸菌富集培養(yǎng)基傾注于平皿中，充分搖勻。凝固后倒置于厭氧培養(yǎng)盒中，34 ℃密封避光培養(yǎng)4～5 d。

挑取單菌落：選擇形態(tài)獨(dú)立的菌落進(jìn)行挑取，轉(zhuǎn)接入5 mL 具塞試管中，加入巴氏改良培養(yǎng)基，34 ℃密封避光培養(yǎng)7 d。

1.2.2.1.5 代謝產(chǎn)物檢測(cè)

樣品處理：吸取1 mL己酸菌液，加入0.1 mL 甲酸酸化處理，加入50%的乙醇溶液定容到10 mL，充分振蕩40 s，過0.22μm 濾膜后，注入1.5 mL 樣品瓶中，上氣相色譜檢測(cè)。色譜條件：色譜柱CP-Wax57 CB（50 m 長(zhǎng)，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.2 mm）；柱溫采用程序升溫，初始溫度為50 ℃，保持2 min，升溫速率為15 ℃/min，終止溫度為230 ℃，保持15 min；進(jìn)樣器溫度為150 ℃，檢測(cè)器溫度為250 ℃；載氣（高純氮）流速為44 mL/min，氫氣流速為30 mL/min，空氣流速為400 mL/min；進(jìn)樣量為1μL。

1.2.2.2 氯化鋰誘變

1.2.2.2.1 出發(fā)菌株

以紫外線誘變分離得到的正突變菌株為出發(fā)菌株，進(jìn)行氯化鋰誘變。

1.2.2.2.2 誘變方法

誘變菌體為新鮮、健壯且菌體濃度為10個(gè)/mL。將該菌以10 倍稀釋梯度進(jìn)行稀釋，選擇最適稀釋梯度分別傾注于氯化鋰添加量為0.3 %、0.6 %、0.9%、1.2%、1.5%的巴氏（改良）培養(yǎng)基平板中，培養(yǎng)條件為34 ℃下避光、倒置培養(yǎng)5 d。

1.2.2.2.3 菌種分離

挑取獨(dú)立形態(tài)較好的單菌落，轉(zhuǎn)接于5 mL具塞試管中，培養(yǎng)基使用巴氏改良液體培養(yǎng)基，密封、避光培養(yǎng)5～7 d。逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)跟蹤檢測(cè)代謝產(chǎn)物，方法同1.2.2.1.5。

1.2.3 誘變菌種組合及應(yīng)用

為了增加己酸菌液的復(fù)合香氣，決定將誘變得到的3株菌種，兩兩組合后轉(zhuǎn)接于己酸車間800 kg不銹鋼罐中，同步培養(yǎng)，7 d檢測(cè)代謝產(chǎn)物。生產(chǎn)工藝及培養(yǎng)基如前所述，代謝產(chǎn)物檢測(cè)方法同1.2.2.1.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線誘變結(jié)果

2.1.1 紫外線誘變致死率計(jì)算

通過對(duì)誘變前后菌種進(jìn)行活體平板計(jì)數(shù)，計(jì)算其致死率，確定最適誘變時(shí)間。

結(jié)合表1 分析，紫外線誘變致死率在其他參數(shù)不變的情況下，隨著誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，菌種致死率升高。有研究認(rèn)為，紫外線誘變致死率在70 %～80 %或者更低時(shí)，菌種發(fā)生正向突變的幾率更大。由表1 可知，誘變時(shí)間為2 min 時(shí)，致死率為71.13%，在最適致死率范圍之內(nèi)。誘變時(shí)間為4 min和6 min時(shí)的致死率超出最適致死率范圍。故紫外線最適誘變時(shí)間確定為2 min。

表1 誘變后活體致死率

2.1.2 誘變后菌種分離結(jié)果

對(duì)誘變后的菌種進(jìn)行梯度稀釋，選擇10～10梯度轉(zhuǎn)接，每梯度吸取1 mL 注入無菌平皿中，加入15～20 mL 己酸菌富集瓊脂培養(yǎng)基，充分混勻后，冷卻凝固。倒置于厭氧盒中，放入?yún)捬醢皡捬踔甘緞?，密封?4 ℃培養(yǎng)5～7 d。挑取36 個(gè)獨(dú)立的單菌落分別轉(zhuǎn)接于5 mL 具塞試管中，加入巴氏（改良）液體培養(yǎng)基，密封，避光培養(yǎng)7～10 d。使用1.2.2.1.5方法檢測(cè)其代謝產(chǎn)物。對(duì)照菌株己酸含量為635 mg/100 mL。36 株菌種中，有1 株高于對(duì)照，己酸含量為704 mg/100 mL，其余35 株己酸含量均低于100 mg/100 mL。菌種突變率見表2。

表2 分離菌種突變率統(tǒng)計(jì)

發(fā)生正向突變菌株，菌落小且成圓形，邊緣整齊，乳白色。根據(jù)其菌落形態(tài)命名為XYD1#己酸菌。該菌傳代培養(yǎng)5 代后，作為出發(fā)菌株進(jìn)行氯化鋰誘變。

2.2 氯化鋰誘變結(jié)果

選取XYD1# 5 代菌種，菌落平板計(jì)數(shù)和氯化鋰平板復(fù)誘變同時(shí)進(jìn)行。氯化鋰用量分別為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%。不同氯化鋰濃度致死率見表3。

表3 氯化鋰致死率

結(jié)合表3分析，隨著氯化鋰濃度的增加，菌種致死率升高，其中添加量為1.5%時(shí)致死率為100%。最適誘變條件為氯化鋰添加量0.9%。選擇致死率為76.88%的平板進(jìn)行單菌落分離。共挑取28個(gè)單菌落，分別轉(zhuǎn)接于5 mL巴氏改良培養(yǎng)基中密封培養(yǎng)10 d，檢測(cè)其代謝產(chǎn)物。其中編號(hào)為Y18、Y28兩株菌種己酸含量高于出發(fā)菌株XYD1#，發(fā)生正向突變，己酸分別為786 mg/100 mL、803 mg/100 mL；Y11、Y19己酸含量分別為632 mg/100 mL、648 mg/100 mL，接近對(duì)照，沒有發(fā)生突變；其余24 株菌種均低于100 mg/100 mL，發(fā)生負(fù)突變。菌種突變率見表4。

表4 氯化鋰誘變菌種突變率統(tǒng)計(jì)

2.3 誘變菌種代謝產(chǎn)物變化規(guī)律

對(duì)誘變得到的XYD1#、Y18、Y28 3株菌種同步培養(yǎng)，通過連續(xù)7 d取樣檢測(cè)其代謝產(chǎn)物，了解每株菌種的代謝產(chǎn)物變化規(guī)律。

結(jié)合圖1 分析，乙酸、丁酸、己酸三大酸在7 d內(nèi)呈現(xiàn)出此消彼長(zhǎng)的趨勢(shì)。乙酸在培養(yǎng)第2 天時(shí)達(dá)到最大值，之后一直降低，第5～7 天時(shí)基本趨于平穩(wěn)；丁酸和己酸走勢(shì)趨于一致，只是增加和降低的幅度較小；己酸在培養(yǎng)前3 d 時(shí)產(chǎn)量基本處于平穩(wěn)狀態(tài)，從第4天開始己酸翻倍增加，到第7天時(shí)己酸達(dá)到最大值1127 mg/100 mL。

圖1 XYD1#7 d代謝產(chǎn)物變化趨勢(shì)

結(jié)合圖2 分析，乙酸、丁酸、己酸三大酸在7 d內(nèi)仍然是此消彼長(zhǎng)的趨勢(shì)。乙酸在第2 天時(shí)達(dá)到最大值，之后逐漸降低，第7 天達(dá)到最低值。丁酸和己酸走勢(shì)趨于一致，只是增加和降低的幅度較?。患核嵩谂囵B(yǎng)前3 d時(shí)產(chǎn)量基本處于平穩(wěn)狀態(tài)，從第4 天開始己酸翻倍增加，到第7 天時(shí)己酸達(dá)到最大值1362 mg/100 mL。

圖2 Y18的7d代謝產(chǎn)物變化趨勢(shì)

結(jié)合圖3 分析，乙酸、丁酸、己酸三大酸在7 d內(nèi)仍然是此消彼長(zhǎng)的趨勢(shì)。乙酸在前3 天略有降低，第4～5天時(shí)達(dá)到最大值，之后逐漸降低，第7天降到最低值。丁酸和乙酸變化趨勢(shì)一致，只是在第4～6 天時(shí)丁酸的增長(zhǎng)幅度較大；己酸在培養(yǎng)前3 d時(shí)略有降低，從第4天開始己酸翻倍增加，到第7天時(shí)己酸達(dá)到最大值1286 mg/100 mL。

圖3 Y28的7 d代謝產(chǎn)物變化趨勢(shì)

通過將XYD1#、Y18、Y28 3株誘變菌株同步培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)二次誘變得到的Y18、Y28 兩株菌種在產(chǎn)己酸方面較XYD1#有所提升，達(dá)到了二次誘變的效果。

2.4 誘變菌種組合篩選

3 株誘變菌種兩兩等比例組合，同步培養(yǎng)7 d，取樣檢測(cè)代謝產(chǎn)物結(jié)果見表5，復(fù)合香味見表6。

表5 3株誘變菌種兩兩等比例組合7 d代謝產(chǎn)物(mg/100 mL)

表6 3株菌種組合后復(fù)合香氣鑒定表

結(jié)合表5 分析，組合之后的菌種己酸產(chǎn)量依次是F1＞F3＞F2。而且F1 己酸產(chǎn)量均高于Y28 和XYD1#兩株單菌種。說明組合菌種在產(chǎn)己酸方面是相互促進(jìn)的。各方案己/丁比值仍然是F1＞F3＞F2，說明F1丁酸轉(zhuǎn)化己酸較F2、F3更加徹底。

結(jié)合表6 分析，F(xiàn)1、F3 復(fù)合香氣較F2 濃郁。F1、F2、F3均無異雜味。

結(jié)合代謝產(chǎn)物和感官鑒定綜合分析，組合之后的菌種無論是己酸產(chǎn)量還是復(fù)合香氣方面都優(yōu)于單一菌種，而且組合之后的F1要優(yōu)于F2、F3。

3 結(jié)論

3.1 試驗(yàn)室己酸菌種209#經(jīng)過復(fù)壯后進(jìn)行紫外線誘變，設(shè)計(jì)不同試驗(yàn)方案摸索紫外線誘變最佳條件。通過檢測(cè)菌種致死率，確定209#己酸菌最適誘變條件為：19 W 紫外燈、波長(zhǎng)245 nm、照射距離38 cm、照射時(shí)間2 min。

3.2 紫外線誘變后菌種采用平板厭氧分離，得到36 株單菌株。通過對(duì)其代謝產(chǎn)物檢測(cè)篩選得到1株正突變菌株，命名為XYD1#。

3.3 利用XYD1#為出發(fā)菌株，設(shè)計(jì)不同濃度的氯化鋰添加方案進(jìn)行二次誘變，誘變后采用平板厭氧分離計(jì)數(shù)。氯化鋰添加量為0.9%的誘變方案致死率為76.92%，為最適誘變方案。分離得到28 株單菌株，通過檢測(cè)代謝產(chǎn)物，篩選得到兩株正突變菌株，命名為Y18和Y28，己酸產(chǎn)量分別為786 mg/100 mL、803 mg/100 mL；兩株未突變菌株命名為Y11、Y19，己酸產(chǎn)量為632 mg/100 mL、648 mg/100 mL，與出發(fā)菌株XYD1#接近；24 株負(fù)突變菌株，己酸產(chǎn)量均低于100 mg/100 mL。

3.4 選取XYD1#、Y18、Y28 3 株正突變菌株進(jìn)行同步培養(yǎng)，通過逐天跟蹤其代謝產(chǎn)物，繪制出3 株菌種的代謝產(chǎn)物變化圖。了解各菌株代謝產(chǎn)物變化規(guī)律，摸索其生長(zhǎng)規(guī)律，利于后期培養(yǎng)應(yīng)用。

3.5 將XYD1#、Y18、Y28 3 株菌種進(jìn)行兩兩等比例混合，同時(shí)應(yīng)用到己酸生產(chǎn)車間800 kg 不銹罐中，同步培養(yǎng)7 d。通過分析代謝產(chǎn)物產(chǎn)量及結(jié)構(gòu)，結(jié)合香氣鑒定，最終確定F1 為最優(yōu)組合（即Y28∶XYD1#=1∶1），可應(yīng)用于車間生產(chǎn)，為提高原酒中己酸乙酯含量提供菌種保障。