加成型硅橡膠口腔印模材料抑菌劑及其劑量篩選

郜琪臻，郎 朗，陳永鳳

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 沈陽 110001;2.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016)

口腔印模是指口腔內(nèi)部組織的印模，口腔印模材料[1]在口腔修復(fù)中起著重要作用。而口腔內(nèi)部是一個(gè)高度含菌的環(huán)境，在口腔診療操作過程中印模材料可能被患者的唾液或血液中的病原體污染，進(jìn)而在醫(yī)護(hù)人員間傳播。因此，對口腔印模材料的抑菌操作十分關(guān)鍵。目前，國內(nèi)外還沒有一套完善的被口腔界公認(rèn)的口腔印模材料的滅菌消毒方案。傳統(tǒng)的浸泡消毒法使用戊二醛或含氯試劑對口腔印模材料進(jìn)行浸泡以起到抑菌效果[2]，但浸泡消毒會(huì)造成口腔印模材料變形，破壞表面細(xì)節(jié)，消毒劑的揮發(fā)還可能對人體造成潛在的危害，且操作比較繁瑣。因此，需要篩選能夠加入口腔印模材料且不影響其性能的抑菌劑及其劑量[3-4]。鑒于此，作者通過評(píng)價(jià)加入不同種類及劑量的抑菌劑后加成型硅橡膠口腔印模材料的抑菌效果，篩選加成型硅橡膠口腔印模材料的最適抑菌劑及其劑量。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

加成型硅橡膠口腔印模材料，沈陽藥科大學(xué)藥物制劑教研室。

醋酸氯己定、苯扎溴銨、百里香酚、肉桂醛、桉葉油，天津福晨化學(xué)試劑廠。

LDZX-30KBS型高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；BHC-1300型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DNP-9082BS-Ⅲ型恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；厭氧培養(yǎng)裝置，青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 抑菌劑的篩選

1.2.1 細(xì)菌平板的制備

供試菌株：牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)W83、消化鏈球菌(P.anaerobic)BNCC23710、金黃色葡萄球菌(S.aureus)BNCC186335、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、大腸桿菌(E.coli)BNCC133264，沈陽藥科大學(xué)藥物制劑教研室。

供試菌株經(jīng)鑒定為純培養(yǎng)菌株后，用PBS緩沖液制成菌懸液，使用比濁管將細(xì)菌濃度調(diào)整為1×108CFU·mL-1。用無菌棒取菌懸液分別均勻涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及牙齦卟啉單胞菌培養(yǎng)基表面，置于37 ℃、濕度100%培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 抑菌效果的評(píng)價(jià)

分別將醋酸氯己定、苯扎溴銨、百里香酚、肉桂醛、桉葉油以1%的劑量與加成型硅橡膠口腔印模材料混勻，放入模具中固化，用打孔器制成直徑10 mm、厚2 mm的圓形樣片；以未加入抑菌劑的樣片為空白對照。將圓形樣片分別放入已均勻生長的牙齦卟啉單胞菌、消化鏈球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌平板中，培養(yǎng)48 h后測量抑菌圈直徑。平行測量5次，取平均值，比較5種抑菌劑的抑菌效果。

1.3 抑菌劑劑量的篩選

1.3.1 抑菌圈直徑的測量

按1.2.1方法制備細(xì)菌平板，將百里香酚分別以1%、2%、3%、4%、5%的劑量與加成型硅橡膠口腔印模材料混勻，放入模具中固化，用打孔器制成直徑10 mm、厚2 mm的圓形樣片；以未加入百里香酚的樣片為空白對照。將圓形樣片分別放入已均勻生長的牙齦卟啉單胞菌、消化鏈球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌平板中，以2%戊二醛浸泡后的樣片為陽性對照，每組做3個(gè)平行；將細(xì)菌平板置于37 ℃、濕度100%培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h或24 h后測量抑菌圈直徑。平行測量5次，取平均值。采用統(tǒng)計(jì)軟件Origin 8進(jìn)行單因素方差分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

1.3.2 抑菌率的測定

1.3.2.1 加成型硅橡膠口腔印模材料樣片的制備

將百里香酚分別以1%、2%、3%、4%、5%的劑量與加成型硅橡膠口腔印模材料混勻，放入模具中固化，用模具制成邊長(50±2) mm、厚2 mm的正方形樣片；以未加入百里香酚的樣片為空白對照，以2%戊二醛浸泡后的樣片為陽性對照。

1.3.2.2 接種液的制備

用無菌接種環(huán)將一環(huán)預(yù)培養(yǎng)好的細(xì)菌轉(zhuǎn)移至少量1/500營養(yǎng)肉湯中，將細(xì)菌分散均勻，并采用比濁卡和標(biāo)準(zhǔn)比濁管(6.0×105CFU·mL-1)使細(xì)菌濃度保持在2.5×105～10×105CFU·mL-1之間，作為接種液。

1.3.2.3 接種

將含不同劑量百里香酚的正方形樣片分別置于無菌培養(yǎng)皿中，用移液槍吸取0.2 mL接種液，滴到每個(gè)樣片表面，用40 mm×40 mm覆蓋膜蓋于接種液上，并向下輕輕按壓使接種液向四周擴(kuò)散，確保接種液不從覆蓋膜邊緣溢出，再蓋上培養(yǎng)皿蓋，如圖1所示。

1.覆蓋膜 2.接種液 3.樣片 4.培養(yǎng)皿 5.培養(yǎng)皿蓋

1.3.2.4 細(xì)菌回收

未加入百里香酚的樣片，在培養(yǎng)皿中加入10 mL SCDLP培養(yǎng)液，對樣片進(jìn)行充分沖洗以回收細(xì)菌。加入百里香酚的樣片，置于37 ℃、濕度100%培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，重復(fù)上述操作以回收細(xì)菌。

1.3.2.5 抑菌率的計(jì)算

采用平板培養(yǎng)法測定活菌數(shù)。用PBS緩沖液對SCDLP回收液進(jìn)行10倍梯度稀釋，取SCDLP回收液及其10倍稀釋液各1 mL，分別置于無菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中注入15 mL平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)瓊脂，輕輕攪拌以分散細(xì)菌，倒置于37 ℃、濕度100%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，分別按式(1)、(2)計(jì)算活菌數(shù)(以1 cm2計(jì))與抑菌率：

(1)

(2)

式中：C為2個(gè)培養(yǎng)皿的平均菌落數(shù)；n為稀釋倍數(shù)；V為SCDLP回收液體積，mL；A為膜表面積，mm2。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑菌劑的選擇

加入醋酸氯己定、苯扎溴銨、百里香酚、肉桂醛、桉葉油等5種抑菌劑后，僅百里香酚組在細(xì)菌平板上出現(xiàn)抑菌圈。百里香酚對牙齦卟啉單胞菌、消化鏈球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為12.35 mm、13.64 mm、16.24 mm、26.24 mm、24.36 mm。表明，百里香酚具有較強(qiáng)的抑菌作用，故選擇百里香酚作為抑菌劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 抑菌劑用量的選擇

2.2.1 對常見口腔細(xì)菌的抑菌圈直徑

厭氧型細(xì)菌牙齦卟啉單胞菌、消化鏈球菌在37 ℃、濕度100%條件下培養(yǎng)48 h后，需氧型細(xì)菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌在37 ℃、濕度100%條件下培養(yǎng)24 h后，測定抑菌圈直徑，結(jié)果見表1。

對表1數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素分析，得到牙齦卟啉單胞菌F=25.13863，P=0.00076；消化鏈球菌F=12.07753，P=0.000034；金黃色葡萄球菌F=3.46176，P=0.05；枯草芽孢桿菌F=1.87797，P=0.19；大腸桿菌F=4.42192，P=0.025。除枯草芽孢桿菌外，其余細(xì)菌的P≤0.05，表明結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 供試樣片對常見口腔細(xì)菌的抑菌圈直徑/mm

2.2.2 對常見口腔細(xì)菌的抑菌率

厭氧型細(xì)菌牙齦卟啉單胞菌、消化鏈球菌在37 ℃、濕度100%條件下培養(yǎng)48 h后，需氧型細(xì)菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌在37 ℃、濕度100%條件下培養(yǎng)24 h后，測定抑菌率，結(jié)果見表2。

表2 供試樣片對常見口腔細(xì)菌的抑菌率/%

由表2可知，加入百里香酚的加成型硅橡膠口腔印模材料樣片對常見口腔細(xì)菌均有不同程度的抑制作用，其中對牙齦卟啉單胞菌的抑制作用最強(qiáng)，百里香酚劑量為5%時(shí)即可達(dá)到抑菌要求。

2.3 討論

抑菌劑篩選中，僅百里香酚組出現(xiàn)抑菌圈，推測醋酸氯己定、苯扎溴銨未產(chǎn)生抑菌圈的原因是：(1)醋酸氯己定和苯扎溴銨中含有N元素，N元素通常以氨的形式存在，氨會(huì)與催化劑表面的酸性中心發(fā)生反應(yīng)，減少了催化劑表面酸性中心的數(shù)量，使催化劑的金屬功能與催化功能失調(diào)，進(jìn)而減弱催化劑與抑菌劑的性能，且Pt的p電子軌道為空軌道，N為富電子原子會(huì)與之結(jié)合，引起Pt催化劑中毒；(2)由于輔料白炭黑的表面有硅醇基(Si-OH)，一定程度上可以與醋酸氯己定、苯扎溴銨中的胺基發(fā)生反應(yīng)(酸堿中和且N的孤對電子與H+結(jié)合)。肉桂醛與桉葉油被包裹在加成型硅橡膠口腔印模材料的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中不能釋放，且二者皆為揮發(fā)油，在印模材料表面不能留存。

百里香酚具有殺菌作用強(qiáng)、毒性低的特點(diǎn)，對口腔、咽喉黏膜有殺菌作用，對齲齒腔有防腐、局麻作用，用于口腔、咽喉的消毒殺菌以及皮膚癬菌病、放射菌病的治療等。百里香酚的抑菌原理為：可以改變細(xì)菌細(xì)胞膜脂肪酸的組成及含量；可以改變細(xì)菌細(xì)胞膜形態(tài)；能與細(xì)菌質(zhì)粒DNA相互作用，從而使細(xì)菌細(xì)胞膜通透性改變、完整性破壞，不能進(jìn)行正常的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)菌的傳代與生長[5-6]。因此，可將百里香酚加入到加成型硅橡膠口腔印模材料中，以達(dá)到在與口腔組織接觸的情況下抑制細(xì)菌增殖的作用。

3 結(jié)論

通過評(píng)價(jià)加入不同種類及劑量的抑菌劑后加成型硅橡膠口腔印模材料的抑菌效果，篩選加成型硅橡膠口腔印模材料的最適抑菌劑及其劑量。結(jié)果表明，加入不同種類抑菌劑的加成型硅橡膠口腔印模材料樣片放入細(xì)菌平板中培養(yǎng)48 h后，僅百里香酚組出現(xiàn)抑菌圈；加入1%～5%百里香酚的加成型硅橡膠口腔印模材料樣片培養(yǎng)后的抑菌圈直徑和抑菌率整體均隨百里香酚濃度的增加而增大，且對牙齦卟啉單胞菌的抑制作用最強(qiáng)。故，選擇5%百里香酚作為加成型硅橡膠口腔印模材料的抑菌劑。