噴施化肥和有機肥對山藥成分的影響研究＊

賈銘鉉，楊雅蛟，孔維軍，賀 超，李先恩，周立東＊＊，李東輝＊＊

（1.錦州醫(yī)科大學藥學院 錦州 121001；2.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室 北京 100193）

山藥（Chinese yam）是薯蕷科植物薯蕷的干燥根莖[1]，主要分布于我國東北、華北、華中等地區(qū)[2]。作為我國重要的藥食同源植物，山藥含有豐富的營養(yǎng)物質，不僅可以作為食物為人們提供能量，而且具有重要的藥用價值，傳統(tǒng)中醫(yī)認為其可補脾養(yǎng)胃、補腎澀精[3-4]?，F代研究也表明，山藥中富含多糖、蛋白質、氨基酸、尿嘧啶、腺苷、尿囊素等物質[5-6]，具有降血糖、增強免疫力、抗氧化、抗炎和抗菌等功能[7-15]。

山藥對生長環(huán)境的要求不高，且適應能力較強，一般喜歡生長在溫暖的環(huán)境中，但也可以適應寒冷環(huán)境。山藥不耐旱澇，因此不宜生長在排水不暢的區(qū)域[16]。山藥的生長受多種因素的影響，例如氣候、產地、品種、栽培方式和肥料等[17-18]。作為一種高需肥作物，肥料的添加能夠顯著影響山藥的根莖大小和營養(yǎng)成分的含量，因此如何選擇肥料對山藥的生長及成分含量和質量至關重要[19-20]。通?；实某煞州^單純，養(yǎng)分含量高，見效快，但也存在成分單一、營養(yǎng)不全面、肥效不持久等缺點。有機肥富含豐富的營養(yǎng)物質，而且可以增加土壤中的有機膠體，提高土壤保水、保肥和透氣性能，然而有機肥中養(yǎng)分含量低，不易分解，不能及時滿足作物高產的要求[21-22]。目前的研究多集中在化肥對山藥品質的影響，例如盧寶安等人研究了不同施肥量和不同施肥時期次數對麻山藥產量的影響，結果表明合理的氮磷鉀肥配比可以增加山藥產量，而過量施加氮磷鉀肥會導致山藥產量下降而影響山藥品質[23]。張月萌等人研究了氮磷鉀肥對山藥生長發(fā)育的影響，氮磷鉀肥施用量的提高可顯著促進山藥地上部和地下部鮮、干生物量的累積[19]。近年來，化肥的用量呈大幅度增長趨勢，隨之而來的生態(tài)問題逐漸顯現，例如土壤酸性增加，土壤板結，理化性質變差等，這對山藥的品質產生不利影響[24]。有機肥可以提高土壤保水、保肥和透氣性能，這對山藥種植具有長期的益處[25]。劉美琳等人對山藥施加有機肥后，發(fā)現山藥的長勢和產量均得到提高[26]。呂亞慈研究了微生物菌肥對麻山藥產量和品質的影響，結果表明微生物菌肥可以提高白嘴山藥的總糖、蛋白質、灰分、淀粉的含量，降低其含水量，而且能使山藥增產[27]?；屎陀袡C肥均能改善山藥的產量和品質，然而對比兩者對山藥生長影響的研究較少，為了探究不同肥料對山藥生長的影響，本研究考察并比較了施加化肥和有機肥后山藥的主要成分變化，以期為山藥的肥料的選擇提供可靠參考。

1 山藥施肥及樣品收集

分別對河北安國種植的小白嘴山藥在生長過程中施以化肥（尿素）和有機肥（史丹利復合肥），共3次。第1 次在植物地上生長旺盛期（6月下旬至7 月上旬），第2次在植物地上部分生長高峰前期（7月下旬至8 月上旬），第3次在秋季地上部分停止生長期（8月下旬至9月初）。收獲后，選取新鮮山藥塊莖，洗凈，去除每個山藥品種的龍頭，各取化肥和有機肥處理過的山藥，測定其塊莖中水分及主要成分的含量。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實驗儀器

UV-2550 型紫外-可見分光光度計（日本SHIMADZU）；Waters 2695 型高效液相色譜儀、PDA 996 檢測器（美國Waters 公司）；N-1100 型旋轉蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；UDK159 型全自動凱氏定氮儀（意大利VELP 公司）；L-8900 型蛋白水解液氨基酸分析系統(tǒng)（日本日立公司）。

2.1.2 實驗試劑

D-無水葡萄糖（國藥集團化學試劑有限公司）；苯酚、甲基紅（阿拉?。溲趸c、檸檬酸鈉（北京化學工業(yè)集團有限公司）；無水乙醇、鹽酸、石油醚、硫酸（北京市通廣精細化工公司）；硫酸銅（天津市化工三廠有限公司）；硫酸鉀、硼酸（麥克林）；乙腈（Thermo Fisher 公司）；尿嘧啶（純度99.6%）、腺苷（純度99.7%）和尿囊素（純度99.6%）（北京中科質檢生物技術有限公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 山藥水分含量測定

收集不同肥料處理過的山藥樣品，清洗干凈并參照《GB 5009.3-2016食品安全國家標準食品中水分的測定》方法測定收集的山藥樣品中水分的含量。

2.2.2 山藥多糖含量測定

按照實驗室前期研究所建立的方法對山藥中多糖進行含量測定[15]。

2.2.3 山藥樣品中蛋白質和氨基酸含量測定

收集不同肥料處理過的山藥樣品，清洗干凈并參照《GB 5009.5-2016 食品中蛋白質的測定》第一法，采用凱氏定氮法測定山藥中的蛋白質含量。

收集不同肥料處理過的山藥樣品，清洗干凈并參照《GB 5009.124-2016 食品中氨基酸的測定》方法測定山藥中氨基酸的含量。

2.2.4 山藥樣品中小分子有效成分的含量測定

采用高效液相色譜二極管陣列檢測器聯用儀（high performance liquid chromatography-diode array detector，HPLC-DAD）測定樣品中尿囊素、尿嘧啶和腺苷的含量[15]。

3 結果與分析

3.1 化肥和有機肥對山藥單根重量的影響

如圖1 所示，施加化肥后山藥的平均單根重量約為550 g，而施加有機肥的山藥平均單根重量要小一些，約為510 g，表明化肥的噴施較有機肥更加促進山藥的生長。

圖1 化肥和有機肥處理的山藥單根重量（g）（n=3）

3.2 化肥和有機肥對山藥中水分含量的影響

在本實驗中，施加不同肥料的山藥中水分含量存在較大差異（圖2）。其中施加化肥的山藥中水分含量較高，為80.22%，而施加有機肥的山藥中水分含量為77.04%，表明噴施化肥更有利于保持山藥的含水量。

圖2 化肥和有機肥處理的山藥水分含量（n=3）

3.3 化肥和有機肥對山藥中多糖含量的影響

3.3.1 標準曲線的建立

分別以D-無水葡萄糖的濃度值（c）和吸光度值（A）為橫、縱坐標，線性回歸得到A-c關系曲線（圖3）。結果表明，D-無水葡萄糖在0.005-0.05 mg·mL-1濃度范圍內與吸光度值呈現良好的線性關系（n=3），線性方程為A=24.7234c+0.2400，R2=0.9998。

圖3 D-無水葡萄糖標準曲線（n=3）

3.3.2 精密度考察

精密稱取D-無水葡萄糖對照品25 mg，配成濃度為0.1 mg·mL-1的對照品溶液，然后在具塞試管中移入0.4 mL 對照品溶液，加入1.6 mL 純凈水。取一支試管并加入2 mL純凈水作為空白對照，在各個試管中分別加入5 mL 濃硫酸和1 mL 5%的苯酚溶液，迅速搖勻，靜置10 min 后將各個試管放置在40℃水浴中加熱15 min，之后用冰水浴冷卻至室溫，最后用UV-2550 型紫外-可見分光光度計在波長490 mm 處測定6次。測得的吸光度值分別為0.735、0.733、0.737、0.734、0.735、和0.731，相對標準偏差（relative standard deviation,RSD）為0.28%（表1），表明儀器精密度良好。

表1 山藥多糖精密度考察

3.3.3 穩(wěn)定性考察

山藥樣品的供試液是按照前期研究基礎制備的[15]。精密量取1 mL 供試品溶液，加入1 mL 純凈水，然后向其中加入5 mL 濃硫酸和1 mL 5%的苯酚溶液，迅速搖勻，連續(xù)測定吸光度值6 次，每次間隔3 h。測得的吸光度值分別為0.643、0.645、0.647、0.639、0.644和0.641，RSD 值為0.44%（表2），表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

表2 山藥多糖穩(wěn)定性考察

3.3.4 重復性考察

分別從6 份山藥樣品中制備6 份供試品溶液，從每份供試品溶液中精密量取1 mL，加入1 mL 純凈水，然后向其中加入5 mL 濃硫酸和1 mL 5%的苯酚溶液，迅速搖勻，測定吸光度值。所測得的吸光度值分別為0.716、0.723、0.724、0.717、0.721 和0.726，平均值為0.721，RSD 為0.55%（表3），以上結果說明山藥樣品制備方法具有很好的重復性。

表3 山藥多糖重復性考察

3.3.5 山藥多糖含量測定

通過D-無水葡萄糖標準曲線計算不同肥料處理后山藥中多糖的含量。由圖4 可以看出，化肥和有機肥對山藥多糖含量存在較大的影響。噴施化肥的山藥中多糖含量為20.46 mg·g-1，而施加有機肥的山藥中多糖含量為24.33 mg·g-1，表明，相比于化肥，有機肥的施加更能促進山藥中多糖的積累。

圖4 化肥和有機肥處理的山藥多糖含量（n=3）

3.4 化肥和有機肥對山藥中蛋白質和氨基酸含量的影響

按照上述方法分別測定化肥和有機肥處理后山藥中蛋白質和氨基酸的含量（圖5）。施加有機肥的山藥中蛋白質含量為12.1 g/100 g，總氨基酸為7.11 g/100 g，絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、蘇氨酸的含量分別為0.72、1.28、0.25、0.33、0.66、0.34、0.048、0.26、0.42、0.082、0.32、0.38、0.16、0.788、0.8、0.28 g/100 g；施加化肥的山藥中蛋白質含量為14.2 g/100g，總氨基酸為7.26 g/100 g，絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、蘇氨酸的含量分別為0.74、1.31、0.25、0.34、0.68、0.34、0.048、0.26、0.44、0.086、0.33、0.39、0.16、0.8、0.8、0.29 g/100 g。結果表明，施加化肥對山藥中蛋白質含量的增加較有機肥顯著，而在促進氨基酸產量方面，兩者差異并不大。

圖5 有機肥和化肥對山藥中蛋白質和氨基酸含量的影響（n=3）

3.5 化肥和有機肥對山藥中小分子成分含量的影響

3.5.1 色譜條件

色譜柱：XBridge?BEH Amide (4.6 mm × 250 mm,5 μm)柱；流動相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫：0-5 min,90%-90% A; 5-6 min, 90%-95% A; 6-50 min, 95% A;流速：0.5 mL·min-1，檢測波長：212 nm，255 nm；柱溫：35℃；進樣量：5 μL（對照品），20 μL（供試品）。

3.5.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取腺苷、尿囊素和尿嘧啶的對照品分別10 mg、30 mg和2 mg，用90%乙腈溶解并定容至10 mL容量瓶中，搖勻，即得含有0.9970 mg·mL-1腺苷、2.988 mg·mL-1尿囊素和0.1992 mg·mL-1尿嘧啶的混合對照品溶液。

3.5.3 供試品溶液的制備

取化肥和有機肥處理過的山藥樣品，分別精密稱取2 g山藥粉末，并加入100 mL石油醚，使用超聲波清洗器超聲處理1 h（450W），過濾。隨后將濾渣和濾紙轉移至具塞錐形瓶中，并加入甲醇100 mL，超聲處理1 h，隨后過濾得到濾液，重復以上操作3 次。將所得到的濾液壓縮至干，隨后將所得到的物質轉移至5 mL容量瓶中，用90%乙腈溶解并定容，最后將所得到的的溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

3.5.4 線性關系考察

分別精密量取0.1、0.5、0.8、1.5、2.0、4.0 mL混合對照品溶液至2 mL 容量瓶中，用色譜90% 乙腈稀釋至刻度，制成6 個不同濃度的混合標準品溶液。用0.45 μm 微孔濾膜過濾，按上述色譜條件進樣分析。以峰面積（y）對濃度（x）進行回歸計算，得回歸方程。其中尿囊素在149.40-5976.00 μg·mL-1濃度范圍內呈良好的線性關系，線性方程為y=1.94×106x-1.53×105，R2=0.999；尿嘧啶在9.96-398.40 μg·mL-1濃度范圍內呈良好的線性關系，線性方程為y= 8.77×106x- 7.26×104，R2= 0.999；腺苷在49.85-1994.00 μg·mL-1濃度范圍內呈良好的線性關系，線性方程為y= 9.84×106x-2.75×105，R2=0.999。

3.5.5 精密度考察

取“3.5.2”項下的對照品溶液，向高效液相色譜儀中連續(xù)進樣6 次，測得尿嘧啶、腺苷和尿囊素含量的RSD 值（n = 6）分別為0.90%、0.89%和0.97%，保留時間的RSD（n = 6）分別為0.38%、0.87%、0.83%（表4），表明儀器精密度良好。

表4 3種小分子有效成分的精密度考察

3.5.6 重復性考察

平行制備6 份供試品溶液（按“3.5.3”項的方法），并注入高效液相色譜儀中進行檢測。測得山藥中尿嘧啶、腺苷和尿囊素含量的RSD 值（n = 6）分別為1.05%、0.88%和0.82%（表5），保留時間的RSD（n=6）分別為0.78%、0.55%和0.49%，表明方法重復性良好。

表5 3種小分子有效成分的重復性考察

3.5.7 穩(wěn)定性考察

為了考察供試品溶液的穩(wěn)定性，分別采集室溫下不同放置時間（0、4、8、12、16 和24 h）的同一供試品溶液，并注入高效液相色譜儀中進行檢測，測得山藥中尿嘧啶、腺苷和尿囊素的RSD值（n=6）分別為0.88%、0.68%和0.56%，保留時間的RSD（n = 6）分別為0.41、0.61%和0.88%（表6），以上結果表明，在24 h 內，所制備的供試品溶液具有良好的穩(wěn)定性。

表6 尿嘧啶、腺苷和尿囊素的穩(wěn)定性考察

3.5.8 加樣回收率考察

取已知3 種小分子成分含量的同一批山藥粉末9份，每份精密稱取2.0 g，每3 份為一組，分別精密加入一定量的各對照品溶液（按樣品溶液中相應成分含量的80%、100%和120%加入），制備供試品溶液（按“3.5.3”項的方法），并注入高效液相色譜儀中進行檢測，計算平均加樣回收率及RSD（表7）。尿嘧啶的平均加樣回收率為99.03%，RSD 為0.7%；腺苷的平均加樣回收率為99.42%，RSD為0.45%；尿囊素的平均加樣回收率為99.99%，RSD為0.13%，以上結果表明所建立的方法具有良好的準確度。

表7 尿嘧啶、腺苷和尿囊素的加樣回收率實驗(n = 9)

3.5.9 實際樣品檢測

將對照品和供試品溶液，按色譜條件進樣，分別在212 nm 和255 nm 波長下對尿囊素、尿嘧啶和腺苷對照品和山藥樣品進行檢測（圖6）。記錄不同樣品中各待測成分的色譜峰峰面積，代入回歸方程，即可計算各樣品中尿嘧啶、腺苷和尿囊素等3 個小分子化合物的含量。

圖6 山藥樣品與對照品的HPLC圖譜

結果表明，施加有機肥的山藥中尿嘧啶、腺苷和尿囊素的平均含量分別為0.0030、0.0062 和0.4902 mg·g-1，施加化肥的山藥中尿嘧啶、腺苷和尿囊素的平均含量分別為0.0122、0.0063 和0.5465 mg·g-1。施加化肥的山藥中尿嘧啶、腺苷和尿囊素含量均高于有機肥處理的山藥樣品，這可能與化肥中微量元素相比于有機肥含量較高有關。

4 討論

山藥作為一種“藥食兩用”食品和中藥，具有很高的營養(yǎng)功能和藥用價值。我國是山藥的原產地，山藥的栽培歷史悠久，品種眾多，分布廣泛。作為一種重要的食材，山藥每年的消耗量巨大，是重要的農業(yè)經濟作物。多糖、蛋白質、氨基酸、尿嘧啶、腺苷、尿囊素等是山藥的主要營養(yǎng)物質，其含量高低直接影響了山藥的品質。肥料的施加可以顯著影響山藥的品質及產量，因此本研究比較了化肥和有機肥對山藥成分的影響。

本研究發(fā)現，施加化肥的山藥中水分和蛋白質、尿嘧啶、腺苷和尿囊素的含量均都高于施加有機肥的山藥；而施加有機肥的山藥中多糖的含量高于施加化肥山藥的多糖含量。以上結果表明，化肥和有機肥對山藥成分會產生不同的影響，為了提升山藥的品質，僅施加一種肥料是遠遠不夠的，因此在未來山藥的栽培和種植中探索多種肥料的聯合施加，將會成為提升山藥品質的一個重要的解決方案。