一株異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離鑒定及其在垃圾滲濾液中的應(yīng)用

阮明君，鐘梓杰，余發(fā)杰，姚宇泰，朱劍鋒，胡文鋒，，胡 斌

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.生物源生物技術(shù)（深圳）股份有限公司，廣東 深圳 518000；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，廣東 廣州 510640）

【研究意義】當(dāng)前，城市垃圾的年產(chǎn)生量極速增長(zhǎng)，預(yù)計(jì)到2025 年，城市生活垃圾將超過(guò)5.1億t。城市生活垃圾在填埋過(guò)程中，由于微生物發(fā)酵、降解等作用，垃圾中的污染物與降雨等混合后會(huì)形成垃圾滲濾液。垃圾滲濾液具有氨氮含量高、有機(jī)物成分眾多、重金屬含量高、水質(zhì)變化復(fù)雜等特點(diǎn)［1］，滲濾液中含有的大量氮素會(huì)嚴(yán)重污染地表水或地下水，造成水體富營(yíng)養(yǎng)化，此外，如果垃圾滲濾液不經(jīng)過(guò)有效處理就直接排放，不僅會(huì)構(gòu)成環(huán)境問(wèn)題，污染物還會(huì)進(jìn)入食物鏈，威脅人類(lèi)健康。因此，垃圾滲濾液需要進(jìn)一步處置。目前，垃圾滲濾液處理方法包括物化法、生化法以及組合工藝法等。物化法脫氮一般只能除去氨氮；生物法脫氮能通過(guò)硝化和反硝化作用，將有機(jī)氮、氨氮轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮物如N2，從而將氮素從水體中脫除，具有能耗低、安全穩(wěn)定、脫氮完全等特點(diǎn)［2］。因此，篩選能高效脫氮的微生物，具有實(shí)際的應(yīng)用意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】傳統(tǒng)的生物脫氮技術(shù)分為硝化過(guò)程和反硝化過(guò)程，硝化過(guò)程是由高好氧的自養(yǎng)硝化菌將氨氮氧化為亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮；反硝化過(guò)程為厭氧，由反硝化細(xì)菌將亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮反硝化為氣態(tài)氮。由于兩種微生物生長(zhǎng)的條件不同，硝化和反硝化無(wú)法在同一條件完成，且自養(yǎng)硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)會(huì)受到高濃度氨氮和亞硝態(tài)氮的抑制，從而限制了自養(yǎng)硝化細(xì)菌更廣泛的應(yīng)用［3］。異養(yǎng)硝化微生物具有繁殖快、耐受高溶氧、環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)以及能同步去除有機(jī)物等優(yōu)點(diǎn)［4］，在生物脫氮中具有良好的應(yīng)用前景。近年來(lái)，具有異養(yǎng)硝化作用功能的細(xì)菌被作為生物脫氮系統(tǒng)中潛在的微生物群，得到廣泛的關(guān)注和研究。但是國(guó)內(nèi)外對(duì)異養(yǎng)硝化菌的研究起步較晚，在實(shí)際的生物脫氮中，菌株受環(huán)境因素影響較大，從而限制其應(yīng)用。報(bào)道較多的異養(yǎng)硝化微生物包括不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactersp.）［5］、芽孢桿菌屬（Bacillussp.）［6］、假單胞菌屬（Pseudomonaceaesp.）［7］、無(wú)色桿菌屬（Achromobactersp.）［8］等。【本研究切入點(diǎn)】目前針對(duì)異養(yǎng)硝化菌的研究多集中于菌株的脫氮性能研究，對(duì)其處理高濃度垃圾滲濾液廢水的實(shí)際應(yīng)用研究較少，但經(jīng)過(guò)生物法處理后的垃圾滲濾液中的氨氮含量能達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)，處理后的污泥含有大量的脫氮微生物，因此，本研究嘗試從活性污泥樣品中富集、分離異養(yǎng)硝化細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在為異養(yǎng)硝化微生物處理垃圾滲濾液廢水的實(shí)際應(yīng)用及理論研究提供支撐?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】開(kāi)展菌株形態(tài)學(xué)觀察和分子學(xué)鑒定，并分析不同因素對(duì)菌株降解氨氮效果的影響。將該菌株用于垃圾滲濾液廢水中，探究其在滲濾液中的異養(yǎng)硝化作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

細(xì)菌分離所采集的樣品來(lái)自某污水處理廠的活性污泥，垃圾滲濾液采自廣州市白云區(qū)興豐垃圾填埋場(chǎng)，儲(chǔ)存于白色聚乙烯瓶中。垃圾滲濾液呈淡茶色、深褐色，有極重的垃圾腐敗臭味。通過(guò)測(cè)定，垃圾滲濾液廢水水質(zhì)指標(biāo)為：pH7.8，COD 5 042.51 mg/L，TN 4 697.26 mg/L，NH4+-N 3 456.17 mg/L。

參考李珍陽(yáng)等［9］的方法配制以下培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.5 g/L,CH3COONa 5 g/L,維氏鹽溶液50 mL，調(diào)節(jié)pH 至7.5～8.0；分離純化培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.5 g/L,CH3COONa 5 g/L,維氏鹽溶液50 mL，瓊脂粉 20 g/L，調(diào)節(jié)pH 至7.5；篩選培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.5 g/L，CH3COONa 5 g/L，維氏鹽溶液50 mL，調(diào)節(jié)pH 至7.5；維氏鹽溶液：K2HPO45 g/L,MgSO4·7H2O 2.5 g/L，NaCl 2.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L。培養(yǎng)基配制好后，于121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離與篩選 稱(chēng)取污泥樣品2.0 g，加入裝有150 mL 的異養(yǎng)硝化富集培養(yǎng)基中，震蕩均勻。置于30 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)24 h 后，取細(xì)菌富集液2 mL，轉(zhuǎn)接于新鮮的異養(yǎng)硝化富集培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，按上述步驟重復(fù)4 次，以提高富集液中細(xì)菌的濃度。

吸取細(xì)菌富集液1 mL，稀釋至10-1～10-9等梯度濃度，選擇10-4、10-5、10-6稀釋濃度，取該濃度梯度的菌液，于異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基固體平板涂布，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。待平板長(zhǎng)出菌落，觀察菌落形態(tài)，用接種環(huán)挑出所有不同形態(tài)的單菌落，劃線純化2～3 次，直至獲得單一形態(tài)的純菌株，對(duì)純化出的單菌落進(jìn)行編號(hào)。

將分離出的純菌株接種至20 mL 異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，24 h 后取對(duì)照組菌液、樣品組菌液，連續(xù)5 d 檢測(cè)其氨氮濃度變化，選取有較好降解效果的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 異養(yǎng)硝化細(xì)菌的鑒定 菌株形態(tài)特征觀察及生理生化鑒定：觀察平板上生長(zhǎng)的單菌落形狀、大小、粘度等特征；利用光學(xué)顯微鏡對(duì)細(xì)胞形態(tài)、大小等特征進(jìn)行觀察并記錄；對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

菌株分子學(xué)鑒定：把純化后的菌株接種到篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行序列比對(duì)，用MEGA X.進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 菌株脫氮性能影響因素研究 實(shí)驗(yàn)選取溫度、轉(zhuǎn)速、接種量、初始pH、碳源種類(lèi)5 個(gè)條件，研究菌株氨、氮降解能力。溫度設(shè)置為15、20、25、30、35 ℃，轉(zhuǎn)速設(shè)置為0、50、100、150、200 r/min，接種量設(shè)置為2%、4%、6%、8%、10%，初始pH 設(shè)置為5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，碳源種類(lèi)包括乙酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖、丁二酸鈉。根據(jù)不同的因素水平設(shè)置單一變量，將菌株按不同接種量接種于異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)，每隔24 h 取樣，以未接菌作為空白對(duì)照，檢測(cè)氨氮濃度變化，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行記錄整理。

1.2.4 菌株在垃圾滲濾液中的脫氮性能研究 在滅菌后垃圾滲濾液中接入菌株，按照6%接種量，于30 ℃、pH7.5、150 r/min 條件下進(jìn)行恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每隔12 h 取樣，檢測(cè)NH4+-N、NO2--N、NO3--N 的濃度，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行記錄整理。以滅菌后垃圾滲濾液、不接種菌株作為對(duì)照。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

NH4+-N 的測(cè)定采用納氏試劑檢測(cè)法，參考國(guó)家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)《水質(zhì)氨氮的測(cè)定采用納氏試劑分光光度法》（HJ 535-2009）；NO2--N 的測(cè)定采用鹽酸萘乙二胺檢測(cè)法，參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《水質(zhì)亞硝酸鹽氮的測(cè)定—分光光度法》（GB 7493-87）；NO3--N 的測(cè)定采用紫外分光光度法，參考環(huán)境保護(hù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水質(zhì)硝酸鹽氮的測(cè)定—紫外分光光度計(jì)法》（HJ/T 346-2007）；OD600的測(cè)定采用光密度法。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS23.0 軟件的One-way ANVOA 程序進(jìn)行分析，使用Duncan進(jìn)行方差分析，使用Origin 2018 繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)從污泥中初步分離出5 株氨氮降解率高的菌株。將其接種于液體培養(yǎng)基后，以未接種菌株的培養(yǎng)基作為對(duì)照，選擇氨氮降解率最高、生長(zhǎng)能力旺盛的1 株菌純化培養(yǎng)，編號(hào)為XJ-1。

2.2 菌株形態(tài)、生理生化特征

菌株XJ-1 在培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)良好，菌落形態(tài)特征為乳白色不透明、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊（圖1）；細(xì)胞形態(tài)觀察及染色結(jié)果顯示為革蘭氏陰性短桿菌（圖2）。

圖1 菌株XJ-1 的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain XJ-1

圖2 菌株XJ-1 的革蘭氏染色結(jié)果（×1000）Fig.2 Gram staining results of strain XJ-1（×1000）

菌株XJ-1 的生理生化特性：葡萄糖利用、蔗糖利用、葡萄糖酸鹽、丙二酸鹽、甘露糖、氧化酶反應(yīng)、VP、MR、明膠水解試驗(yàn)均為陰性，檸檬酸鹽試驗(yàn)為陽(yáng)性。

2.3 16S rDNA 序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用PCR 擴(kuò)增技術(shù)獲取目的基因，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)目的基因進(jìn)行檢測(cè)，凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。XJ-1 的核酸序列長(zhǎng)度為1 412 bp。

圖3 菌株XJ-1 的凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Gel electrophoresis results of strain XJ-1

通過(guò)MEGA X 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，XJ-1 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖4 所示。XJ-1 與不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactersp.）中的微生物親緣關(guān)系接近。

圖4 菌株XJ-1 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain XJ-1

2.4 不同因素對(duì)菌株脫氮效果的影響

2.4.1 溫度對(duì)脫氮效果的影響 溫度是影響脫氮過(guò)程的關(guān)鍵因素之一，硝化細(xì)菌對(duì)溫度十分敏感。一般情況下，當(dāng)環(huán)境溫度低于10 ℃時(shí)，硝化作用會(huì)受到嚴(yán)重抑制［10］。由圖5 可知，菌株XJ-1能在15～35 ℃條件下生長(zhǎng)，并進(jìn)行硝化作用。當(dāng)溫度為15 ℃時(shí)，菌株生長(zhǎng)緩慢，氨氮降解率為37.83%；溫度升至30 ℃，氨氮降解率最大，為69.64%；隨著溫度繼續(xù)增加，菌株在35 ℃下培養(yǎng)后，氨氮降解率降低為58.17%。Zhao 等［11］從養(yǎng)豬廢水中分離到1 株不動(dòng)桿菌TAC-1，菌株在低溫條件下具有較高的氨氮代謝能力，在5 ℃條件下，TAC-1 對(duì)NH4+-N、NO3--N 和NO2--N的降解率分別為94.6%、93.3%和42.4%。試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株XJ-1 在低溫條件下也能生長(zhǎng)，推測(cè)可能是在長(zhǎng)期富氮的水體中，往往同時(shí)含有NH4+和NO3-，并且低溫時(shí)水體中的溶解氧水平較高，會(huì)存在能夠同時(shí)進(jìn)行硝化和反硝化過(guò)程的微生物，從而提高水體中NH4+-N 或NO3--N 的去除效率［12］。因此，菌株XJ-1 對(duì)低溫的耐受力強(qiáng)，能夠適應(yīng)溫度波動(dòng)較大情況下的滲濾液廢水處理情況。

圖5 不同溫度對(duì)菌株XJ-1 氨氮降解率的影響Fig.5 Effe cts of different temperatures on ammonia nitrogen degradation rate of strain XJ-1

2.4.2 轉(zhuǎn)速對(duì)異養(yǎng)硝化特性的影響 Qin 等［13］指出，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)的溶解氧在達(dá)到飽和前，與搖床的轉(zhuǎn)速呈正相關(guān)，隨著振蕩速度的增加，培養(yǎng)液中的溶解氧水平逐漸增加。因此，試驗(yàn)可以設(shè)置不同的轉(zhuǎn)速值，以改變培養(yǎng)基中的溶解氧含量。溶解氧是氨氧化過(guò)程中的重要因素，是好氧微生物進(jìn)行硝化過(guò)程的重要電子受體，對(duì)微生物生長(zhǎng)和氨氧化效率具有重要的影響，溶氧量越大，微生物對(duì)氨氮的利用率越高［14］。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在0～150 r/min 范圍內(nèi)，隨著轉(zhuǎn)速提高，溶解氧水平增加，氨氮降解率有所提高，當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min 時(shí)，氨氮降解率達(dá)到67.26%。但當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r/min 時(shí)，氨氮降解率有所下降，但差異不明顯（圖6）。

圖6 不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌株XJ-1 氨氮降解率的影響Fig.6 Effects of different shaking speeds on ammonia nitrogen degradation rate of strain XJ-1

2.4.3 接種量對(duì)脫氮效果的影響 接種量的大小會(huì)影響到微生物生長(zhǎng)速度。接種量過(guò)低，菌株的生長(zhǎng)適應(yīng)期會(huì)延長(zhǎng)，培養(yǎng)時(shí)間會(huì)增加，影響脫氮效果；接種量適當(dāng)增加，可以提高硝化效率；隨著接種量繼續(xù)增大,培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)法滿足菌株的生長(zhǎng)需求，限制了菌體的繼續(xù)生長(zhǎng)，且會(huì)使已有的菌株發(fā)生自溶，導(dǎo)致微生物活性降低［15］。試驗(yàn)選擇5 個(gè)梯度濃度的接種量，由圖7 可知，當(dāng)接種量為6%時(shí)，菌株XJ-1 的氨氮降解效果最好，達(dá)到68.93%，但各接種量處理間的氨氮降解率差異不明顯。當(dāng)菌體細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，氨氮降解率均較高，表明氨氮的降解不僅是由于細(xì)胞生長(zhǎng)所引起，其細(xì)胞代謝也可能起到重要作用。吳建江等［16］對(duì)菌株XS76 進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明2%～10%接種量下的氨氮降解率無(wú)較大差異，且氨氮?dú)埩袅亢途w生長(zhǎng)量接近，培養(yǎng)基中的pH值均有升高的趨勢(shì)。因此，試驗(yàn)結(jié)果與前人研究相似，同時(shí)考慮到接種量升高會(huì)增加成本，故選取6%作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)接種量。

圖7 不同接種量對(duì)菌株XJ-1 氨氮降解率的影響Fig.7 Effects of different inoculation amounts on ammonia nitrogen degradation rate of strain XJ-1

2.4.4 pH 對(duì)異養(yǎng)硝化特性的影響 pH 升高或降低，微生物的細(xì)胞膜電位會(huì)發(fā)生改變，酶的活性也發(fā)生改變，影響微生物生長(zhǎng)［17］。因此，選擇合適的初始pH，對(duì)菌株硝化能力具有重要意義。由圖8 可知，當(dāng)pH 為5.5 時(shí)，氨氮降解率為24.21%，隨著pH 升高至7.5，氨氮降解率為66.92%；當(dāng)pH 升高至9.5，微生物活性受到抑制，氨氮降解率降為45.99%。Zhang 等［18］提出，生物脫氮系統(tǒng)對(duì)pH 較為敏感。一般情況下，pH 與硝化強(qiáng)度高度相關(guān)，低pH 導(dǎo)致異養(yǎng)硝化速率降低，弱堿性條件促進(jìn)硝化作用，低pH 條件抑制異養(yǎng)硝化菌的活性（ANB）；同時(shí)，氨單加氧酶（AMO）是硝化作用的關(guān)鍵酶之一，pH 值變化也會(huì)影響培養(yǎng)基中游離氨和AMO 活性［19］。本研究分離的XJ-1 菌株在弱酸、中性、弱堿條件下均能生長(zhǎng)，且在弱堿條件生長(zhǎng)性能更好，與前人研究結(jié)果一致。

圖8 不同pH 對(duì)菌株XJ-1 氨 氮降解率的影響Fig.8 Effects of different pH on ammonia nitrogen degradation rate of strain XJ-1

2.4.5 碳源種類(lèi)對(duì)異養(yǎng)硝化特性的影響 碳源為微生物生命活動(dòng)提供能量的同時(shí)，也能參與其各種代謝過(guò)程，因此，探究最適合微生物降解氨氮的碳源有助于菌株XJ-1 處理廢水。葡萄糖、蔗糖、乙酸、檸檬酸和琥珀酸都是培養(yǎng)異養(yǎng)硝化菌常用的碳源，但不同微生物對(duì)碳源的利用存在明顯差異，同一菌株的硝化能力隨碳源的不同也會(huì)有差異，當(dāng)碳源類(lèi)型為丙酮酸、檸檬酸或醋酸時(shí)，培養(yǎng)后pH 會(huì)升高；當(dāng)蔗糖和葡萄糖作為碳源時(shí)，培養(yǎng)后pH 會(huì)降低［20］。試驗(yàn)結(jié)果（圖9）表明，菌株XJ-1 能在以乙酸鈉、檸檬酸鈉和丁二酸鈉為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，對(duì)蔗糖的利用程度非常低，幾乎不能在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基生長(zhǎng)；菌株以乙酸鈉為碳源的培養(yǎng)基中，菌株XJ-1 的降解率為69.56%，菌株XJ-1 利用有機(jī)酸鹽明顯優(yōu)于葡萄糖和蔗糖等常用糖類(lèi)，推測(cè)存在以下原因：當(dāng)使用糖類(lèi)作為碳源時(shí)，培養(yǎng)后pH 會(huì)降低，不利于異養(yǎng)硝化菌生長(zhǎng)；異養(yǎng)硝化菌屬于化能異養(yǎng)微生物，三羧酸循環(huán)是此類(lèi)微生物生物氧化的重要途徑之一，乙酸鈉能被微生物較好地利用，主要是因?yàn)橛袡C(jī)酸鹽相比于糖類(lèi)分子量小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，更利于異養(yǎng)硝化細(xì)菌的直接利用吸收，這與菌株HY13［21］、Y1［22］、TN-10［23］對(duì)有機(jī)酸鹽的利用率高于糖類(lèi)的結(jié)論一致。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)選擇能被微生物利用的合適碳源。

圖9 不同碳源對(duì)菌株XJ-1 氨氮 降解率的影響Fig.9 Effects of different carbon source types on ammonia nitrogen degradation rate of strain XJ-1

2.4.6 菌株在滲濾液中的異養(yǎng)硝化作用 將菌株XJ-1 接種到滅菌后的垃圾滲濾液廢水中，經(jīng)培養(yǎng)96 h 后，NH4+-N、NO2--N、NO3--N 濃度隨時(shí)間的變化如圖10 所示。由圖10 可知，NH4+-N 濃度從初始的545.91 mg/L 降至317.58 mg/L，降解率達(dá)到62.82%，垃圾滲濾液廢水中，有機(jī)物成分復(fù)雜，不同的碳源種類(lèi)為菌體的生長(zhǎng)提供了能量來(lái)源，提高了細(xì)菌的硝化作用和脫氮效率，菌株XJ-1 對(duì)于高濃度氨氮廢水的處理具有良好的效果。在培養(yǎng)結(jié)束后，檢測(cè)滲濾液廢水在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中NO2--N、NO3--N 的濃度變化，結(jié)果未見(jiàn)明顯積累，推測(cè)可能是由于菌株XJ-1 中存在的氨單加氧酶（AM O）將氨氮轉(zhuǎn)化為羥胺或菌體的胞內(nèi)氮［24］；此外，也有可能是菌株XJ-1 消耗了生成的NO2--N，NO3--N 參加 了反硝化反應(yīng)。以上結(jié)果能說(shuō)明菌株XJ-1 不同于傳統(tǒng)硝化細(xì)菌的硝化反應(yīng)，該菌株不僅具有異養(yǎng)硝化能力，還有可能存在反硝化能力。

圖10 菌株XJ-1 在垃圾滲濾液中的異養(yǎng)硝化特性Fig.10 Heterotrophic nitrification characteristics of strain XJ-1 in landfill leachate

由圖11 可知，培養(yǎng)6～18 h 內(nèi)，菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足，生長(zhǎng)迅速。培養(yǎng)24 h，菌株XJ-1 的OD600最大濃度值為1.026，培養(yǎng)24 h 后開(kāi)始有較為明顯的下降趨勢(shì)，此時(shí)菌數(shù)量減少，培養(yǎng)36～96 h 內(nèi)，菌株處于穩(wěn)定期，OD600變化不明顯。菌株XJ-1 的生長(zhǎng)伴著氨氮的降解，培養(yǎng)96 h 后，氨氮降解率達(dá)到62.82%。

圖11 菌株XJ-1 的生長(zhǎng)及在垃圾滲濾液中的氨氮降解率Fig.11 Growth of strain XJ-1 and ammonia nitrogen degradation rate in landfill leachate

3 討論

由于垃圾滲濾液廢水中高濃度的氨氮會(huì)嚴(yán)重影響微生物生長(zhǎng)，甚至致其失活，導(dǎo)致垃圾滲濾液難以處理。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株XJ-1 接種于高濃度滲濾液廢水，經(jīng)過(guò)96 h 培養(yǎng)后，與未接種菌株的廢水對(duì)比，菌株XJ-1 對(duì)滲濾液廢水的脫氮效率為62.82%。與Tai 等［25］的農(nóng)桿菌屬異養(yǎng)硝化菌BT1 試驗(yàn)效果相比，本試驗(yàn)菌株氨氮降解率相對(duì)較低，推測(cè)高濃度氨氮對(duì)菌株的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。因此，后續(xù)研究應(yīng)加強(qiáng)對(duì)菌株在不同因素的條件優(yōu)化，如碳氮比、鹽度、無(wú)機(jī)離子等條件的優(yōu)化，以進(jìn)一步提高異養(yǎng)硝化能力和在高濃度廢水中的應(yīng)用價(jià)值。

（1）碳氮比：碳源和氮源是微生物生長(zhǎng)的重要因素，C/N 直接影響著異養(yǎng)硝化菌的生長(zhǎng)與硝化效率［26］。在傳統(tǒng)硝化過(guò)程中，自養(yǎng)細(xì)菌容易被抑制，不適合處理高氨氮和有機(jī)物濃度高的廢水，因此，常規(guī)硝化一般在降低C/N 或稀釋后進(jìn)行。提高有機(jī)碳濃度將顯著提高異養(yǎng)硝化菌的處理效率，大多數(shù)研究表明，C/N 越高，對(duì)氨的去除越有利［27］，但超過(guò)一定的C/N 范圍，C/N的進(jìn)一步增加并不會(huì)對(duì)硝化性能產(chǎn)生影響［28］。

（2）鹽度：在高鹽度的垃圾滲濾液廢水中，由于滲透壓的急劇增加、微生物代謝的變化和酶活性受到抑制，微生物的處理效率很低［29］。當(dāng)含鹽量超過(guò)2%時(shí)，硝化菌的生長(zhǎng)受到抑制［30］，這是由于鹽減少了培養(yǎng)基和細(xì)胞之間化合物的運(yùn)輸，改變了微生物的代謝，導(dǎo)致脫水和細(xì)胞裂解，直接干擾微生物的生長(zhǎng)和氨氧化的速率［31］。由于垃圾滲濾液中來(lái)源廣泛，不止是生活污水和工業(yè)廢水，含鹽度高，組成成分十分復(fù)雜。因此，選擇合適的鹽度，對(duì)于異養(yǎng)硝化微生物的篩選及處理含鹽廢水十分重要。

（3）無(wú)機(jī)鹽離子：無(wú)機(jī)離子能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓、pH 或氧化還原電位，可以作為硝化作用的輔酶或激活酶，對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝至關(guān)重要［32］。研究指出，F(xiàn)e2+、Fe3+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+等金屬可以提高異養(yǎng)硝化菌對(duì)NH4+-N、TN 和TOC 的去除率，Mg2+能增強(qiáng)菌株的同化作 用［33］。Li 等［34］指出，Mg2+、Zn2+和Mn2+可以增強(qiáng)AMO 酶的活性，催化NH4+轉(zhuǎn)化為NH2OH，提高脫氮效率。垃圾滲濾液廢水中含有較高濃度的無(wú)機(jī)離子，但其對(duì)異養(yǎng)硝化菌株脫氮的影響少有報(bào)道，這限制了異養(yǎng)硝化菌株的進(jìn)一步應(yīng)用。

目前，多數(shù)已報(bào)道的 文獻(xiàn)注重于菌株脫氮性能的鑒定，對(duì)菌株氨氧化功能基因的研究鮮有報(bào)道。Fang 等［35］從表層沉積物中分離到具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化作用的酵母株K1，檢測(cè)到氨單加氧酶編碼活性位點(diǎn)A 的功能基因，亞硝酸鹽還原酶活性位點(diǎn)K 的基因；Ren 等［36］分離出1 株具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力的新菌株HND19，從該菌株中成功擴(kuò)增出參與脫氮過(guò)程的功能基因。因此，后續(xù)研究還可對(duì)菌株XJ-1 參與脫氮過(guò)程的重要基因進(jìn)行擴(kuò)增，探究XJ-1 在硝化過(guò)程中的NH2OH 轉(zhuǎn)化規(guī)律，以進(jìn)一步證明XJ-1 的異養(yǎng)硝化特性、好氧反硝化功能。

4 結(jié)論

從活性污泥中分離出1 株能降解氨氮的異養(yǎng)硝化菌，命名為XJ-1，經(jīng)形態(tài)分析、生理生化鑒定、16S rDNA 基因序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，鑒定該菌株為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobactersp.)。經(jīng)單因素優(yōu)化后，當(dāng)接種量為6%、pH 為7.5、溫度為30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min 時(shí)，氨氮降解率較高；將該菌株用于垃圾滲濾液廢水中，對(duì)其在滲濾液中的異養(yǎng)硝化作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，滅菌后初始氨氮濃度為545.91 mg/L，經(jīng)過(guò)96 h 培養(yǎng)，氨氮濃度降至317.58 mg/L，氨氮降解率達(dá)到62.82%，NO2--N、NO3--N 未見(jiàn)明顯積累，證明該菌株具有一定的硝化能力。