皮蛋清抗氧化肽制備工藝優(yōu)化及體外抗氧化性

陳偉玲，陳邦棟，廖惠青，覃海桑，梁文靜

（賀州學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，廣西 賀州 542899）

皮蛋是我國傳統(tǒng)名特產(chǎn)蛋制品，常使用清料法制備，即使用腌制液浸泡新鮮鴨蛋28～42 d以獲得皮蛋。皮蛋具有風(fēng)味獨(dú)特、蛋清棕褐透亮、蛋黃色層分明等優(yōu)點(diǎn)[1]。常見的腌制皮蛋方法有包埋法、浸漬法等，主要是利用氫氧化鈉作用于蛋內(nèi)蛋白質(zhì)，使其發(fā)生變性生成凝膠態(tài)[2?4]。自由基能使人體內(nèi)正常細(xì)胞受損，導(dǎo)致機(jī)體損傷而出現(xiàn)衰老、癌癥等疾病的發(fā)生。利用綠色、天然、健康的材料制備抗氧化活性物質(zhì)清除自由基是目前研究的主流，比如姜黃素[5]、茶多酚[6]、花青素[7]和抗氧化性多肽等。有研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化性多肽能夠清除部分體內(nèi)自由基，保護(hù)機(jī)體免受自由基的影響，維持細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，如猴頭菇多肽[8]、核桃多肽[9]、蠶豆多肽[10]等。對新鮮蛋制品中多肽制備及活性鑒定已有大量研究，比如：利用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶處理新鮮雞蛋清或鴨蛋清，制備具有抗氧化性的功能多肽[11?14]。然而，針對皮蛋清的綜合利用和功能活性的開發(fā)研究較少。

本文利用清料法腌制成熟的皮蛋清為原料，采用風(fēng)味蛋白酶水解技術(shù)，通過響應(yīng)面優(yōu)化以確定皮蛋清抗氧化性多肽的最佳制備工藝參數(shù)，并測定了多肽的抗氧化活性，旨在為皮蛋的功能性研究提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持，為皮蛋清的進(jìn)一步開發(fā)利用提供研究背景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鴨蛋 購于廣西賀州市平桂區(qū)農(nóng)戶；氫氧化鈉（NaOH）、鹽酸（HCl）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、鄰苯三酚、乙醇、甲醛、H2O2、水楊酸、鐵氰化鉀、硫酸西 分析純，百靈威公司；風(fēng)味蛋白酶（50000 U/g）、維生素C（VC） 美國sigma公司。

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；UV-2600紫外分光光度計(jì) 日本島津；5804R高速冷凍離心機(jī) 德國艾本德儀器公司；Alpha1-2真空冷凍干燥機(jī) 德國Martin Christ公司；KJELTEC 8200凱氏定氮儀 丹麥福斯公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 皮蛋清的制備 蛋重65～75 g鴨蛋數(shù)枚，流水清洗干凈表面臟物，自然晾干備用。按1:1.5（w/v）比例配制腌制液，比例如下，NaOH 4.5%、NaCl 3.5%、CuSO40.1%、ZnSO40.1%、紅茶末0.1%。將晾干后的鴨蛋浸入腌制液中，浸泡四周后出缸，流動(dòng)水清洗表面后用液體石蠟包裹皮蛋，后熟兩周[15]。取完整無變質(zhì)的皮蛋數(shù)枚，去掉蛋殼和蛋黃，收集蛋清備用。

1.2.2 皮蛋清抗氧化多肽的酶解工藝 將皮蛋清和蒸餾水按一定比例混合后，添加適量風(fēng)味蛋白酶，調(diào)節(jié)pH，置于恒溫水浴鍋中進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后沸水中滅酶10 min，過0.45 μm微濾膜后得到皮蛋清抗氧化肽粗提液，55 ℃下旋蒸除去多余水分，冷凍干燥后得到多肽粉并置于?18 ℃下保存[16]。

1.2.3 皮蛋清抗氧化肽制備單因素實(shí)驗(yàn) 選取酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）、酶解時(shí)間（2.5、3、3.5、4、4.5 h）、物料比（1:4、1:6、1:8、1:10、1:12 g/mL）、pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）和酶添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2 %）為單因素。固定酶解參數(shù)為：反應(yīng)溫度50 ℃，酶解時(shí)間4 h，物料比1:10 g/mL，pH6.0，酶添加量0.6%，分別改變其中一個(gè)單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定水解度和DPPH自由基清除率，得出最佳反應(yīng)參數(shù)。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以物料比（X1）、酶解時(shí)間（X2）、酶用量（X3）為考察因素，水平設(shè)置如表1，以水解度（Y1）和DPPH自由基清除率（Y2）為響應(yīng)值，得出酶解最佳工藝組合參數(shù)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels design of response surface methodology

1.2.5 水解度的測定 酶解液水解度的測定采用甲醛滴定法[17]進(jìn)行，具體如下：稱取5.00 g水解樣品于100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻。靜置備用。吸取上述稀釋液20 mL置于200 mL燒杯中，加水60 mL，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.05 mol/L）滴定至pH8.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積。向上述溶液中準(zhǔn)確加入10 mL中性甲醛溶液，混勻。再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記錄加入甲醛滴定所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積。同時(shí)制作試劑空白實(shí)驗(yàn)。水解樣品中氨基氮的含量計(jì)算公式：

式中：X試樣中氨基酸態(tài)氮的含量，g/100 g；V1測試試樣稀釋液加入甲醛后消耗標(biāo)準(zhǔn)堿液的體積，mL；V2測定空白試樣消耗標(biāo)準(zhǔn)堿液的體積，mL；V3稀釋液的體積，mL；C 氫氧化鈉的濃度，mol/L；0.014，與1 mL氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（1.0 mol/L）相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量。

取1.00 mL水解液進(jìn)行濕法消化處理，凱氏定氮儀定氮，DH的結(jié)果計(jì)算公式如下：

式中：DH為蛋白質(zhì)水解度，%；m1為測定出的-NH2含量，g/mL；m2為蛋白質(zhì)的N含量，g/mL。

1.2.6 DPPH自由基清除率 DPPH自由基清除率的測定根據(jù)文獻(xiàn)[18]進(jìn)行，具體如下：稱取適量冷凍干燥粉末溶于蒸餾水中，調(diào)整濃度為10 mg/mL，取2 mL溶解液，加入2 mL 1.32×10?5mol/L的DPPH乙醇溶液，充分混勻，置于517 nm下測定吸光度，以未加入樣品的DPPH乙醇溶液作空白。DPPH自由基清除公式計(jì)算如下：

式中，A0表示空白對照吸光度，A1表示樣品吸光度。

1.2.7 還原力的測定 還原力的測定參考OYAIZU等[19]建立的方法，具體如下：取不同含量酶解液，加入2 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH6.6）和2 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，50 ℃保溫20 min后再加入2 mL 10%的三氯乙酸溶液，混合后以3000 r/min離心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL蒸餾水以及0.4 mL 0.1%的三氯乙酸溶液，室溫反應(yīng)10 min后，測定其在700 nm處的吸光值，以VC作陽性對照。

1.2.8 O2?·清除率的測定 取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.2）4.5 mL，置于25 ℃水浴中預(yù)熱20 min，分別加入不同含量酶解液和0.4 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，加入1 mL 8 mol/L HCl終止反應(yīng)，于299 nm處測定吸光度（Ai），空白對照組以相同體積的蒸餾水代替樣液（A0），以維生素C作陽性對照，清除率計(jì)算如式[20]。

1.2.9 ·OH清除率的測定 采用Fenton反應(yīng)，利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，在該體系中加入水楊酸捕捉羥基自由基并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm處有最大吸收[21]。加入不同含量酶解液，2 mL 6 mmol/L FeSO4，2 mL 9 mmol/L水楊酸，2 mL 6 mmol/L H2O2混勻，37 ℃水浴中加熱30 min，于510 nm處測定樣品吸光度（Ai），將體系中的樣品改為加入4 mL蒸餾水，測定空白對照吸光度（A0），向體系中加入2 mL蒸餾水代替6 mmol/L H2O2時(shí)，測定樣品本底吸光度（Aj），其中每個(gè)質(zhì)量的樣品濃度做3個(gè)平行，以維生素C作陽性對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5、Design Expert 8.0軟件對本試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每組數(shù)據(jù)進(jìn)行3次，并表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酶解溫度對水解度和DPPH自由基清除率的影響 圖1反映的是溫度對水解度和DPPH自由基清除率的影響，二者均隨溫度的增加呈先上升后下降的趨勢，均在50 ℃時(shí)取得最大值。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，隨著溫度的升高，蛋白酶活性提高，蛋白質(zhì)水解度增加，而溫度的進(jìn)一步升高會(huì)使蛋白酶失活，因此在溫度大于50 ℃時(shí)，水解度和DPPH自由基清除率降低。綜合以上水解度和DPPH自由基清除率的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)蛋白酶的最適水解溫度為50 ℃，故選擇酶解溫度50 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 酶解溫度對皮蛋清水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effects of hydrolysis temperature on the DH and DPPH free radical scavenging rate

2.1.2 酶解pH對水解度和DPPH自由基清除率的影響 圖2反映酶解液pH對水解度和DPPH自由基清除率的影響，在pH6.0時(shí)水解度和DPPH自由基均取得最大值。在不同pH下的DPPH自由基清除率不同。這是因?yàn)閜H過高或過低會(huì)造成蛋白酶失活或?qū)е碌鞍酌附Y(jié)構(gòu)被破壞，造成蛋白酶酶解效率下降，水解度和DPPH自由基清除率下降。綜上所述，試驗(yàn)中蛋白酶的最適pH為6.0，故選擇pH6.0進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 酶解pH對皮蛋清水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effects of hydrolysis pH on the DH and DPPH free radical scavenging rate

2.1.3 酶解時(shí)間對水解度和DPPH自由基清除率的影響 酶解時(shí)間對水解度和DPPH自由基清除率的影響如圖3所示，隨酶解時(shí)間的延長，水解度和DPPH自由基清除率均呈先上升后下降的趨勢，在酶解4 h時(shí)水解度和DPPH自由基清除率達(dá)到最大值，但DPPH自由基清除率在4～4.5 h時(shí)下降。這可能是由于隨著酶解時(shí)間的延長，酶解程度逐漸加深，而酶解時(shí)間過長，會(huì)導(dǎo)致皮蛋清酶解過度，造成抗氧化活性肽的降解或生成低活性的氨基酸，使得DPPH自由基清除率降低[22]。綜上所述，選擇酶解時(shí)間為4 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 酶解時(shí)間對皮蛋清水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effects of hydrysis time on the DH and DPPH free radical scavenging rate

2.1.4 物料比對水解度和DPPH自由基清除率的影響 物料比對水解度和DPPH自由基清除率的影響結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著物料比的增大，DPPH自由基清除率呈先增加后降低的趨勢，與水解度均在物料比1:10 g/mL時(shí)取得最大值。這是因?yàn)殡S著物料比的增加，皮蛋清與蛋白酶接觸充分，從而酶解效率提高，而隨著物料比的進(jìn)一步增加，底物與蛋白酶被稀釋，接觸機(jī)率減少，導(dǎo)致酶解不完全[23]。綜上所述，選擇物料比為1:10 g/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 酶解物料比對皮蛋清水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effects of solid to liquid ratio on the DH and DPPH free radical scavenging rate

2.1.5 酶用量對水解度和DPPH自由基清除率的影響 酶用量對水解度和DPPH自由基清除率的影響如圖5所示。由圖5可知，酶添加量為0.6%時(shí)，水解度和DPPH自由基清除率取得最大值。當(dāng)酶添加量為0.6%時(shí)，DPPH自由基清除率顯著高于其它組別（P<0.05），酶添加量大于0.6%時(shí)，DPPH自由基清除率差異不顯著（P>0.05）；酶添加量為0.4%和0.6%組的水解度無顯著差異（P>0.05），但顯著高于酶添加量0.8%、1.0%和1.2%組別的水解度（P<0.05），而酶添加量0.8%、1.0%和1.2%組別的水解度無顯著差異（P>0.05）。這是因?yàn)殡S著酶用量的增加，皮蛋清與蛋白酶接觸更充分，而隨著蛋白酶用量的增加，會(huì)使皮蛋清水解過度。蛋白酶用量超過了與皮蛋清充分反應(yīng)所需量時(shí)，皮蛋清不會(huì)發(fā)生更為強(qiáng)烈的水解，同時(shí)水解產(chǎn)生的活性肽及活性官能團(tuán)并不會(huì)增多[24]。綜上所述，選擇酶用量為0.6%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 酶用量對皮蛋清水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effects of the addition of enzyme on the DH and DPPH free radical scavenging rate

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

因蛋白酶需在特定pH和溫度下發(fā)揮作用，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)風(fēng)味蛋白酶的最適酶解環(huán)境為pH6.0和溫度50 ℃，故選擇酶解時(shí)間、酶用量以及物料比作為響應(yīng)面優(yōu)化因素。在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行了三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)方案、結(jié)果和方差分析如表2～表4所示。采用Design Expert 8.0對酶解時(shí)間、酶用量和物料比進(jìn)行多元回歸擬合，得出回歸方程為：

表2 Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for Box-Behnken analysis

表3與表4結(jié)果顯示擬合的二次回歸方程極顯著，其中，水解度Y1的決定系數(shù)R2=0.9762，F(xiàn)=31.92，P<0.0001，Y2的決定系數(shù)R2=0.9905，F(xiàn)=81.27，P<0.0001，模型擬合度高，證明所建立模型可行性高。其中，一次項(xiàng)X1和X2、交互項(xiàng)中X1X2和X2X3、二次項(xiàng)X12、X22、X32對水解度影響具有顯著性（P<0.05），且對水解度影響較高的因素依次為：酶解時(shí)間（X2）、物料比（X1）和酶用量（X3）。而一次項(xiàng)X1、X2和X3、交互項(xiàng)中X1X3和二次項(xiàng)X12、X22、X32對DPPH自由基清除率影響具有顯著性（P<0.05），且對于DPPH自由基清除率影響較高的因素依次為：物料比（X1）>酶用量（X3）>酶解時(shí)間。

表3 水解度回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variances for the developed regression equation for degree of hydrolysis

表4 DPPH自由基清除率回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variances for the developed regression equation for scavenging capacity of DPPH free radical

2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面分析圖可用于評價(jià)各項(xiàng)指標(biāo)對水解度和DPPH自由基清除率的影響，其中，響應(yīng)曲面坡度可用于反映各單因素對響應(yīng)值的影響[25?26]。三維曲面圖的弧度可以說明因素對響應(yīng)指標(biāo)的影響程度，弧度越大，影響越大[27]。圖6與圖7反映的是試驗(yàn)范圍內(nèi)兩因素的交互作用，水解度響應(yīng)面試驗(yàn)中（圖6）顯示酶用量對物料比和酶解時(shí)間的交互作用顯著（圖6a、圖6b），DPPH自由基清除率響應(yīng)面試驗(yàn)（圖7）顯示物料比和酶用量的交互作用顯著（圖7b），與表2和表3中的方差分析一致。

圖6 水解度響應(yīng)面的3D圖Fig.6 3D Plot of degree of hydrolysis with response surface

圖7 DPPH自由基清除率響應(yīng)面3D圖Fig.7 3D Plot of scavenging capacity of DPPH free radical

2.4 皮蛋清抗氧化多肽制備工藝優(yōu)化及驗(yàn)證

經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化工藝，采用Design Expert 8.0軟件和回歸方程分析可知皮蛋清抗氧化肽制備最佳工藝為：物料比1:10.43、酶添加量0.57%、酶解時(shí)間4.11 h，為方便實(shí)際生產(chǎn)，對最佳工藝參數(shù)進(jìn)行了整合，設(shè)置為：物料比1:10.4、酶添加量0.57%、酶解時(shí)間4.1 h，以此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)5次，得到水解度為11.23%，與預(yù)測值（11.50%）相差0.27%，DPPH自由基清除率為89.76%，與預(yù)測值（90.73%）相差0.97%，誤差較小，此條件下可行。

2.5 皮蛋清酶解液的體外抗氧化性分析

在最優(yōu)酶解工藝條件酶解皮蛋清獲得酶解液，對酶解液的體外抗氧化性進(jìn)行了測定，包括還原力、O2?·清除率和·OH清除率。

2.5.1 還原力分析 能夠提供電子的抗氧化性物質(zhì)具有還原力，其作用機(jī)理是能將三價(jià)鐵離子還原為二價(jià)鐵離子，而二者進(jìn)一步反應(yīng)生成普魯士藍(lán)，并在700 nm處有最大吸收峰，吸光值越大，抗氧化能力越強(qiáng)[28]。經(jīng)風(fēng)味蛋白酶水解后的皮蛋清還原力如圖8所示，在測試的濃度范圍內(nèi)，酶解液的還原力隨樣品量的升高而逐漸增加，但與VC的還原力相比，酶解液的還原力較低，可能是酶解液中具有還原性的多肽含量較低。楊瑾等[14]利用堿性蛋白酶酶解鴨蛋清，發(fā)現(xiàn)樣品含量為5 mg/mL時(shí)，其還原力為0.56～0.65，而本實(shí)驗(yàn)在添加1 mL酶解液（10.4 mg/mL）時(shí)的還原為0.599±0.045。說明利用風(fēng)味蛋白酶水解后的皮蛋清多肽還原力低于堿性蛋白酶水解的新鮮鴨蛋清酶解液，可能是因?yàn)槠さ敖?jīng)過腌制后，蛋清內(nèi)蛋白質(zhì)被堿水解，部分具有抗氧化性的結(jié)構(gòu)或官能團(tuán)被破壞。

圖8 皮蛋清酶解液還原力Fig.8 Reducing power for enzymatic hydrolysate of preserved egg white

2.5.2 O2?·清除率分析 O2?·能發(fā)生歧化反應(yīng)產(chǎn)生·OH和過氧化氫而對各種酶的活性有影響，破壞細(xì)胞膜和DNA結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致正常機(jī)體的細(xì)胞功能受損[24]。皮蛋清酶解液的O2?·清除能力變化如圖9所示，隨著樣品量的增加清除能力明顯增強(qiáng)，當(dāng)樣品添加量為10.4 mg/mL時(shí)，清除率為66.78%±2.71%。與VC清除率相比，酶解液清除率較低。分析酶解液與VC的IC50值可知，酶解液的清除O2?·的IC50值為7.98 mg/mL，VC的IC50值為0.073 mg/mL。與堿性蛋白酶水解新鮮鴨蛋清酶解液的O2?·清除率相比，風(fēng)味蛋白酶處理后的皮蛋清水解液清除率較低[29]。可能是不同蛋白酶水解方式和作用位點(diǎn)不同，且皮蛋清經(jīng)過長時(shí)間堿浸泡，蛋白質(zhì)已提前水解。

圖9 蛋清酶解液O2?·清除率Fig.9 Scavenging capacity of preserved egg white hydrolysis on O2?·

2.5.3 ·OH清除率分析 由圖10可知，在測定的梯度范圍內(nèi)，隨著皮蛋清酶解液和VC含量的增加，二者的·OH清除能力明顯增加。與VC的清除率相比，蛋清酶解液的清除率較低，當(dāng)酶解液加入量為10.4 mg/mL時(shí)，其清除率為79.63%±2.67%。分析酶解液與VC的IC50值可知，酶解液的清除·OH的IC50值為4.63 mg/mL，VC的IC50值為0.053 mg/mL。同時(shí)，皮蛋清酶解液與堿性蛋白酶處理新鮮雞蛋清或鴨蛋清得到的酶解液相比，清除·OH的能力并無顯著差異[30?31]。

圖10 蛋清酶解液·OH清除率Fig.10 Scavenging capacity of preserved egg white hydrolysis on ·OH

3 結(jié)論

利用風(fēng)味蛋白酶水解皮蛋清制備抗氧化性多肽，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以水解度和DPPH自由基清除率為響應(yīng)值對物料比、酶解時(shí)間和酶用量為進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得出最佳水解條件為：物料比1:10.4、酶解時(shí)間4.1 h和酶用量0.57%。最佳水解條件下的水解度為11.23%，DPPH自由基清除率為89.76%?？寡趸詫?shí)驗(yàn)分析顯示皮蛋清酶解液具有一定的抗氧化性。本文僅對利用風(fēng)味蛋白酶水解皮蛋清制備抗氧化性多肽工藝及抗氧化性進(jìn)行了研究，但其功能特性和結(jié)構(gòu)特性等其他方面有待進(jìn)一步深探。