菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒的HPLC 指紋圖譜相關(guān)性研究

姚曉璇，王瑜婷，邱彩月，何榮榮，陳銘恩，黎桃敏，劉燎原

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東佛山528244）

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta australisR.Br.或菟絲子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟種子。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品。菟絲子性平，味辛、甘，具有補(bǔ)益肝腎、固精縮尿、安胎明目的功效[1?2]?，F(xiàn)代研究表明，菟絲子主要包括黃酮類、有機(jī)酸、多糖、木脂素類、氨基酸和生物堿等成分，其主要藥理作用有保肝、抗骨質(zhì)疏松、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、腫瘤、增強(qiáng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能、抑制黑色素合成等[3?4]，具有良好的藥用價(jià)值。

中藥配方顆粒是以中藥飲片為原料，經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒而成的可供中醫(yī)臨床調(diào)配使用的顆粒制劑[5]，中藥配方顆粒是中藥湯劑的一種現(xiàn)代劑改形式，是中藥飲片的一種補(bǔ)充。中藥配方顆粒與中藥湯劑之間的差異來源于湯液濃縮、干燥過程中相關(guān)成分的物理遺失與化學(xué)變化[6]。目前，有關(guān)菟絲子藥材的化學(xué)成分測(cè)定和指紋圖譜研究較多[7?9]，尚無對(duì)菟絲子及其制劑產(chǎn)品相關(guān)性研究的報(bào)道。本研究分別建立了菟絲子飲片、水煎液、配方顆粒的HPLC指紋圖譜，比較3者之間HPLC指紋圖譜的相關(guān)性和差異性，探討菟絲子配方顆粒制備過程中的化學(xué)成分轉(zhuǎn)化，確保顆粒劑與湯劑質(zhì)量的一致性，以期為菟絲子配方顆粒的質(zhì)量控制和臨床安全有效用藥提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Arc 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；XP26 型百萬分之一天平、ME204E 型萬分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；Milli?Q Direct 型超純水系統(tǒng)（德國(guó)Merck 公司）；SODA?12型噴霧干燥機(jī)（上海大川原干燥設(shè)備有限公司）；LGS20 型干法制粒機(jī)（南京迦南科技有限公司）；YRE?501 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；DLSB?5/20 型低溫冷卻液循環(huán)水泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；KQ?500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸（批號(hào)：110753?202018，純度96.1%）、金絲桃苷（批號(hào)：111521?201809，純度94.9%）、異槲皮苷（批號(hào)：111809?201804，純度97.2%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；隱綠原酸（批號(hào)：DST210427?035，純度98.24%）對(duì)照品購(gòu)自成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純（德國(guó)Merck 公司），磷酸為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。

16 批菟絲子藥材（樣品編號(hào)為S1-S16）經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為正品，均為南方菟絲子Cuscuta australisR. Br.的干燥成熟種子，藥材產(chǎn)地信息見表1。16批菟絲子飲片（樣品編號(hào)為Y1-Y16）嚴(yán)格按照2020 年版《中國(guó)藥典》一部菟絲子項(xiàng)下飲片炮制規(guī)定進(jìn)行炮制[1]；16 批菟絲子水煎液（樣品編號(hào)為T1-T16）嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》相關(guān)要求進(jìn)行煎煮[10]，取每批菟絲子的提取液，減壓濃縮，定容至100 mL，得樣品水煎液；16批菟絲子配方顆粒（樣品編號(hào)為P1-P16）由水煎液經(jīng)濃縮、干燥、制粒等步驟得到。

表1 16批菟絲子藥材的來源信息Table 1 Source information of 16 batches of Cuscutae Semen

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[11]

色譜柱：Xselect HSS T3（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）?0.1%磷酸溶液（B）梯度洗脫（0～30 min，7%～12%A；30～35 min，12%～15%A；35～55 min，15%A；55～80 min，15%～30%A；80～85 min，30%～93%A；85～90 min，93%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別取綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為78.42、62.20、58.27、56.86 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 菟絲子飲片供試品溶液取菟絲子飲片粉末（過四號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得飲片供試品溶液。

2.3.2 菟絲子水煎液供試品溶液精密吸取混合均勻的菟絲子水煎液10 mL，置50 mL 量瓶中，加水5 mL，加甲醇定容至刻度，稱定質(zhì)量，超聲處理（300 W，45 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得水煎液供試品溶液。

2.3.2 菟絲子配方顆粒供試品溶液取菟絲子配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（300 W，45 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得配方顆粒供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn)分別精密吸取空白溶劑、對(duì)照品溶液及供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1?？梢?，供試品溶液色譜在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的保留時(shí)間處具有相同的色譜峰，且空白溶劑無干擾，表明方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖Figure 1 The HPLC chromatograms of specific test

2.4.2 精密度試驗(yàn)精密吸取“2.2”項(xiàng)對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以5 號(hào)峰金絲桃苷為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 范圍分別為0.15%～0.22%和0.23%～0.64%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取菟絲子飲片（編號(hào)Y16），精密稱定，按“2.3.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別于制備0、4、8、12、24、48 h 后按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以5號(hào)峰金絲桃苷為參照峰，計(jì)算得各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 范圍分別為0.16%～1.21%和1.32%～2.57%，表明菟絲子飲片供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)取菟絲子飲片（編號(hào)Y16）6 份，精密稱定，按“2.3.1”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以5 號(hào)峰金絲桃苷為參照峰，計(jì)算得各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 范圍分別為0.10%～0.12% 和0.13%～2.20%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 HPLC指紋圖譜的建立與相似度評(píng)價(jià)

2.5.1 指紋圖譜的建立分別取16 批菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒，按“2.3”項(xiàng)方法分別制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012 版”對(duì)色譜圖進(jìn)行匹配，確定菟絲子飲片、水煎液、配方顆粒均有8 個(gè)共有峰，如圖2-4 所示。通過與對(duì)照品圖譜對(duì)比，確定1 號(hào)峰為綠原酸，2 號(hào)峰為隱綠原酸，5 號(hào)峰為金絲桃苷，6號(hào)峰為異槲皮苷。

圖2 16批菟絲子飲片的HPLC指紋圖譜疊加圖Figure 2 The HPLC fingerprints of 16 batches of Cuscutae Semen pieces

2.5.2 相似度評(píng)價(jià)分別將16 批菟絲子飲片、水煎液、配方顆粒HPLC指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012 版”軟件，分別計(jì)算各批次菟絲子飲片、水煎液、配方顆粒HPLC指紋圖譜與其對(duì)照?qǐng)D譜的相似度，結(jié)果見表2。可見，16批菟絲子飲片、水煎液、配方顆粒HPLC指紋圖譜與其相應(yīng)對(duì)照指紋圖譜（R1、R2、R3）的相似度均大于0.900，表明不同批次菟絲子飲片、水煎液、配方顆粒的質(zhì)量較為穩(wěn)定。

圖3 16批菟絲子水煎液的HPLC指紋圖譜疊加圖Figure 3 The HPLC fingerprints of 16 batches of Cuscutae Semen water decoction

圖4 16批菟絲子配方顆粒的HPLC指紋圖譜疊加圖Figure 4 The HPLC fingerprints of 16 batches of Cuscutae Semen formula granules

2.5.3 對(duì)照指紋圖譜的比較分別將16批菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒指紋圖譜生成的對(duì)照指紋圖譜R1、R2 和R3（見圖5）導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版”軟件，結(jié)果顯示：與菟絲子飲片比較，菟絲子水煎液和配方顆粒的相似度分別為0.998 和0.997，菟絲子水煎液和配方顆粒指紋圖譜相似度為1.000，表明菟絲子飲片、水煎液與配方顆粒成分基本一致，菟絲子水煎液在提取、濃縮、干燥、制粒過程中，其成分種類無明顯變化。

表2 16 批菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒HPLC 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Results of similarity analysis of 16 batches of Cuscu?tae Semen pieces，water decoction，formula granules

圖5 菟絲子飲片對(duì)照指紋圖譜（R1）、水煎液對(duì)照指紋圖譜（R2）和配方顆粒對(duì)照指紋圖譜（R3）Figure 5 Reference fingerprints of Cuscutae Semen pieces，water decoction，formula granules by HPLC

2.6 化學(xué)模式識(shí)別研究

2.6.1 共有峰相關(guān)性分析采用SPSS 26.0 軟件，以16批菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒共48個(gè)樣品各特征峰的“峰面積占比”值（各特征峰峰面積占特征峰總面積的比例）為變量進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，結(jié)果見表3?？梢姡私z子飲片與水煎液或配方顆粒比較，除色譜峰峰3 外，菟絲子飲片、水煎液及其配方顆粒的7 個(gè)共有峰均具有顯著的正相關(guān)性；菟絲子水煎液與配方顆粒比較，8 個(gè)峰均具有極顯著的正相關(guān)性。

表3 16批菟絲子飲片、水煎液、配方顆粒指紋圖譜共有峰的相關(guān)性分析結(jié)果Table 3 Correlation analysis results of common peaks of Cuscu?tae Semen pieces，water decoction and formula granules

2.6.2 聚類分析采用SPSS 26.0 軟件，以16 批菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒共48個(gè)樣品各特征峰面積為變量進(jìn)行聚類分析[12]，結(jié)果見圖6?？梢姡?dāng)距離為10 時(shí)，48 批樣品可以分為4 類，Y6-Y8、T1-T16、P1-P4、P6-P16 聚為一類，Y3-Y4、Y9-Y16 聚為一類，Y2、Y5、P5 聚為一類，Y1 單獨(dú)聚為一類。表明甘肅與黑龍江產(chǎn)地與其他2個(gè)產(chǎn)地的菟絲子飲片存在差異，菟絲子水煎液與配方顆粒之間無明顯差異，可聚為一類。

2.6.3 主成分分析（PCA） 采用SPSS 26.0 軟件，對(duì)16批菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒共48個(gè)樣品各特征峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化值（Xi）進(jìn)行主成分分析，主成分結(jié)果以特征值＞1 為標(biāo)準(zhǔn)提取得到2 個(gè)主成分，計(jì)算得特征值和方差貢獻(xiàn)率見表4，主成分因子載荷矩陣見表5。由結(jié)果可知，前2個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為78.80%，表明提取的2 個(gè)主成分能反映菟絲子指紋圖譜的大部分信息。主成分1 的特征值為3.958，方差貢獻(xiàn)率為49.48%，載荷較高的峰有綠原酸、峰4、金絲桃苷、異槲皮苷、峰7 和峰8，表明這6 個(gè)峰主要反映主成分1的信息；主成分2的特征值為2.345，方差貢獻(xiàn)率為29.32%，載荷較高的峰有隱綠原酸、峰3，表明這2個(gè)峰主要反映主成分2的信息。

表4 菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒主成分分析特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 4 Characteristic value and variance contribution rate of Cuscutae Semen pieces，water decoction，formula granules

表5 菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒主成分因子載荷矩陣Table 5 Factors loading matrix of Cuscutae Semen pieces，water decoction，formula granules

圖7 菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒HPLC 指紋圖譜主成分得分圖Figure 7 PCA Score plot of principal component analysis of Cuscutae Semen pieces，water decoction，formula granules

2.6.4 正交偏最小二乘判別分析（OPLS?DA） 采用SIMCA 14.1 軟件，以16 批菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒共48 個(gè)樣品各特征峰峰面積為變量進(jìn)行OPLS?DA 分析，結(jié)果見圖8-9。由模型參數(shù)可知，數(shù)據(jù)矩陣的解釋率參數(shù)R2X（cum）=0.900，模型區(qū)分參數(shù)R2Y（cum）=0.702，模型預(yù)測(cè)參數(shù)Q2=0.651，均＞0.500，表明該數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定可靠［15?16］。48 個(gè)樣品可分成3 類。以VIP 值＞1 為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到峰3、金絲桃苷、峰4是影響分類的主要標(biāo)志性成分。

圖8 菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒HPLC 指紋圖譜OPLS?DA得分圖Figure 8 OPLS?DA Score plot of Cuscutae Semen pieces，waterdecoction，formula granules

3 討論

中藥配方顆粒既保留了傳統(tǒng)中醫(yī)藥辨證論治、復(fù)方配伍、隨證加減的優(yōu)勢(shì)和特色，同時(shí)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)中藥湯劑煎煮費(fèi)時(shí)、儲(chǔ)存攜帶不便等不足，相比中藥飲片具有更高的附加值，更能體現(xiàn)中藥用藥的現(xiàn)代化、規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化，是對(duì)傳統(tǒng)中藥的重要?jiǎng)?chuàng)新[17]。目前中藥配方顆粒與中藥飲片水煎液的成分對(duì)比研究，大多以單個(gè)指標(biāo)成分含量進(jìn)行比較，整體成分比較的研究較少，不能全面反映中藥質(zhì)量水平。中藥指紋圖譜是中藥整體性的化學(xué)表征，可以直觀地反映制備工藝的穩(wěn)定性和配方顆粒的質(zhì)量，是中藥配方顆粒進(jìn)行質(zhì)量控制的重要方法[18]。

圖9 菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒HPLC 指紋圖譜VIP值Figure 9 Result of VIP of Cuscutae Semen pieces，water decoc?tion，formula granules

本文建立的菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒HPLC指紋圖譜及分析方法共確定了8個(gè)共有峰，并指認(rèn)了其中4個(gè)共有峰分別為綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷和異槲皮苷。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，16 批菟絲子飲片、水煎液和配方顆粒均與相應(yīng)的對(duì)照指紋圖譜的相似度較高，表明不同批次的菟絲子整體的化學(xué)成分具有較好的一致性；水煎液和配方顆粒的制備工藝穩(wěn)定。散點(diǎn)圖中點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離代表各樣品之間存在的差異程度[19]。CA、PCA和OPLS?DA結(jié)果顯示，不同批次菟絲子飲片較為分散，不同批次水煎液、配方顆粒之間較為緊密，表明經(jīng)過水煎煮后菟絲子中各類化學(xué)成分具有較好的一致性；飲片與水煎液、配方顆粒之間的差異較大，可能是由于菟絲子中的熱敏性成分（如綠原酸）經(jīng)過煎煮后含量發(fā)生變化；水煎液和配方顆粒之間的關(guān)系較為緊密，差異較小，表明菟絲子從水煎液到配方顆粒的制備過程中各類化學(xué)成分得到了較好地保留。由皮爾遜相關(guān)性分析可得，除峰3 外，其他7 個(gè)峰均具有顯著正相關(guān)性。該方法能較好地反映三者的相關(guān)性及差異性，可為菟絲子配方顆粒的生產(chǎn)過程和質(zhì)量控制提供依據(jù)。