廣西南丹白褲瑤蠶對家蠶微孢子的感染性試驗

張桂征，黃深惠，夏青，陸俁伽，黃旭華，劉艷偉，陶積陽，張雨麗*

（1.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術推廣站，南寧市 530007；2.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學研究院，南寧市 530007）

家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis，Nb）于19 世紀中期在家蠶中分離并命名，是第一個被人類認識的微孢子蟲［1］。該病原可通過食下和胚胎傳染2 種途徑感染家蠶，給養(yǎng)蠶業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失［2］，是蠶種生產(chǎn)的唯一法定檢疫對象。早在1982 年，張遠能等［3］通過試驗發(fā)現(xiàn)家蠶品種對蠶病的抵抗性是有差異的，微粒子病也一樣，這些差異說明家蠶不同品種中存在著各種抗病基因或感受基因，可以為家蠶抗病品種的選育提供遺傳基礎。后期的眾多研究也證明，不同家蠶品種對家蠶微粒子病的抗性不同［4-6］。有學者提出利用家蠶品種之間對微粒子病的抵抗力存在的差異性，篩選出抗性強的品種作為育種材料，進行微粒子病抗病品種的選育，以開拓家蠶微粒子病防控的新途徑［7］。因此，尋找對家蠶微粒子病抗性強的品種對家蠶品種選育具有重要意義。

廣西南丹白褲瑤蠶是南丹白褲瑤族群眾自繁、自育、自用的一個家蠶品種［8］，主要分布在廣西南丹縣里湖自治鄉(xiāng)和八圩瑤族自治鄉(xiāng)，自白褲瑤民族于宋朝遷入廣西南丹即開始在此地飼養(yǎng)至今，是一個血統(tǒng)比較純正的家蠶品種。白褲瑤民族視瑤蠶為神圣之物，飼養(yǎng)瑤蠶取絲制衣早已貫穿于白褲瑤民族婚喪嫁娶等生產(chǎn)生活的方方面面［9］。張桂征等［10］測定了南丹白褲瑤蠶線粒體基因組，并與野桑蠶和家蠶進行比對，發(fā)現(xiàn)瑤蠶屬于家蠶，是一個獨特的家蠶品種資源，需要高度重視對其的保護與開發(fā)。受當?shù)仫L俗的影響，白褲瑤族人民不愿意接受外界先進的養(yǎng)蠶技術，甚至飼養(yǎng)的瑤蠶都不給外人觀看和接觸。迄今為止，白褲瑤族仍然按照人蠶共室、從不消毒防病等原始、粗放的方式飼養(yǎng)，自行制種繼代，也從來不進行微粒子病毒的檢疫。這種飼養(yǎng)方式導致蠶病發(fā)生嚴重，常有顆粒無收的現(xiàn)象出現(xiàn)。當?shù)剞r(nóng)業(yè)管理部門的工作者曾調(diào)查發(fā)現(xiàn)，南丹飼養(yǎng)白褲瑤蠶發(fā)生的蠶病主要是微粒子病、膿病和細菌?。?］。閉立輝等［11］曾在南丹縣農(nóng)業(yè)局的幫助下收集到當?shù)匕籽潿幾宓纳倭啃Q蛹，制種后母蛾及雄蛾的微粒子孢子檢出率均為100%，且鏡檢視野中微粒子孢子密度大，病原體數(shù)量較多，但南丹白褲瑤蠶依然一代代地傳承至今。家蠶微孢子與白褲瑤蠶共存，飼養(yǎng)至今，白褲瑤蠶是否對家蠶微粒子病具有較強的抗性仍未可知。鑒于此，本試驗通過人工添食家蠶微孢子，調(diào)查白褲瑤蠶的食下感染率，以研究白褲瑤蠶對家蠶微孢子的耐受性，為瑤蠶的保護與開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

家蠶品種：932，二化含多化血統(tǒng)的四眠性家蠶品種，為廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術推廣站（下稱廣西蠶業(yè)技術推廣站）保存的資源；兩廣二號，四元雜交的一代雜交生產(chǎn)用種，由廣西蠶業(yè)技術推廣站提供；白褲瑤蠶，一化三眠性家蠶品種，由廣西蠶業(yè)技術推廣站家蠶遺傳育種研究團隊從南丹里湖白褲瑤自治鄉(xiāng)采集、篩選出不帶微粒子孢子的個體繼代并保存。

家蠶微孢子（Nosema bombycis，Nb）：由廣西蠶業(yè)技術推廣站家蠶病蟲害研究室提供。供試桑葉為廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術推廣站內(nèi)種植的桂桑優(yōu)62。

1.2 試驗方法

1.2.1 家蠶微孢子的繁殖與分離純化 飼養(yǎng)兩廣二號至1齡眠。取出保存的Nb懸液，配置成2.0×105個/mL 的孢子液，將桑葉浸入其中2 分鐘，然后取出稍微晾干，直接飼喂上述兩廣二號的2齡起蠶。飼喂12 h 后，換成正常桑葉繼續(xù)飼養(yǎng)至5 齡第2 d，饑餓處理1 d，并分別取發(fā)病蠶體進行Nb 的提取、純化與精制。

1.2.2 微孢子液的配置 取上述提純的新鮮Nb 孢子液，利用無菌水按10 倍梯度稀釋成3.0×103、3.0×104、3.0×105和3.0×106個/mL4 個濃度?？瞻讓φ帐褂脽o菌水。

1.2.3 添食用桑葉的準備 采新鮮的適熟桑葉，使用含有效氯0.3%的溶液浸泡消毒，然后清水漂洗干凈，晾干備用。

1.2.4 家蠶飼養(yǎng)及添食方法 飼養(yǎng)供試家蠶品種至2 齡起蠶，然后計數(shù)分區(qū)，每個微孢子濃度梯度為一個試驗組，每個試驗組設3 個重復區(qū)，每區(qū)30 頭蠶?？瞻讓φ蘸?個微孢子液濃度共5個試驗組，一個品種總共需要15區(qū)，450頭健康的蠶。

取配制好濃度的孢子原液0.1 mL，均勻涂抹于面積為8.0 cm2的上述消毒晾干并裁切好的桑葉片上，按相應試驗組進行飼喂，每區(qū)蠶飼喂2 片。以涂抹等量無菌水的桑葉作為空白對照飼喂對照區(qū)。待蠶吃凈添食的葉片，撒石灰于蠶座，并更換蠶座紙，改用潔凈桑葉飼養(yǎng)至5齡（瑤蠶為4齡）第3 d，饑餓處理1 d。然后單頭研磨碎涂片，使用顯微鏡對各區(qū)每一頭家蠶進行檢驗（包括飼養(yǎng)過程中出現(xiàn)的病死蠶），調(diào)查各區(qū)微孢子感染率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Reed-Muench法［12］計算微孢子蟲對家蠶的半數(shù)感染濃度（IC50）；通過EXCEL（2016）計算各試驗組調(diào)查指標的平均值和標準差；使用SPSS（22.0）軟件進行置信區(qū)間計算，并進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 白褲瑤蠶對家蠶微粒子孢子（Nb）食下感染情況

白褲瑤蠶對家蠶微粒子孢子（Nb）食下感染率如圖1 所示。結果表明，空白對照區(qū)均未檢出微孢子，該次添食試驗沒有造成污染或交叉感染；隨著添食的微孢子液濃度增加，家蠶的感染率逐漸增高；家蠶微孢子濃度達到3.0×105個/mL 時，瑤蠶的感染率達到100%，顯示Nb對白褲瑤蠶也有很強的侵染性。

圖1 白褲瑤蠶二齡起蠶對Nb的食下感染率

2.2 白褲瑤蠶與932對Nb食下感染率差異

對白褲瑤蠶和932 在同等條件下進行Nb 的添食，調(diào)查發(fā)現(xiàn)Nb 濃度在3.0×103個/mL 時，瑤蠶的感染率與932一致；在濃度達到3.0×105個/mL時，瑤蠶的食下感染率達到100%；但932的食下感染率為98.85%，略低于瑤蠶。在3.0×104個/mL和3.0×105個/mL濃度下，瑤蠶的感染率均略高于932，結果見表1。差異顯著性分析表明，各個微粒子濃度梯度下，瑤蠶的食下感染率與932 均無顯著差異。該結果顯示，瑤蠶對Nb的耐受性并不強，且略低于普通家蠶品種932。

表1 白褲瑤蠶與932對Nb食下感染率

2.3 Nb對白褲瑤蠶和932的半數(shù)感染濃度（IC50）

使用不同濃度梯度的Nb 分別感染白褲瑤蠶和932的二齡起蠶，統(tǒng)計感染頭數(shù)、計算出感染率，并使用Reed-Muench 法計算出Nb 對白褲瑤蠶的半數(shù)感染濃度為3.72×104個/mL，對932 的半數(shù)感染濃度為4.08×104個/mL，結果見表2。該結果表明，932 的半數(shù)感染濃度略高于白褲瑤蠶。

表2 Nb對白褲瑤蠶和932的IC50及95%置信區(qū)間

3 小結與討論

3.1 小結

本試驗通過人工定量添食的方法，調(diào)查本課題組從廣西南丹縣采集并篩選保存下來的白褲瑤蠶對家蠶微孢子的感染情況，以研究瑤蠶對家蠶微孢子的耐受性。試驗結果表明，Nb 對瑤蠶的半數(shù)感染濃度為3.72×104個/mL，略低于普通家蠶品種932，即瑤蠶對Nb 的耐受性與普通家蠶一致，沒有特殊的抗性。

3.2 討論

家蠶微粒子病曾經(jīng)給養(yǎng)蠶業(yè)帶來過毀滅性的危害，法國微生物學家、化學家路易· 巴斯德（Louis Pasteur，1822—1895年）團隊研究發(fā)現(xiàn)通過淘汰有病母蛾所產(chǎn)蠶卵可有效防控微粒子病的流行，以后逐步建立家蠶微粒子病的防控體系［2］。中國于1986年把家蠶微粒子病列入《動物檢疫》目錄［13］。白褲瑤飼養(yǎng)蠶自宋朝至今均未進行過微粒子病的防控，竟沒有造成絕種。有人認為是瑤蠶對微粒子病具有較強的抗性，但本試驗結果卻證明瑤蠶對家蠶微孢子的食下抵抗性一般，與常規(guī)家蠶品種932沒有顯著的差異。

廣西現(xiàn)行生產(chǎn)應用的家蠶一代雜交種親本品種7532、932、8810、NC99R等對家蠶微粒子的抗性沒有顯著差異，各品種的半數(shù)感染濃度（IC50）范圍為2.26×104～4.43×104個/mL［14］，本試驗調(diào)查的IC50值在其范圍內(nèi)。沈中元等［5］發(fā)現(xiàn)家蠶對微孢子蟲抗性與化性有關，多化性家蠶品種的半數(shù)感染劑量（ID50）指數(shù)低，屬于敏感品種。據(jù)調(diào)查，瑤蠶為中國系統(tǒng)，一化性三眠家蠶品種，繭色金黃，不能繅絲，僅能生產(chǎn)平板絲［15］。本試驗結果顯示，雖然瑤蠶對家蠶微孢子沒有特殊抗性，但與普通家蠶品種932 差異不顯著，不是敏感品種，屬于一般水平。

白褲瑤族人民一直飼養(yǎng)瑤蠶，然后讓其吐平板絲，所吐的平板絲用于做衣服（主要是裝飾裙邊），剩下的蠶蛹待化蛾后讓其自然交配產(chǎn)卵，蠶卵保留到來年繼續(xù)飼養(yǎng)、繼代。白褲瑤族獨特的蠶絲文化體現(xiàn)在物質(zhì)以及精神等諸多方面，其傳承方式早已與他們的生活習俗融為了一體［9］?！澳系が幮Q平板絲”于2020年被認定為國家地理標志性產(chǎn)品［16］。建立南丹瑤蠶特色地方蠶種質(zhì)資源原生態(tài)保護區(qū)成為科技創(chuàng)新支撐工程中的重要組成部分，該工作已被列入廣西蠶桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展“十四五”規(guī)劃。由此可見，南丹白褲瑤蠶的保護與開發(fā)利用的重要性已經(jīng)得到社會的關注與認可，但白褲瑤蠶種源逐步減少、瀕臨滅絕的現(xiàn)狀不容樂觀。白褲瑤蠶對Nb 沒有特殊抗性的試驗結果也顯示對該品種資源的保護具有較高的難度。

有研究表明，白褲瑤蠶帶微粒子孢子的母蛾產(chǎn)下的卵中有70.41%發(fā)生胚種感染，只有29.59%的卵孵化出的蟻蠶不受感染；而且胚種感染的蟻蠶絕大多數(shù)在小蠶期發(fā)病死亡，只有12.23%的能存活到大蠶期，但未發(fā)現(xiàn)能存活至結繭的［11］。這些數(shù)據(jù)顯示，白褲瑤蠶在不進行微粒子病檢疫等措施下，自行飼養(yǎng)繼代的壓力是非常大的。

有調(diào)查顯示，廣西家蠶原種生產(chǎn)過程中，家蠶原種微粒子病檢出率在不同月份間存在差異，有些月份間達到極顯著差異，說明在蠶種生產(chǎn)中氣候環(huán)境條件差異對微粒子病的發(fā)生有重要影響［14］。劉吉平等［17］分析研究表明，廣東省全年原種微粒子病發(fā)病率與年平均氣溫及其距平有極顯著的正相關關系，氣溫是影響原種微粒子病流行發(fā)生的重要原因之一。每年春節(jié)后桑樹開始發(fā)芽時，白褲瑤族人民就將自留的瑤蠶種置于火塘邊上進行催青，該時期的溫度尚低，所以推測瑤蠶沒有大規(guī)模暴發(fā)微粒子病而絕種的原因與其飼養(yǎng)溫度低有關。而且白褲瑤族人民在飼養(yǎng)瑤蠶時拒絕串戶，不愿意給外人觀看和接觸瑤蠶。這一風俗從養(yǎng)蠶防病的角度來看是有科學意義的，可以看作是白褲瑤族人民飼養(yǎng)瑤蠶過程中一個重要防病措施。此外，高娜等［18］研究表明家蠶對微孢子蟲的食下感染率與齡期有關，5齡第3天幼蟲對家蠶微孢子蟲的抗性強于3齡起蠶；瑤蠶齡期經(jīng)過短，可能是一個有利因素。但瑤蠶在從未進行微粒子病防控的情況下，依然能夠傳承不斷、種源沒有毀滅的原因有待于進一步研究。