載姜黃素納米金微球的制備及緩釋性能研究*

馮建海, 徐雪梅, 黎 姿, 覃乙棉, 羅雪玲, 李勝英

納米粒子作為一種新型藥物載體, 具有載體材料易制備、多樣、 載藥量高、 可緩控釋、 能靶向給藥、 生物利用度高等特點, 已受到科研工作者的廣泛關(guān)注, 且具有廣闊的發(fā)展前景[1-2], 如金納米顆粒(Au NPs)、 銀納米顆粒(Ag NPs)、 C60等。 在上述納米材料中, Au 納米顆粒是一種理想的適用于生物學(xué)研究的選擇對象。 金納米粒子擁有高化學(xué)穩(wěn)定性, 易于合成, 粒徑分布窄且精確可控, 具有可調(diào)控的光熱性質(zhì)及良好的生物相容性, 表面易修飾, 表面經(jīng)過功能化的Au 納米顆粒在細(xì)胞誘導(dǎo)、 藥物載體、 臨床診斷及抗體標(biāo)記等方面尤為有效[3-5]。 如Chen 等[6]利用硫醇化的聚乙二醇和聚丙烯酸對金納米棒進(jìn)行修飾, 負(fù)載阿霉素, 可獲得一種具有較好藥物傳輸?shù)募{米材料, 而Li 等[7]用巰基琥珀酸(MSA)和巰基丙酸(MPA)對納米多孔金納米粒子表面進(jìn)行合理的改性, 發(fā)現(xiàn)MSA 修飾的NP-AuNPs 有效地控制了阿霉素的釋放, 這些研究表明改性納米Au 做為藥物載體有減緩藥物的釋放作用。

姜黃素(Curcumin, Cur)是姜科植物姜黃的主要活性成分之一, 據(jù)前人研究表明姜黃素具有良好的治療作用, 包括抗腫瘤、 抗菌、 抗氧化、 抗艾滋病病毒和抗炎作用[8-10]。 對于抗癌方面, 在臨床上已有用于乳腺癌, 胰腺癌、 結(jié)腸癌等的治療[11-12]。 然而, 姜黃素在水中溶解性差、 穩(wěn)定性差、 難吸收、 易被機體代謝, 系統(tǒng)快速清除等缺點, 嚴(yán)重阻礙其臨床應(yīng)用[13-15]。納米材料負(fù)載藥物構(gòu)建納米遞藥系統(tǒng)具有較好的生物相容性和靶向性, 有助于藥物的緩慢釋放從而提高藥物的安全性和治療效果, 而成為近年引人矚目的新技術(shù)和研究熱點。

本研究采用晶種生長法制備Au 納米微球, 經(jīng)硅烷偶聯(lián)劑表面修飾并進(jìn)一步裝載姜黃素, 探討Au 納米微球負(fù)載Cur 的載藥及緩釋性能, 以期改善姜黃素進(jìn)入體內(nèi)的緩釋過程, 提高藥物的生物利用度, 為癌癥的積極診治提供思路。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

氯金酸(HAuCl4, 分析純), 上海賢鼎生物科技有限公司;姜黃素(分析純), 阿達(dá)瑪斯試劑有限公司; 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB, 分析純), 阿達(dá)瑪斯試劑有限公司; 硼氫化鉀(CP, 分析純), 國藥集團化學(xué)試劑有限公司; 抗壞血酸(分析純), 西隴科學(xué)股份有限公司; 無水乙醇(分析純), 西隴科學(xué)股份有限公司; N-氫乙基-r-氨丙基甲氧基硅烷(硅烷偶聯(lián)劑KH-792, 分析純), 上海麥克林生化科技有限公司; 硅酸四乙酯(TEOS, 分析純), 上海麥克林生化科技有限公司。

Phenom G5 pure 臺式掃描電鏡, 復(fù)納科學(xué)儀器(上海)有限公司; NICOLET 6700 傅里葉變換紅外光譜儀, 美國賽默飛世爾; Agilent 8453 紫外可見分光光度計, 安捷倫科技有限公司;MINIFLEX 60 X 射線衍射儀, 深圳市萊雷科技發(fā)展有限公司;DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器, 上海力辰邦西儀器科技有限公司; TGL·18C 高速臺式離心機, 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 Au 種的合成

在圓底燒瓶中加入10 mL 0.10 mol/L 的CTAB 溶液和0.25 mL 0.01 mol/L 的HAuCl4溶液, 磁力攪拌均勻后緩慢加入冰水配制的0.60 mL 0.01 mol/L 的KBH4溶液, 快速攪拌2 min, 溶液于30 ℃放置2 h 后, 即得Au 種溶液。

1.2.2 Au 納米微球的合成

取1.2.1 中所制得的Au 種溶液250 μL, 加入到50 mL 0.10 mol/L 的CTAB 和5 mL 0.01 mol/L 的HAuCl4混合溶液中,在35 ℃水浴快速攪拌下, 加入3 mL 1mol/L 的抗壞血酸溶液,并維持恒溫快速攪拌6 h, 經(jīng)10000 r/min 離心10 min, 棄去上清液, 沉淀用超純水離心洗滌數(shù)次, 沉淀置于60 ℃下干燥,即得Au 納米微球。

1.2.3 硅烷化Au 納米微球

取1.2.2 中所制得的Au 納米微球超聲分散于5 mL 超純水中, 加入10 mL 體積比為7∶3 的乙醇水溶液, 在35 ℃水浴快速攪拌下, 加入0.02 mL TEOS, 反應(yīng)2 h 后, 加入0.02 mL N-氫乙基-r-氨丙基甲氧基硅烷, 維持恒溫快速攪拌4 h, 反應(yīng)完成后, 經(jīng)10000 r/min 離心10 min, 棄去上清液, 沉淀用超純水離心洗滌數(shù)次, 沉淀置于60 ℃下干燥, 即得硅烷化Au 納米微球。

1.2.4 Cur-Au 納米微球的制備

取硅烷化的Au 納米微球20 mg 置于250 mL 錐形瓶中, 加入10 mL 1 mg/mL 的姜黃素乙醇溶液, 放于恒溫?fù)u床中, 25 ℃恒溫避光搖晃反應(yīng)48 h 后, 10000 r/min 離心15 min, 保留上清液, 沉淀經(jīng)無水乙醇洗滌數(shù)次后避光干燥, 即得Cur-Au 納米微球。 稱重, 記為W1。 以未經(jīng)硅烷化修飾的Au 納米微球作為對照組, 平行試驗3 次。

1.3 測試與表征

(1)將未經(jīng)過離心的納米Au 溶液用超純水稀釋一定的倍數(shù)后, 以未加含Au 元素的反應(yīng)溶液為空白液, 在紫外-可見光吸收光譜儀波長300 ～1100 nm 進(jìn)行全波長掃描, 記錄其紫外圖譜。

(2)掃描電鏡觀察Au 和Cur-Au 的表面形貌。

(3)采用X 射線衍射儀, 選擇10° ～90°進(jìn)行掃描, 得到Au和Cur-Au 的相應(yīng)圖譜, 對相關(guān)材料進(jìn)行成分分析。

(4)Au 和Cur-Au 的FTIR 分析: 采用溴化鉀壓片, 掃描范圍4000 ～400 cm-1, 比較相關(guān)材料結(jié)構(gòu)變化。

(5)采用差熱分析儀測定Au 和Cur-Au 的失重情況, 測定的溫度范圍為20 ～800 ℃, 升溫速率為10 ℃/min。

1.4 包封率和載藥量、 緩釋實驗測定

1.4.1 姜黃素乙醇溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

配制濃度分別為1、 2、 3、 4、 5、 6 mg/L 的姜黃素乙醇標(biāo)準(zhǔn)液, 用紫外分光光度計測定各濃度樣品在427 nm 檢測波長下的吸光度。 吸光度(A)為縱坐標(biāo), 以濃度(C, mg/L)為橫坐標(biāo), 繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 包封率和載藥量的測定

精密吸取適量1.2.4 中經(jīng)反應(yīng)離心后所得上清液, 稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測定其吸光度, 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出相應(yīng)濃度, 進(jìn)而推算姜黃素乙醇溶液中未被納米粒子吸附的Cur 含量, 記為W2, 10 mL 1 mg/mL 的姜黃素乙醇溶液所含姜黃素質(zhì)量為W3;根據(jù)下列公式分別計算包封率和載藥量。

1.4.3 Cur-Au 納米微球體外釋藥

取Cur-Au 納米微球20 mg, 用無水乙醇適當(dāng)稀釋后, 置于預(yù)處理好的透析袋中; 另取與Cur-Au 中等質(zhì)量的純姜黃素,同樣方式處理后, 分別放置于25 mL pH 6.86 的磷酸鹽緩沖液中, 37 ℃下恒溫?fù)u床振蕩。 分別于0.5、 1、 2、 4、 6 h 測定透析液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料形貌結(jié)構(gòu)的分析

2.1.1 Au 納米微球的UV-Vis 光譜圖分析

圖1 表示Au 納米微球溶液的紫外-可見光吸收光譜圖, 從圖1 可知, 在波長為545 nm 處有明顯的強吸收峰, 與參考文獻(xiàn)中所制備的Au 納米微球特征吸收波長一致[16-17], 證實Au 納米微球的存在。

圖1 Au 納米顆粒溶液的紫外可見光譜圖Fig.1 UV-Vis spectra of Au nanoparticles' solution

2.1.2 Au 和Cur-Au 的SEM 分析

圖2 為Au 和Cur-Au 納米微球材料的SEM 圖, 從圖2 可看出, Au 顆粒主要為球形, 粒徑大小較均一, 而負(fù)載姜黃素后的Au 納米微球粒徑有變大趨勢, 可能為姜黃素的黏連作用導(dǎo)致。

圖2 Au 和Cur-Au 材料的SEM 圖Fig.2 SEM diagram of Au and Cur-Au materials

2.1.3 Au 和Cur-Au 納米微球的XRD 圖分析圖3 為Au 和Cur-Au 材料的X 射線衍射圖, 由圖3 可知,Au 在2θ 為37.88°、 44.1°、 64.42°、 77.34°, 81.68°出現(xiàn)尖銳的衍射峰, 其中2θ 在37.88°處為最強峰。 通過與Au 的標(biāo)準(zhǔn)XRD 衍射數(shù)據(jù)對比, 證實采用晶種生長法制備得到了粒徑分布比較窄的Au 納米顆粒, 無其他雜質(zhì)峰, 說明制備的Au 具有較高的純度和結(jié)晶度。 而載姜黃素Au 納米顆粒的XRD 譜圖出峰與Au 納米顆粒的XRD 譜圖一致, 說明姜黃素并沒有改變Au基底物質(zhì)結(jié)構(gòu)。

圖3 Au 和Cur-Au 材料的XRD 圖Fig.3 XRD of Au and Cur-Au materials

2.1.4 Au、 Cur 和Cur-Au 的FTIR 分析圖4 為Cur、 Au、 Cur-Au 材料的紅外光譜圖分析圖。 由圖4可知, 三種材料的紅外譜圖除在2300 cm-1處出峰不一致外,其余出峰基本一致, 但Cur-Au 的紅外譜圖出峰強度增大, 特別是在1460 cm-1處明顯增強。 其中2300 cm-1處的出峰可能是由于硅烷偶聯(lián)劑修飾所引起的, 1460 cm-1處的出峰強度增強是由于姜黃素的引入引起的。

圖4 Au、 Cur 和Cur-Au 材料的紅外吸收光譜圖Fig.4 Infrared absorption spectra of Au, Cur and Cur-Au's materials

2.1.5 Au 及Cur-Au 材料的熱重圖分析

圖5 為Au 和Cur-Au 材料的熱重圖, 由圖5 可知, Au 材料在經(jīng)過高溫灼燒后, 失重百分比由100%到93.73%, 熱重?fù)p失6.27%。 而Cur-Au 材料經(jīng)過相同處理后, 失重百分比由100%到88.72%, 熱重?fù)p失11.28%, 考慮到由于負(fù)載姜黃素的熱損失影響, 對比簡單推算, 計算該載姜黃素Au 納米微球的載藥量為5.01%。

圖5 Au 和Cur-Au 材料的熱重圖Fig.5 Thermogravimetric diagram of Au and Cur-Au's materials

2.2 材料載藥和緩釋的性能分析

2.2.1 姜黃素乙醇溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果與分析

圖6 為姜黃素乙醇溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖, 從圖6 可知, 其線性回歸方程為A=0.1534C+0.0208(R2= 0.9993), 姜黃素乙醇溶液的濃度在1 ～6 mg/L 之間線性關(guān)系良好。

圖6 姜黃素乙醇溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.6 Standard curve of curcumin ethanol's solution

2.2.2 Cur-Au 材料的包封率和載藥量分析

表1 為硅烷化修飾前后Au 納米微球包封率和載藥量的數(shù)據(jù)表, 由表1 可得, 硅烷化修飾后Cur-Au 納米微球包封率的平均值為9.097%, 載藥量的平均值為4.351%, 對比硅烷化修飾前的Au 納米微球, 其負(fù)載姜黃素的載藥量有明顯提高。

表1 硅烷化修飾前后Cur-Au 材料的包封率和載藥量(n=3)Table 1 Encapsulation and drug loading of Cur-Au before or after silanization (n=3)

2.2.3 材料的載藥緩釋性能分析

圖7 為Cur 和Cur-Au 納米微球的體外釋藥性能分析圖,由圖7 可知, 等質(zhì)量的Cur 在1 h 處的釋放率為16.06%, 1 h后的釋放率快速增高, 有突釋現(xiàn)象, 在6 h 內(nèi)基本完全釋放。而Cur-Au 納米微球在0.5 h 釋放率為2.35%, 6 h 僅為17.39%, 釋放率低, 釋放速度慢, 對比純姜黃素的突釋, Cur-Au 納米微球具有一定的緩釋作用。

圖7 Cur 和Cur-Au 材料的緩釋圖Fig.7 Sustained release diagram of Au and Cur-Au materials

3 結(jié) 論

實驗研究表明, 采用晶種生長法, 以HAuCl4為Au 源,CTAB 作為表面活性劑能夠制得形貌和粒徑較均勻的Au 納米微球, 經(jīng)硅烷偶聯(lián)劑表面修飾后的Au 納米微球?qū)S素具有較好的載藥性能, 包封率和載藥量分別為9.097%和4.351%, 姜黃素體外釋放結(jié)果表明, 經(jīng)修飾后的Au 納米微球作為載體具有較好的藥物緩釋作用, 可為今后進(jìn)一步的體內(nèi)外藥效試驗研究提供參考依據(jù)。