MicroRNA-183對急性主動(dòng)脈夾層細(xì)胞外基質(zhì)重塑的作用及其機(jī)制研究*

韋耀東，袁敏，魏夢瑤，劉岳恒，于洋，蔣璇，趙曄，師恩祎，谷天祥

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心臟外科，遼寧沈陽 110000）

急性主動(dòng)脈夾層（acute aortic dissection, AAD）是一種急性心血管疾病，發(fā)病機(jī)制與主動(dòng)脈中膜細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）的降解有關(guān)。有研究報(bào)道， 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMPs）通過調(diào)節(jié)ECM 重塑，參與胸主動(dòng)脈瘤或胸主動(dòng)脈夾層的發(fā)病，其中MMP-9作為MMPs 家族的一員，具有很強(qiáng)的降解彈性蛋白和膠原蛋白的能力，可導(dǎo)致主動(dòng)脈中層的彈性蛋白和膠原蛋白大量崩解，誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)主動(dòng)脈夾層的形成[1-2]。 MicroRNA（miRNAs）的異常表達(dá)與多種心血管疾病的發(fā)展、發(fā)展有關(guān)[3]，引起人們廣泛關(guān)注。在腫瘤中，細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移與MMP-9 在ECM 重塑和蛋白水解中的作用密不可分[4]，而miR-183 能夠通過靶向調(diào)控MMP-9 的表達(dá)，抑制細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移[5-6]。目前miR-183 在AAD 中的表達(dá)及作用機(jī)制尚不清楚，本研究旨在探討miR-183 和MMP-9在AAD 中的表達(dá)及其作用機(jī)制，以及其參與調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞ECM 的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年8月—2018年8月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的AAD 患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)影像學(xué)診斷為AAD；②簽字接受主動(dòng)脈手術(shù)治療的患者；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①馬方綜合征；②大動(dòng)脈炎；③梅毒性主動(dòng)脈夾層；④主動(dòng)脈粥樣硬化。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入20 例AAD 患者作為AAD 組，其中男性14 例，女性6 例；年齡32～69 歲，平均（52.2±10.6）歲；選取20 例同期本院無主動(dòng)脈病變的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者為NC 組，其中男性12 例，女性8 例；年齡33～65 歲，平均（54.8±9.0）歲。AAD 組標(biāo)本取自升主動(dòng)脈段破口周圍的組織，NC 組標(biāo)本取自在升主動(dòng)脈處打孔的廢棄組織，組織離體后，立即置于液氮中速凍，置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)錂z。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（No：AF-SOP-07-1.1-01）。

1.2 主要試劑與儀器

人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HASMC）（美國ATCC 公司），引物、miRNA-183 mimic、miRNA-183 inhibitor 及RNAifectin?Transfection Reagent（加拿大ABM 公司），RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），兔抗人MMP-9、Elastin 抗體（英國Abcom 公司）。ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）儀（美國ABI 公司）。

1.3 HASMC細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞快速解凍復(fù)蘇，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，置于37%、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中。取增殖狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、計(jì)數(shù)，按1×105個(gè)/孔的密度種植于6 孔板中，待細(xì)胞融合達(dá)70%～80%，按照RNAifectin?Transfection Reagent 說明書實(shí)驗(yàn)步驟用miRNA-183 mimic、miRNA-183 inhibitor 對HASMC 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別作為Mimic 組、Inhibitor 組，同時(shí)設(shè)置空白作為對照組，每組至少3孔。轉(zhuǎn)染后置于培養(yǎng)箱內(nèi)6 h，更換培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR 檢測miRNA-183、MMP-9 mRNA的表達(dá)

采用TRIzol 法提取組織及細(xì)胞中總RNA，檢測RNA 濃度及純度，按照說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按比例加入Master Mix、正反向引物、RNAase-free 水，共20 μL，在qRT-PCR 儀上反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s、60℃退火34 s，共40 個(gè)循環(huán)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算組織miRNA-183 相對表達(dá)量，以及細(xì)胞miRNA-183、MMP-9 mRNA 相對表達(dá)量。引物序列由加拿大ABM 公司提供，具體序列未告知。

1.5 Western blotting檢測MMP-9、Elastin蛋白的表達(dá)

使用RIPA 裂解液提取組織和細(xì)胞中總蛋白，采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，配制SDS-PAGE 凝膠，每個(gè)孔道加入等量蛋白，電泳分離，標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜，用PVDF 膜封閉于含5%脫脂牛奶中，水平搖床上室溫封閉1.5～2.0 h，一抗4℃孵育過夜（MMP-9 稀釋比例1∶3 000，Elastin 稀釋比例1∶300），二抗室溫孵育2 h，使用ECL 發(fā)光液在暗室中發(fā)光顯色。Image J 分析條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，以各目的蛋白與內(nèi)參蛋白的比值作為組織中MMP-9 蛋白，以及細(xì)胞中MMP-9、Elastin 蛋白相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析；進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

AAD 組與NC 組年齡、性別構(gòu)成比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 兩組一般資料比較 （n=20）

2.2 兩組miRNA-183、MMP-9 蛋白相對表達(dá)量比較

兩組miRNA-183、MMP-9 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AAD組miRNA-183 相對表達(dá)量低于NC 組，而MMP-9 蛋白相對表達(dá)量高于NC 組。見表2和圖1。

表2 兩組miRNA-183、MMP-9蛋白相對表達(dá)量比較（n=20，±s）

表2 兩組miRNA-183、MMP-9蛋白相對表達(dá)量比較（n=20，±s）

組別AAD組NC組t 值P 值miRNA-183 0.55±0.21 1.01±0.15-5.668 0.000 MMP-9蛋白0.97±0.04 0.64±0.13 4.728 0.013

圖1 各組MMP-9蛋白的表達(dá)

2.3 轉(zhuǎn)染后各組miRNA-183、MMP-9 mRNA 和蛋白、Elastin相對表達(dá)量比較

對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，Mimic 組、Inhibitor 組、對照組miRNA-183、MMP-9 mRNA 和蛋白、Elastin 相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對照組比較，Mimic組miRNA-183、Elastin 蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05），MMP-9 mRNA 和蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05）；Inhibitor 組miRNA-183、Elastin 相對表達(dá)量降低（P＜0.05），MMP-9 mRNA 和蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）。見表3和圖2。

表3 轉(zhuǎn)染后各組miRNA-183、MMP-9 mRNA和蛋白、Elastin相對表達(dá)量比較 （±s）

表3 轉(zhuǎn)染后各組miRNA-183、MMP-9 mRNA和蛋白、Elastin相對表達(dá)量比較 （±s）

組別miRNA-183 Elastin蛋白Mimic組Inhibitor組對照組F 值P 值1.59±0.19 0.82±0.15 1.01±0.07 33.649 0.000 MMP-9 mRNA 0.62±0.15 1.53±0.17 1.01±0.13 49.109 0.000 MMP-9蛋白0.32±0.03 1.19±0.1 0.69±0.02 139.958 0.000 1.22±0.11 0.31±0.06 0.79±0.04 110.194 0.000

圖2 過表達(dá)或抑制miR-183對MMP-9、Elastin蛋白表達(dá)的影響

3 討論

AAD 是一種嚴(yán)重威脅人類生命的心血管疾病，病情危急兇險(xiǎn)，發(fā)病急驟、進(jìn)展迅速、病死率高，每年發(fā)病率為4/10 萬～7/10 萬，且逐年上升[7-8]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，未經(jīng)治療的Stanford A 型AAD 患者發(fā)病早期的病死率高達(dá)l%～2%/h，48 h 內(nèi)的病死率約為50%[9]。近20年來，隨著影像學(xué)診斷技術(shù)、外科治療技術(shù)和血管內(nèi)治療技術(shù)的進(jìn)步，A 型AAD 患者的總病死率有所下降，且A 型和B 型AAD 患者的手術(shù)病死率顯著下降[10]。目前對AAD 的早期診斷、鑒別診斷、風(fēng)險(xiǎn)分層及預(yù)后評估都有其局限性。因此，積極探索AAD 的發(fā)病機(jī)制，對預(yù)測高發(fā)人群，尋找干預(yù)治療靶點(diǎn)具有重要價(jià)值。

散發(fā)性AAD 的病理特征包括ECM 的改變和平滑肌細(xì)胞的丟失[11-12]，其中ECM 的改變主要是膠原蛋白和彈性蛋白大量降解及表達(dá)下調(diào)[13]。MMPs 是一種鋅依賴性內(nèi)源性蛋白酶家族，在ECM 成分蛋白的重塑和降解中發(fā)揮多種作用。大多數(shù)蛋白水解酶無法降解膠原蛋白和彈性蛋白，而MMPs 對膠原蛋白和彈性蛋白具有極強(qiáng)的降解能力[14]。MMP-9 是一種Ⅳ型膠原蛋白酶，能夠降解多種膠原蛋白，對彈性蛋白同樣具有很強(qiáng)的降解能力[15]。有研究表明，在胸主動(dòng)脈夾層患者的主動(dòng)脈壁中，MMP-9 蛋白主要定位于組織病變嚴(yán)重的區(qū)域[16]，這與其降解膠原蛋白和彈性蛋白的能力有關(guān)。本研究結(jié)果表明，MMP-9 蛋白明顯高表達(dá)，且體外實(shí)驗(yàn)中，Elastin 隨著MMP-9 表達(dá)增加或減少而呈現(xiàn)相反趨勢，這表明在平滑肌細(xì)胞中，MMP-9 能夠促進(jìn)彈性蛋白水解，參與ECM 重塑過程。

miRNAs 是由19～25 個(gè)核苷酸組成的小分子單鏈非編碼RNA，具有高度保守性，以堿基互補(bǔ)配對的方式與靶基因mRNAs 的3＇-非編碼區(qū)特異性結(jié)合，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)，參與大多數(shù)生物過程[17]。AAD 的發(fā)生、發(fā)展與miRNAs 的異常表達(dá)有關(guān)[18]。miR-183 在不同的生物中高度保守，其表達(dá)具有組織特異性。有研究報(bào)道，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中miR-183 通過靶向IDH2，促進(jìn)低氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)缺氧組織的血管生成[19]，miR-183 可通過上調(diào)IRS1 的表達(dá)，增強(qiáng)人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞活性，抑制炎癥水平，抵抗細(xì)胞損傷[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-183 在AAD 患者主動(dòng)脈組織中明顯低表達(dá)，表明miR-183 在血管的病理生理過程中發(fā)揮了作用。為進(jìn)一步探討miR-183 在AAD 中可能的分子機(jī)制，本研究用miR-183 模擬物和抑制物對HASMC 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-183 與MMP-9 存在負(fù)性關(guān)系，因此筆者推測miR-183 可能是通過調(diào)控MMP-9 在AAD 患者體內(nèi)發(fā)揮生物作用。

綜上所述，miR-183 在AAD 患者主動(dòng)脈組織中低表達(dá)，MMP-9 蛋白則高表達(dá)，上調(diào)或下調(diào)miR-183 的表達(dá)能夠在mRNA 和蛋白水平上影響MMP-9的表達(dá)，從而改變Elastin 的表達(dá)水平。miRNA-183調(diào)控平滑肌細(xì)胞中MMP-9 的表達(dá)，參與主動(dòng)脈中膜ECM 重塑過程，為AAD 發(fā)病機(jī)制的研究提供新思路。