基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接分析豆根管食通口服液治療食管癌的分子機(jī)制*

鄺玉慧，陳欣菊，徐方飚，陳曉琦，鄭玉玲

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

食管癌(esophageal cancer，EC)是惡性程度較高的一類腫瘤，具有易復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的特性，病死率居世界惡性腫瘤第6位[1]。食管癌分為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocacinoma，EAC)兩個(gè)類型，在中國(guó)，ESCC是最常見的類型[2]。EC早期發(fā)現(xiàn)比較困難，通常發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期。目前，治療EC以手術(shù)、放療、化療、靶向治療、熱療等多學(xué)科診療模式(multiple disciplinary team，MDT)為核心，但由于EC較易發(fā)生腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，其五年的生存期仍然低于25%[3]。中醫(yī)認(rèn)為，“痰瘀互結(jié)”是EC重要的病因病機(jī)。鄭玉玲教授同樣重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)“痰”和“瘀”在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，認(rèn)為食管癌的發(fā)病機(jī)制多以正氣虧虛為本，痰氣瘀毒為標(biāo)，尤以痰瘀為主，證屬本虛標(biāo)實(shí)[4]。研究表明，中醫(yī)藥配合放化療有增敏減毒的作用，可提高患者生活質(zhì)量，其機(jī)制可能為增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境[3，5-6]。

鄭玉玲教授在多年食管癌治療的基礎(chǔ)上，擬定以“化痰祛瘀”為治則，具有化痰理氣、活瘀散結(jié)、止痛抗癌的中藥復(fù)方——豆根管食通口服液。豆根管食通口服液由山豆根、沉香、黃藥子、急性子、制天南星、姜半夏、三七、郁金等8味中藥口服液組成。山豆根為君藥，具有散結(jié)消腫、清熱解毒、利咽的功效；制天南星溫化頑痰，黃藥子解毒散結(jié)消瘀，急性子軟堅(jiān)消瘀，姜半夏化痰散結(jié)降逆，沉香降逆行氣，郁金止痛活血，共為臣藥；三七化瘀理氣為佐使藥。上述諸藥合用，共奏解毒散結(jié)、化痰祛瘀之功，適用于痰氣交阻、瘀血內(nèi)結(jié)及痰瘀互結(jié)等證型的食管癌患者。豆根管食通口服液可降低患者血清中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)及血清腫瘤標(biāo)志物唾液酸(sialic acid，SA)的水平，明顯提高患者血清干擾素-γ(interferon-γ，INF-γ)和血清免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)、IgG、IgM的水平，提高患者免疫功能，縮小或穩(wěn)定腫瘤病灶，提高患者生活質(zhì)量，延長(zhǎng)患者生存期，改善患者預(yù)后[7-9]；抑制Eca-109細(xì)胞的增殖，促進(jìn)Eca-109細(xì)胞凋亡及食管癌模型大鼠的癌細(xì)胞凋亡[10-12]。

目前，豆根管食通口服液治療EC的作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，分析豆根管食通口服液治療EC的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 豆根管食通口服液活性成分的收集與篩選根據(jù)2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)范豆根管食通口服液中8味中藥的名稱，采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，檢索豆根管食通口服液組方中藥的化學(xué)成分，以口服生物采用度(oral bioavailability，OB)≥30%及類藥性(drug likeness，DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)所有化學(xué)成分進(jìn)行篩選，搜集活性化學(xué)成分，建立藥物活性化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)集。

1.2 豆根管食通口服液組成藥物活性成分相關(guān)靶點(diǎn)搜集采用TCMSP檢索豆根管食通口服液組方中藥活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中UniProKB(https：//www.uniprot.org/)檢索功能，輸入靶蛋白名稱，限定物種為“Homo sapiens”，剔除非人源靶點(diǎn)，將查詢得到的所有蛋白名稱轉(zhuǎn)化為基因ID，建立活性成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 EC靶點(diǎn)搜集采用人類孟德爾遺傳在線數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//omim.org/)[13]、疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)(genetic association database，GAD，https：//geneticassociationdb.nih.gov/)、人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)(the human gene database，GeneCards，https：//www.genecards.org/，v4.12.0 Build 31)[14]，限制物種為“homo sapiens”，以“esophageal cancer”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，搜集與EC相關(guān)的靶點(diǎn)，建立數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4 “藥物-疾病”交集靶點(diǎn)篩選及豆根管食通口服液治療EC有效活性成分篩選將EC靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)與活性成分相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行映射，交集靶點(diǎn)即為豆根管食通口服液治療EC的有效靶點(diǎn)，將有效靶點(diǎn)與活性分相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，刪除活性成分非交集靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的添生成分即為豆根食通口服液治療EC的有效活性成分。

1.5 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將藥物、有效活性成分及交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，并繪制“藥物-有效活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 豆根管食通治療EC的關(guān)鍵靶點(diǎn)及分析STRING數(shù)據(jù)庫(kù)可通過文獻(xiàn)等數(shù)據(jù)支撐，提供蛋白質(zhì)之間相互作用證據(jù)。MCC(maximal clique centrality)算法是一種基于密度的非交疊式聚類算法，以種子節(jié)點(diǎn)為中心進(jìn)行擴(kuò)展，在其鄰居節(jié)點(diǎn)中尋找滿足要求的節(jié)點(diǎn)[15]，能更好地預(yù)測(cè)互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵蛋白。將豆根管食通口服液治療EC的有效靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用(protein protein interaction，PPI)分析，限制物種為“homo sapiens”。將得到PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape，通過關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分析工具Cytohubba的MCC、度(degree)、中介中心度(betweeness)及鄰近中心度(closeness)4種網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅年P(guān)鍵特征參數(shù)[16]，分別計(jì)算前出30個(gè)核心靶點(diǎn)，取相同靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.7 關(guān)鍵靶點(diǎn)富集分析采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene discovery，GO)生物功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號(hào)通路富集分析，其中GO生物功能富集分析包含三大類，分別是生物學(xué)過程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)。限定物種為“homo sapiens”，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為P≤0.05，Q≤0.05，根據(jù)通路富集結(jié)果，導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析。

1.8 分子對(duì)接驗(yàn)證分子對(duì)接以受體理論為基礎(chǔ)，通過計(jì)算機(jī)虛擬模擬，評(píng)價(jià)藥物活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能力。本研究采用AutoDock軟件進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，并采用Pymol軟件去除氫原子及配體，并將對(duì)接結(jié)果可視化，以此評(píng)價(jià)豆根管食通口服液有效活性化合物與靶蛋白之間的結(jié)合活性，并根據(jù)其結(jié)合能大小篩選出豆根管食通口服液治療EC的潛在核心化合物。

2 結(jié)果

2.1 豆根管食通口服液活性成分的獲取及相關(guān)作用靶點(diǎn)的搜集通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，并以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選得到豆根管食通口服液的活性成分97種，其中山豆根21種、沉香9種、急性子9種、黃藥子15種、姜半夏13種、三七8種、制天南星7種、郁金15種。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取豆根管食通口服液有效活性成分相關(guān)靶點(diǎn)128個(gè)。見表1。

表1 豆根管食通口服液中各中藥OB值前5位的活性成分信息表

2.2 豆根管食通口服液治療EC的有效靶點(diǎn)及有效活性成分的篩選采用OMIM、GAD及GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并搜集與EC疾病相關(guān)靶點(diǎn)6 095個(gè)。將97種豆根管食通口服液活性成分的128個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)與6 095個(gè)EC疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到106個(gè)相同靶點(diǎn)，即為豆根管食通口服液治療EC的有效靶點(diǎn)。將106個(gè)豆根管食通口服液治療EC的有效靶點(diǎn)與128個(gè)活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比，刪除22個(gè)非有效靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的活性成分，即為豆根管食通口服液治療EC的有效活性成分，共59種，其中山豆根16種、沉香9種、急性子8種、黃藥子14種、姜半夏13種、三七7種、制天南星6種、郁金2種。

2.3 “藥物-有效活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將8味中藥對(duì)應(yīng)的有效活性成分及豆根管食通口服液有效活性成分治療EC的有效靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行映射，構(gòu)建“藥物-有效活性成分-靶點(diǎn)”，見圖1。

圖1 豆根管食通口服液治療EC的“藥物-有效活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果將豆根管食通口服液有效活性成分治療EC的有效靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)，并將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件，通過Cytohubba插件進(jìn)行4種算法分析，分別篩選出前30位靶點(diǎn)，并繪制4種算法Veen圖，得到21個(gè)交集靶點(diǎn)，即為關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別是MAPK3、IL-6、EGF、CAT、JUN、EGFR、PTGS2、AR、VEGFA、ESR1、IL-1β、PPARG、MAPK1、MAPK8、HSP90AA1、CYCS、MMP1、MTOR、IL-2、CCL2、HMOX1，見圖2、圖3。

圖2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 Cytohubba 4種算法篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)的Veen圖

2.5 GO生物功能富集分析和KEGG通路富集分析采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物功能和KEGG信號(hào)通路富集分析，以P≤0.05，Q≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選后得到GO生物功能條目1 476條，KEGG信號(hào)通路107條。1 476條GO生物功能包括1 314條生物學(xué)過程、59條分子功能及26條細(xì)胞組分，其中生物學(xué)過程主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等；分子功能主要涉及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)活性、生長(zhǎng)因子活性等；細(xì)胞組分主要涉及囊泡腔、膜區(qū)等。107條KEGG信號(hào)通路主要涉及白細(xì)胞介素-17(interleukin-17,IL-17)信號(hào)通路、輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17,Th17)細(xì)胞分化、缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號(hào)通路等。將差異顯著的前20條通路導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建“通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，靶點(diǎn)參與所富集的通路越多，則該靶點(diǎn)所代表的三角形形狀越大；通路所含靶點(diǎn)越多則該通路所代表的菱形形狀越大，見圖4、圖5、圖6，表2。

表2 差異顯著的前20名通路富集結(jié)果

圖4 GO生物功能富集分析氣泡圖

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖6 “通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證分析根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果及文獻(xiàn)支持，選取在“藥物-有效活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中度值最高的3種成分：即β-谷甾醇(β-sitosterol)、槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)，采用計(jì)算機(jī)模擬與通路中度值較高的兩個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)MAPK3、EGFR進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。成分結(jié)構(gòu)來(lái)源于Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)，靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)來(lái)源于PDB(protein data bank)數(shù)據(jù)庫(kù)，采用Pymol去除氫原子及配體后并將對(duì)接結(jié)果可視化，導(dǎo)入AutoDock進(jìn)行對(duì)接模擬，結(jié)合能小于-7 kcal·mol-1則認(rèn)為該結(jié)合具有較高的結(jié)合能力，結(jié)合能值越低則表示結(jié)合越穩(wěn)定。結(jié)果顯示，表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、MAPK3與3個(gè)化合物的結(jié)合能均小于-7 kcal·mol-1，說明化合物均能與EGFR、MAPK3結(jié)合。見圖7，表3。

圖7 分子對(duì)接結(jié)果

表3 分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，人是一個(gè)整體，治療疾病時(shí)要系統(tǒng)全面，從多角度、多方面出發(fā)起到緩解病癥、延緩疾病進(jìn)展的作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究是采用整合的中藥活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)與信息分析技術(shù)，從整體出發(fā)，系統(tǒng)挖掘潛在的中藥治療疾病的作用機(jī)制，與中醫(yī)的整體觀念相契合。本課題組采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，系統(tǒng)而全面地挖掘豆根管食通口服液治療EC的潛在作用機(jī)制。

本研究篩選出豆根管食通口服液治療EC的活性成分共59種，其中山豆根16種、沉香9種、急性子8種、黃藥子14種、姜半夏13種、三七7種、制天南星6種、郁金2種。從活性成分種類數(shù)目來(lái)看，符合山豆根為君藥，而制天南星、急性子、黃藥子、姜半夏、郁金及沉香共為臣藥的君臣關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，度值前3位的成分分別為槲皮素、β-谷甾醇與山柰酚，表明這3個(gè)化合物可能是豆根管食通口服液治療食管癌的關(guān)鍵成分。β-谷甾醇為半夏、沉香、天南星、急性子、黃藥子、三七和郁金等7味中藥的活性成分，是一種植物甾醇，具有降低血脂、抗癌和抗炎的作用[17-18]。Zhu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇可提高機(jī)體免疫力，并參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，從而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。槲皮素是沉香、黃藥子、急性子、三七、山豆根的活性成分，是一種具有多種生物活性的黃酮類化合物。研究顯示，槲皮素可抑制胃癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移，抑制血管生成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死和自噬[20]。誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是槲皮素發(fā)揮抗癌作用的重要方式，可激活死亡受體途徑或線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[21]。此外，槲皮素亦具有增敏和減輕放化療不良反應(yīng)的作用[22]。山柰酚是急性子、黃藥子、山豆根的活性成分，可通過線粒體途徑抑制人食管癌Eca-109細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]，在胃癌細(xì)胞中亦能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24-25]。山柰酚還可通過激活宿主免疫力，抑制腫瘤血管生長(zhǎng)并增加其他抗癌藥物的敏感性來(lái)發(fā)揮抗癌作用[26]。

本研究共篩選出豆根管食通口服液治療EC的關(guān)鍵靶點(diǎn)21個(gè)，大致分為蛋白激酶、激素及其受體、過氧化氫酶、熱激蛋白和轉(zhuǎn)錄因子等。MAPK是一種激活絲氨酸-蘇氨酸磷酸化的蛋白激酶，在細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)及凋亡中發(fā)揮重要作用。目前，已經(jīng)鑒定出的MAPK途徑有許多，其中細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)途徑中的ERK1，亦稱為MAPK3，是本研究的核心靶點(diǎn)。研究表明，抑制ERK1即MAPK3的活性，細(xì)胞增殖將受到明顯抑制[27-28]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，MAPK3與槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚均能較好地結(jié)合，提示豆根管食通口服液的有效成分可能參與調(diào)節(jié)MAPK3的表達(dá)，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

EGFR是一類屬于表皮生長(zhǎng)因子受體家族的跨膜受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTK)，可啟動(dòng)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移[29]。其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)是參與內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化和遷移的促血管生成因子之一。MAPK、ERK和PI3K-Akt信號(hào)通路是將細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)最重要的信號(hào)通路，在調(diào)控細(xì)胞增殖、血管生成和代謝等中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，裸鼠瘤體微血管密度顯著降低，VEGF表達(dá)降低，腫瘤內(nèi)血管新生的形成明顯抑制[30]。本課題組前期基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，豆根管食通口服液可抑制VEGF的表達(dá)[31]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，EGFR與槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚均能較好的結(jié)合，提示豆根管食通口服液的有效成分可能參與到EGFR的調(diào)節(jié)，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)血管新生的作用。通路富集發(fā)現(xiàn)，TNF通路有顯著差異，而本課題組前期基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)其可提高患者血清中 IL-6 與IL-10水平，提高機(jī)體免疫力[32]，其中 IL-6 本次研究的關(guān)鍵靶點(diǎn)。以此可以初步推斷本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究是成功的，具有一定的代表性。

綜上所述，豆根管食通口服液可以通過多成分、多靶點(diǎn)及多途徑的方式發(fā)揮治療EC的作用，為進(jìn)一步探討其治療EC的作用機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)，也為中藥復(fù)方抗EC的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提供了重要的科學(xué)依據(jù)。