基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究千金子二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病的作用機(jī)制

王慧楠，王佩華，楊子燁，張桂梅，陳夢(mèng)雨，姜明瑞，岳珠珠，王志成，張婧秋，王英姿

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488)

千金子為大戟科植物續(xù)隨子(EuphorbialathyrisL.)的成熟種子，辛、溫，有毒，歸肝、腎、大腸經(jīng)，具有瀉下逐水、破血消癥等功效[1]，在治療白血病、食管癌、宮頸癌、腎癌等疾病方面具有良好的療效。千金子含有多種抗腫瘤成分，目前單體成分的抗腫瘤作用研究主要集中在二萜醇酯類(lèi)成分[2-5]。研究表明，千金子甲醇提取物對(duì)人紅白血病細(xì)胞(K 562)、人單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞(U 937)、人急性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞(HL 60)均有較強(qiáng)的抑制作用，呈劑量依賴(lài)性關(guān)系[6]。千金子二萜醇酯類(lèi)成分對(duì)白血病細(xì)胞表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性[7]，可以增加白血病腫瘤細(xì)胞對(duì)多柔比星、長(zhǎng)春新堿、柔紅霉素等抗癌藥的敏感性，還可通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族凋亡蛋白表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞HL-60凋亡[8-11]。提示千金子對(duì)白血病具有明確的治療作用，且二萜醇酯類(lèi)成分是千金子治療白血病的關(guān)鍵單體成分，但目前對(duì)千金子二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病的作用機(jī)制研究較少，極大地限制了千金子的臨床應(yīng)用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強(qiáng)調(diào)研究模式應(yīng)從“疾病-單靶點(diǎn)-單藥物”向“疾病-多靶點(diǎn)-多藥物”轉(zhuǎn)變，其整體性、系統(tǒng)性、考慮相互作用的特點(diǎn)與中醫(yī)藥整體觀相契合，可解決中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的協(xié)同作用特點(diǎn)帶來(lái)的難題，全面揭示中藥與機(jī)體之間的相互關(guān)系及變化規(guī)律[12-13]。因此，本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，全面系統(tǒng)地探討千金子二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病的作用機(jī)制，以期為千金子臨床合理應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1千金子二萜醇酯類(lèi)成分篩選及靶點(diǎn)收集 本研究以“千金子二萜醇酯類(lèi)成分”“白血病”為關(guān)鍵詞在CNKI、萬(wàn)方、PubMed 和Web of Science等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，篩選出具有代表性的二萜醇酯類(lèi)成分，在Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中將篩選出的成分保存為 SDF 格式文件。通過(guò) SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/)和SEA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://sea.bkslab.org/)查詢(xún)成分的潛在作用靶點(diǎn)及基因信息，最后將靶點(diǎn)基因合并，刪除相同基因保留唯一項(xiàng)，即得千金子二萜醇酯類(lèi)成分的靶點(diǎn)。

1.2千金子二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病的作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 采用Gene Cards (https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)查找與白血病相關(guān)的靶點(diǎn)，合并2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)并刪除重復(fù)靶點(diǎn)，得到白血病的相關(guān)靶點(diǎn)基因。將成分作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)上傳至在線(xiàn)韋恩圖(https://bioinfogp. cnb.csic. es/ tools/venny/index.html，VENNY 2.1.0)進(jìn)行映射取交集，獲取千金子二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病的潛在靶點(diǎn)。

1.3千金子二萜醇酯成分治療白血病靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心子網(wǎng)絡(luò)篩選 String(https://string-db.org/，Version:11.0)是一個(gè)在線(xiàn)提供已知蛋白相互作用關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)[14]。為了進(jìn)一步分析千金子二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，將獲得的共有靶點(diǎn)導(dǎo)入到 String 數(shù)據(jù)庫(kù)，以combined score>0.9 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得高質(zhì)量的共有靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)，將信息導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 3.7.2中的MCODE插件，以K-core(4)，Degree Cutoff(4)為標(biāo)準(zhǔn)，篩選核心子網(wǎng)絡(luò)。

1.4生物功能與通路富集分析 生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)(DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)提供了一套全面的功能注釋工具，可以方便地分析基因?qū)?yīng)的生物過(guò)程、生物功能及通路等信息，旨在揭示大量基因列表背后的生物學(xué)意義[15]。為了明確千金子二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病靶點(diǎn)的基因功能及主要信號(hào)通路，將獲取的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，以P≤0.05 作為閾值，進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，最后利用R語(yǔ)言進(jìn)行可視化處理。

1.5千金子“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述7種二萜醇酯類(lèi)成分、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果、富集通路，分別建立成分-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-通路以及通路-疾病之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6分子對(duì)接驗(yàn)證 DockThor(https://dockthor.lncc.br/v2/)是在線(xiàn)進(jìn)行分子對(duì)接的網(wǎng)站，可充分驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測(cè)的可靠性[16]。本研究利用DockThor 對(duì)篩選出的二萜醇酯類(lèi)成分及核心子網(wǎng)絡(luò)中度值靠前的3個(gè)靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。通過(guò)RCSB PDB 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)和PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得靶點(diǎn)蛋白和成分的三維結(jié)構(gòu)，將其導(dǎo)入DockThor數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分子對(duì)接，以結(jié)合能 (affinity) ≤ -5.0 kJ·mol為閾值評(píng)價(jià)結(jié)合活性。

2 結(jié) 果

2.1千金子二萜醇酯類(lèi)成分及其靶點(diǎn)的獲取 通過(guò)檢索相關(guān)文獻(xiàn)，選擇最為重要的7種二萜醇酯類(lèi)成分為研究對(duì)象，分別是千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3、千金子素L7a、千金子素L7b、千金子素L8、千金子素L9，并利用 SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)和SEA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)二萜醇酯類(lèi)成分的作用靶點(diǎn)，共獲得492個(gè)藥物作用靶點(diǎn)，去重后，保留252個(gè)唯一靶點(diǎn)，二萜醇酯類(lèi)成分的基本信息見(jiàn)表1。

表1 千金子二萜醇酯類(lèi)成分基本信息

2.2千金子二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)Gene cards、OMIM數(shù)據(jù)綜合篩選出與白血病相關(guān)的靶點(diǎn)基因共1 670個(gè)，刪除重復(fù)值，保留1 594個(gè)靶點(diǎn)。將千金子二萜醇酯類(lèi)成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)在線(xiàn) Venn 圖可視化分析，得到千金子二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病的潛在作用靶點(diǎn)共75個(gè)，見(jiàn)圖 1。

2.3千金子二萜醇酯成分治療白血病靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心子網(wǎng)絡(luò)篩選 本研究基于 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)分析千金子二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病靶點(diǎn)之間的交互作用，將75個(gè)共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，以交互作用大于0.9為閾值，構(gòu)建千金二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病潛在靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治隹芍?，該網(wǎng)絡(luò)包括 61 個(gè)節(jié)點(diǎn)和 191 條邊(圖2)，節(jié)點(diǎn)表示蛋白，節(jié)點(diǎn)越大則度值越大；邊表示蛋白與蛋白的相互作用關(guān)系，邊越粗代表關(guān)聯(lián)度越大，顏色由深變淺代表度值由大變小。同時(shí)使用MCODE插件提取PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心子網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見(jiàn)表2和圖3。其中，CDK1具有最高的度值，能與 18 個(gè)蛋白發(fā)生相互作用關(guān)系；其次為CDK2、CCNA2，提示這些節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵的作用，是千金子二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

表2 千金子二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病靶點(diǎn)的核心PPI網(wǎng)絡(luò)圖中涉及到的靶點(diǎn)

2.4生物功能與通路富集分析 本研究將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入 DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，以P≤0.05 為條件進(jìn)行生物過(guò)程和通路富集分析，并上傳到R語(yǔ)言數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行可視化處理。GO富集分析共獲得生物過(guò)程(biological process，BP)104 個(gè)，細(xì)胞組成(cellular component，CC)27 個(gè)，分子功能(molecular function，MF)26個(gè)，根據(jù) P值大小，分別列舉了每個(gè)模塊前15的條目，見(jiàn)圖4。由圖可知，生物過(guò)程主要涉及環(huán)氧化酶通路、正向調(diào)控環(huán)化酶活性、紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)、T細(xì)胞激活、正向調(diào)控棕色脂肪細(xì)胞分化、調(diào)控線(xiàn)粒體膜滲透性、有絲分裂中心體分離、調(diào)控細(xì)胞周期阻滯、調(diào)控免疫反應(yīng)、髓系細(xì)胞分化；細(xì)胞功能主要涉及整合素復(fù)合體、客蛋白復(fù)合體、稠環(huán)染色體、著絲粒、細(xì)胞周期依賴(lài)性蛋白激酶全酶復(fù)合物、紡錘體極中心體；分子功能主要涉及ICAM-3受體活性、前列腺內(nèi)過(guò)氧化物合酶活性、組蛋白激酶活性、組蛋白絲氨酸激酶活性、細(xì)胞周期依賴(lài)性蛋白激酶活性、受體信號(hào)蛋白酪氨酸激酶活性、NAD依賴(lài)性的組蛋白脫乙酰酶活性。KEGG通路富集分析共獲得80條通路，采用R語(yǔ)言對(duì)前15條KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理(見(jiàn)圖5及表3)，主要涉及癌癥通路、乙型肝炎、病毒致癌、EB病毒感染、前列腺癌、細(xì)胞周期、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、膀胱癌、ErbB信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、蛋白多糖在癌癥中作用、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)、黏著斑、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、PI3K-Akt信號(hào)通路(見(jiàn)圖6)，還涉及FoXo、VEGF、TNF、MAPK、HIF-1等信號(hào)通路。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示千金子二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病與癌癥、細(xì)胞凋亡、增殖、分化、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、炎癥、免疫等過(guò)程密切相關(guān)，提示千金子二萜醇酯類(lèi)成分可能通過(guò)控制多種復(fù)雜生物途徑來(lái)發(fā)揮對(duì)白血病的治療作用。

2.5千金子“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 選取 7種二萜醇酯類(lèi)成分、75個(gè)靶點(diǎn)和KEGG通路分析中排名前15的通路，構(gòu)建千金子“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖7)。該網(wǎng)絡(luò)共包括 98 個(gè)節(jié)點(diǎn)，357 條邊，節(jié)點(diǎn)的大小代表度的大小，邊表示成分-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-通路、通路-疾病之間的相互作用關(guān)系。其中1個(gè)紫色節(jié)點(diǎn)代表疾病，7 個(gè)紅色節(jié)點(diǎn)代表二萜醇酯類(lèi)成分，75 個(gè)綠色節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn)，15個(gè)藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表富集通路。該網(wǎng)絡(luò)圖表明千金子二萜醇酯類(lèi)成分在治療白血病方面起到了至關(guān)重要的作用，系統(tǒng)地闡明了二萜醇酯類(lèi)成分、靶點(diǎn)、通路之間的關(guān)系，提示千金子可能是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用來(lái)發(fā)揮治療白血病的作用。

2.6分子對(duì)接驗(yàn)證 依托 DockThor 對(duì)“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)中的二萜醇酯類(lèi)成分及PPI網(wǎng)絡(luò)中度值前3的靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合能(Affinity)<-5.0 kJ/mol代表成分與靶點(diǎn)的結(jié)合性能良好，結(jié)合能越小表示對(duì)接效果越好[17]。由表4可知，各活性成分與核心靶蛋白的Affinity值全部小于-6.0，其中-9.0～-8.0之間的有8個(gè)，-8.0～-6.0之間的有13個(gè)，表明千金子二萜醇酯成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)能較好的結(jié)合，說(shuō)明網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)結(jié)果可靠。分子對(duì)接熱圖見(jiàn)圖8。

表4 千金子二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

3 討 論

白血病是十大高發(fā)惡性腫瘤之一，系指造血干細(xì)胞由于增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等原因在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，浸潤(rùn)其他非造血組織和器官，同時(shí)抑制正常造血功能，對(duì)機(jī)體造成不可逆損傷的一種造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病[18-19]。目前只能以化療作為主要治療手段，但治療效果十分有限，會(huì)產(chǎn)生極大的不良反應(yīng)[20]，因此，白血病的治療方法一直是眾多學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)。千金子二萜醇酯類(lèi)成分作為千金子治療白血病的主要成分，其治療白血病的作用機(jī)制亟待深入研究。

目前發(fā)現(xiàn)的千金子二萜醇酯類(lèi)成分主要為續(xù)隨子烷二萜型和巨大戟烷二萜型，其中，續(xù)隨子烷二萜型成分表現(xiàn)出致瀉、抗腫瘤、抗腫瘤多藥耐藥、抗炎、抑制破骨細(xì)胞生成、調(diào)節(jié)腸道菌群、祛斑美白等多種藥理活性，且研究主要集中千金子素L1、L2、L3、L7a、L7b、L8、L9[7]，因此本研究以這7種代表性續(xù)隨子烷二萜類(lèi)成分為研究對(duì)象，探討千金子二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病的作用機(jī)制。

基于 Cytoscape3.7.2 和STRING 構(gòu)建千金子二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，并利用MCODE插件提取分析核心子網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)CDK1、CDK2、CCNA2是網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)，表明其可能在白血病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，與已有的白血病作用機(jī)制研究報(bào)道一致[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)芬苯達(dá)唑可通過(guò)調(diào)控CDK1、cyclin B1等周期相關(guān)蛋白誘導(dǎo)K562細(xì)胞G2/M期阻滯[23]。DCZ3301可劑量和時(shí)間依賴(lài)性地抑制白血病細(xì)胞活力并誘導(dǎo)其凋亡，可能與下調(diào)CDK1，cyclin B1表達(dá)，誘導(dǎo)G2/M周期阻滯有關(guān)[24]，提示調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程已成為治療白血病的關(guān)鍵切入點(diǎn)。分子對(duì)接結(jié)果顯示千金子二萜醇酯類(lèi)成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合性能較好，驗(yàn)證了關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)在二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病中的重要性，也反映了網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)的可靠性。

KEGG通路富集分析及“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖顯示PI3K-AKT、ErbB、p53通路富集的基因數(shù)目較高，是治療白血病的關(guān)鍵通路。PI3K-AKT、ErbB、p53通路現(xiàn)已被證明在白血病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，是治療白血病的關(guān)鍵靶點(diǎn)[25-27]。其中PI3K-AKT通路參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和糖原代謝等多種細(xì)胞基本進(jìn)程的調(diào)節(jié)，可通過(guò)激活mTOR、NF-κB等下游通路來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化，在維持細(xì)胞惡性生物學(xué)特性中發(fā)揮重要作用，其異常活化與白血病病程的各個(gè)時(shí)期均密切相關(guān)[28-29]。李志慧等[30]發(fā)現(xiàn)MiRNA-145可通過(guò)抑制PI3K-AKT信號(hào)通路來(lái)抑制白血病細(xì)胞增殖，促使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。Kang等[31]證明了P13K/AKT信號(hào)通路活化可改變體外K562細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-8及NF-κB蛋白活性，促進(jìn)K562細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制其凋亡；此外，中藥及其單體成分可通過(guò)調(diào)控p53信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)來(lái)抑制K562/G01、THP-1等白血病細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡[32-33]，表明富集分析結(jié)果可靠，可為接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供依據(jù)。

綜上，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步分析了千金子二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病的藥理作用機(jī)制，揭示了千金子多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)、生物功能及通路與目前白血病分子機(jī)制研究相一致。采用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證了二萜醇酯類(lèi)成分與靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，說(shuō)明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)具有一定的可靠性，可為千金子二萜醇酯類(lèi)成分治療白血病作用機(jī)制的深入研究提供理論依據(jù)，也可為實(shí)驗(yàn)開(kāi)展及臨床合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。