病證結(jié)合動物模型研究進展*

胡齊帥，張曉艷

河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

病證結(jié)合動物模型是指在中醫(yī)藥理論、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論與實驗動物學(xué)知識的有機結(jié)合下，模擬出的與人類疾病表現(xiàn)和證候特征相同或相似的實驗觀察動物[1]。病證結(jié)合的理論最早見于《傷寒雜病論》[2]，當時的病證結(jié)合是中醫(yī)辨病和辨證治療的結(jié)合[3]。現(xiàn)代意義上的病證結(jié)合，是指現(xiàn)代醫(yī)學(xué)辨病與中醫(yī)辨證的結(jié)合，即先以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論明確疾病，再運用中醫(yī)學(xué)概括患者當下的證型[4]。病證結(jié)合動物模型是這一理論思想的載體，希望借助現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和中醫(yī)學(xué)的雙重優(yōu)勢，從宏觀與微觀、不同層面多維地展現(xiàn)疾病的發(fā)生發(fā)展變化規(guī)律，對于探討疾病病理生理變化與中醫(yī)證候特征之間的關(guān)系具有極大的優(yōu)勢[5-6]，而且將時間觀念引入模型，較好地體現(xiàn)出中醫(yī)證的動態(tài)性與階段性特征[7]。

1 造模思路的分類

病證結(jié)合動物模型必須反映疾病和證候的雙重特征，而病與證是兩種不同醫(yī)學(xué)體系從不同的角度對疾病的解讀，臨床上同一患者，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診斷為流行性感冒，中醫(yī)辨證為風(fēng)熱犯肺，認識不同，但患者相同，病在證中，證在病中，病與證是一體的。因此，疾病動物模型也同樣應(yīng)該具有證候特征[8-9]，可以對疾病動物模型的證候?qū)傩赃M行歸納，從而確定為某一病證結(jié)合動物模型；證候動物模型也應(yīng)該具有疾病特征，可以對證候動物模型進行疾病診斷，從而確定為某一病證結(jié)合動物模型。此外，還可采用疾病造模因素與證候造模因素相疊加的方法建立病證結(jié)合動物模型，也是目前最為常用的造模思路。

1.1 疾病動物模型辨證建模以疾病動物模型為基礎(chǔ)，觀察疾病在形成過程中證的變化過程及疾病模型形成后所屬的中醫(yī)證候[10]，然后確定為某一特定的病證結(jié)合模型。疾病動物模型根據(jù)制備過程中是否施加外在干預(yù)因素分為誘發(fā)性和自發(fā)性，由此建立的病證結(jié)合又可分為兩類。

1.1.1 誘發(fā)性疾病動物模型辨證建模誘發(fā)性疾病動物模型是通過施加外在干預(yù)因素建立的。如梁建慶等[11]對新西蘭大白兔采用體外電擊誘發(fā)室顫動物模型，電擊后發(fā)現(xiàn)模型動物呼吸微弱甚至停止(氣短息促)，心室顫動(脈微細欲絕)，四肢腫脹，舌質(zhì)淡苔白水滑，心電圖異常及組織器官含水量增加，符合心陽暴脫證的病機和證候，成功構(gòu)建心陽暴脫證心臟驟停動物模型。郎海燕等[12]對3批通過注射抗小鼠血小板血清建立的免疫性血小板減少癥(ITP)模型相關(guān)數(shù)據(jù)進行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)小鼠除有明顯的注射部位和皮膚自發(fā)性出血、外周血小板數(shù)值下降、凝血時間延長、骨髓產(chǎn)板巨核細胞減少等疾病特征外，還具有活動減少、不思飲食、大便溏稀、皮膚瘀斑、體質(zhì)量減輕等表現(xiàn)，符合脾不統(tǒng)血證的辨識標準。王勇等[13]在中華小型豬冠狀動脈前降支放置Ameroid縮窄環(huán)，制備出冠狀動脈粥樣硬化性心臟病慢性心肌缺血模型，術(shù)后從動物的一般狀態(tài)、舌色、活動度、血液流變學(xué)、心電圖、冠脈造影等方面進行證候評價，發(fā)現(xiàn)前4周表現(xiàn)為穩(wěn)定的血瘀證[14]，8～12周則表現(xiàn)為氣虛血瘀證。樊憬懿[15]先篩選出12周喂養(yǎng)能夠誘導(dǎo)大鼠形成代謝綜合征的配方飼料，參考中醫(yī)臨床脾氣虛證、痰濕壅盛證的診斷標準，在喂養(yǎng)的第4周、8周、12周分別處死8只，采集信息進行證候評分，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠4周出現(xiàn)脾氣虛證、8周出現(xiàn)痰濕輕證、12周出現(xiàn)痰濕重證，很好地體現(xiàn)出疾病發(fā)展過程中證候的動態(tài)變化。

1.1.2 自發(fā)性疾病動物模型辨證建模自發(fā)性疾病動物是指實驗動物未經(jīng)任何有意識的人工處理，在自然情況下自發(fā)產(chǎn)生疾病，基因突變導(dǎo)致疾病，經(jīng)定向培育而穩(wěn)定遺傳的實驗動物[16]，如自發(fā)性糖尿病鼠、青光眼兔等。其制備方法主要通過自然繁殖，疾病的病理生理特征比誘發(fā)性模型更為穩(wěn)定均一，而且在不同的發(fā)展階段其中醫(yī)證候特征也是穩(wěn)定均一的，對自發(fā)性疾病動物模型進行辨證更易于建立理想的病證結(jié)合動物模型[8]。如自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)是國際公認的原發(fā)性高血壓實驗研究動物模型，屈會化等[17]對早期SHR(14～18周齡)進行了宏觀表征及行為學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)基本符合高血壓辨證分型中肝火上炎證的診斷。晚期的SHR(12月齡)則符合肝腎陰虛證的表現(xiàn)[18]。但是這種動物模型成本較高、技術(shù)復(fù)雜、飼養(yǎng)周期較長，在應(yīng)用方面受到了限制[19]。

1.2 對證候動物模型進行疾病診斷[16，20]證候模型是利用動物的某些生物表征來模擬人體證候特征的一類動物模型。根據(jù)造模方法的不同分為中醫(yī)病因模型、西醫(yī)病理模型和病因病理復(fù)合模型。中醫(yī)病因模型是根據(jù)中醫(yī)理論認識建立的，如《黃帝內(nèi)經(jīng)》認為引發(fā)血瘀證的主要致病因素是寒邪和情志失調(diào)，采用夾尾激怒刺激法建立氣滯血瘀動物模型[21]，冰水浴法建立寒凝血瘀動物模型[22]。這種模型在病因上更加符合中醫(yī)邏輯思維，更容易被中醫(yī)人士認同；在證的本質(zhì)研究中，研究者發(fā)現(xiàn)某些證候與西醫(yī)病因病理具有一定的關(guān)聯(lián)，可以通過施加化學(xué)、物理、手術(shù)等因素模擬人類證候表現(xiàn)，這類證候模型稱為西醫(yī)病理模型。如甲狀腺激素亢進所表現(xiàn)出的煩躁、消瘦、怕熱、出汗等癥狀與陰虛表現(xiàn)相近，利用甲狀腺素片造成實驗動物甲狀腺機能亢進模擬陰虛證候[23]。這種造模方法操作簡單、可控性好、易于重復(fù)[24]，但在病因上存在與中醫(yī)理論脫節(jié)的問題。上述兩種造模方法相復(fù)合所建立的證候模型稱為病因病理復(fù)合模型，如夾尾結(jié)合腎上腺素注射是較為理想的肝郁證造模方法[21]。

以證候動物模型為基礎(chǔ)，對模型進行西醫(yī)診斷，發(fā)現(xiàn)模型身上所具有的疾病，從而確定為某一病證結(jié)合。如趙迎盼等[25]采用新生母子分離+慢性束縛+番瀉葉灌胃法模擬出肝郁脾虛證大鼠模型，大鼠內(nèi)臟敏感性增高，疼痛閾值明顯降低，出現(xiàn)腹瀉等癥狀，與腹瀉型腸易激綜合征表現(xiàn)相符，從而建立肝郁脾虛型腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型。目前，這種造模方法構(gòu)建的模型很少，一方面受西醫(yī)診斷的局限，對于某些證候模型，西醫(yī)診斷不清或者無法明確診斷；另一方面由于不同的疾病有時會出現(xiàn)相同或相似的證候[26]，某些證候模型可能會診斷出多種疾病或者系統(tǒng)綜合征，難以保證模型疾病的單一性和均一性。如氣虛血瘀證是心腦血管疾病、消化系統(tǒng)疾病[27]、慢性腎病等疾病的常見證型，一證多病，涉及多個系統(tǒng)，對應(yīng)多種疾病[28]。

1.3 疾病造模因素與證候造模因素相疊加將疾病造模因素與證候造模因素先后或同時施加于同一模型動物，從而建立病證結(jié)合動物模型。如陳劍磨等[29]先手術(shù)切除小鼠雙側(cè)卵巢模擬骨質(zhì)疏松癥，再注射氫化可的松1周模擬腎陽虛證，從而建立骨質(zhì)疏松癥腎陽虛小鼠模型。劉燕等[30]予大鼠腹腔注射抗原液致敏激發(fā)復(fù)制哮喘，根據(jù)“形寒飲冷則傷肺”的理論，給予0 ℃冰水混合物施以“飲冷”刺激，置于0 ℃恒溫冰箱中進行冷凍施以“形寒”刺激，再進行水中力竭游泳使其勞累，從而建立哮喘病寒飲蘊肺證大鼠模型。李榮榮等[31]給予小鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇稀釋液模擬腎陽虛證，然后滴鼻接種甲型流感病毒FM1從而建立腎陽虛小鼠外感模型。兩種造模因素相復(fù)合能擴大病證結(jié)合的研究范圍，滿足以病統(tǒng)證下不同證型的研究。如在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型上分別施加風(fēng)寒濕刺激、風(fēng)濕熱刺激、高脂喂養(yǎng)等，可以分別建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎多個不同證型的病證結(jié)合動物模型[32]。

1.4 討論由疾病模型建立的病證結(jié)合，證候是對模型進行觀察總結(jié)出的，病與證存在天然的內(nèi)在聯(lián)系，而且疾病模型的建立大多采用單一因素造模法，模型的可靠性和穩(wěn)定性較好，但是證候的可控性差，不一定能夠得到實驗研究所需要的證型。由證候模型建立的病證結(jié)合，疾病是對證候模型進行診斷發(fā)現(xiàn)的，病與證也存在天然的內(nèi)在聯(lián)系，但是疾病的建立也存在可控性差的問題。疾病造模因素與證候造模因素相疊加的造模方法，能夠充分考慮到疾病形成的中西醫(yī)病因，造模因素更加全面。而且能夠分別或同時模擬實驗研究所需要的疾病和證候，相比單一因素造模法，模型的成功率更高。但是兩種造模因素相疊加的造模過程中，施加的外在干預(yù)因素較多，可能會割裂病與證的內(nèi)在聯(lián)系[9，33]。有學(xué)者認為這種造模方法建立的病證結(jié)合，在方藥反證的評價過程中，疾病相關(guān)的指標變化尤為重要，中醫(yī)重在辨證論治，同病異治和異病同治都在說明中醫(yī)治療通過改變證候從而扭轉(zhuǎn)疾病的發(fā)展方向，如果使用與證相對應(yīng)的方劑進行治療，疾病指標能夠大幅度改善，就能夠證明證與病存在關(guān)聯(lián)性[9]。其次，這種造模方法不能是簡單的“1+1”模式，如在流感病毒感染模型的基礎(chǔ)上疊加情志刺激，模型雖有肝郁證的表現(xiàn)，但可能只是模型的兼證，不足以概括模型的證候?qū)傩?。?yīng)該通過臨床調(diào)查研究，選擇關(guān)聯(lián)性較強的疾病和證候來建立病證結(jié)合，如風(fēng)熱證是流感最為多見的證型[34]，流感病毒也多被認為屬于風(fēng)熱疫毒[35]，因而風(fēng)熱環(huán)境刺激+流感病毒感染更易于成功構(gòu)建流感風(fēng)熱證動物模型。

表1 各種造模思路的優(yōu)勢與不足

2 模型的評價

模型的評價分為兩部分，疾病的診斷依據(jù)實驗室指標，比較客觀成熟，證候評價還處于發(fā)展階段，目前主要從以下四個方面進行評價。

2.1 造模因素評價源自中醫(yī)的審因論治，通過分析感邪的性質(zhì)和途徑來推斷證候?qū)傩?。如大黃苦寒瀉下，灌服大黃煎劑所誘導(dǎo)的模型證候?qū)傩詾槠⑽柑摵C，但也有可能是脾腎陽虛證。中醫(yī)病因致病具有多重性和非特異性，一種證候可由多種不同病因引起，同樣的致病因素亦可能出現(xiàn)不同的證候，而且多因素造模所建立的模型，造模因素之間又相互影響，使用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段建立的模型在病因上也很難用中醫(yī)理論對其解釋，這些問題極大地增加了造模因素評價的難度和不可靠性，因此在實際應(yīng)用中大多作為參考。

2.2 四診信息評價中醫(yī)辨證是對四診信息的采集與歸納，以四診信息為著眼點建立和評價模型證候，較接近臨床實際[36]。但在實驗研究中，人為觀察和描述主觀性太強，沒有客觀證據(jù)，容易受到質(zhì)疑。為了實現(xiàn)四診信息的客觀化采集和定量分析，很多學(xué)者都在努力探討新的技術(shù)和方法。如用舌面圖像飽和度(R，G，B)值分析舌面色澤變化[37]。借助動物行為學(xué)實驗如曠場實驗、明暗箱實驗、糖水偏好實驗等評價模型動物的運動功能、精神狀態(tài)[38-39]。采用證候評價量表的方法對四診信息進行量化分析[40]。杜正彩等利用發(fā)光二極管環(huán)形冷光源、數(shù)碼攝像與計算機圖像處理等現(xiàn)代科技成果，成功開發(fā)了中醫(yī)實驗動物證候表征采集分析系統(tǒng)，可實現(xiàn)對實驗動物整體毛色、舌色、眼睛、耳廓、足爪、尾巴等與望診相關(guān)的動物表征指標的在線采集分析[41]。趙慧輝等[42]提出采用臨床證候診斷標準的等效對應(yīng)進行動物模型證候?qū)傩缘呐卸?。如用游泳力竭時間縮短反映大鼠神疲乏力，呼吸頻率加快反映大鼠喘促，心電圖描記到心律失?？梢圆糠址从承募禄蚪Y(jié)、代等脈象。目前，四診信息的客觀化仍處于探索階段，一些關(guān)鍵性的主觀特征尚未找到可匹配采集的指標，舌苔和脈象還難以實現(xiàn)客觀、定量地采集[43]。

2.3 生化指標評價將與證候相關(guān)的生化指標納入證候診斷指標，如脾虛胃腸道消化吸收功能減退，D-木糖排泄率作為反映腸道功能的指標，可用來反映脾虛的程度[44]。證是基于中醫(yī)思維而提出的，是對一組具有內(nèi)在聯(lián)系的癥狀群的概括，往往涉及多個器官、系統(tǒng)的功能紊亂或損傷，基于中醫(yī)證候的復(fù)雜性，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)從多個角度、多個學(xué)科對其展開研究，如腎陽虛相關(guān)研究指標涉及下丘腦-垂體-靶腺軸、免疫系統(tǒng)、腎功能、能量代謝、自由基代謝等[45]，但是這些指標大多只反映證的某一方面，如性腺軸指標主要反映腎陽虛生殖功能變化[46]，免疫學(xué)指標主要反映腎陽虛抗邪能力的變化。在病證結(jié)合模型的評價中，應(yīng)該根據(jù)具體疾病優(yōu)先選擇相關(guān)評價指標，如腎陽虛外感病模型，其指標評價重點要放到免疫學(xué)方面。中醫(yī)藥理論始終強調(diào)整體觀，單一指標并不能很好的體現(xiàn)證候的整體性和動態(tài)性，不同的生化指標組合變化模式也許能更好地體現(xiàn)證候的屬性特點[47]。

2.4 方藥反證方藥反證是基于方證相應(yīng)的理論推測模型的證候?qū)傩浴Ｈ缬靡鏆庾剃幍拇矸絼S芪湯治療輻射損傷大鼠，大鼠臨床癥狀及客觀指標明顯改善，由此反推輻射損傷大鼠模型屬氣陰兩虛證[48]。但是目前大多只選出一組方藥對動物所屬證型作結(jié)論性判斷，缺乏陰性對照和陽性對照，難以保證這組方藥在認定模型證候?qū)傩苑矫婢哂信潘曰蛱禺愋訹49]。而且方藥又具有多靶點、多效應(yīng)的特點，模型的證候判定不能只依賴藥物反證這一種方法，還需綜合動物表征、相關(guān)指標進行評價。

3 總結(jié)

病證結(jié)合動物模型的構(gòu)建要盡可能地與臨床相同或相近，相關(guān)的研究結(jié)果才具有臨床價值。任何疾病的形成都不是單一因素作用的結(jié)果，采用疾病造模因素與證候造模因素相疊加的造模方法，能兼顧到疾病形成的中西醫(yī)病因，考慮到環(huán)境、情志、飲食、勞倦、體質(zhì)等因素對疾病形成的影響[50]，造模因素更加全面，也使模型更加貼近臨床實際，而且模型成功率較高，容易得到實驗研究所需要的疾病和證候，要通過臨床調(diào)查研究，選擇關(guān)聯(lián)性較強的疾病和證候建立病證結(jié)合，同時也要注意動物的體質(zhì)因素及疾病所處的階段都會對證候的形成造成影響[51]。證候的評價體系需要不斷地完善，證的本質(zhì)研究尚未取得突破，模型的評價依然要以動物的表征為主，努力探索四診信息客觀化采集與評價的技術(shù)方法，以保證模型的穩(wěn)定性和可靠性，再進一步探討證候的生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。技術(shù)的進步帶動行業(yè)的發(fā)展，證候的研究要結(jié)合最新的科學(xué)技術(shù)，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的理論和方法，綜合多學(xué)科知識，在基因組、蛋白質(zhì)組和代謝組等各個層面開展研究，才能不斷地推進中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展。