人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞荷瘤裸鼠18F-乙基膽堿、11C-膽堿、18F-FDG 生物分布和PET腫瘤顯像

王新剛，孫晶晶，桂 一，楊桂芬，朱 虹

0 引 言

肝是人體重要器官，肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是肝最常見的腫瘤，死亡率高，大約80%的HCC與慢性肝炎及繼發(fā)肝硬化有關(guān)[1]。在肝硬化患者，常規(guī)的成像技術(shù)如增強(qiáng)CT、MRI診斷HCC的敏感度為80%～88%，尚需進(jìn)一步提高[2]。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的出現(xiàn)，對(duì)腫瘤進(jìn)行分子成像有很大價(jià)值，而PET能檢測(cè)腫瘤早期就存在的代謝異常，能顯示與病情預(yù)后和治療敏感性相關(guān)的分子過程[3]。但臨床常規(guī)使用的18F-脫氧葡萄糖 (fluorine-18-fluorodeoxyglucose,18F-FDG)并非特異性腫瘤顯像劑，在PET顯像中會(huì)出現(xiàn)假陽性、假陰性情況。惡性腫瘤除了糖代謝增高，膽堿代謝水平也增加，因此可以通過示蹤膽堿代謝來檢測(cè)HCC。本研究探討18F-乙基膽堿、11C-膽堿、18F-FDG在人肝癌HepG2細(xì)胞株荷瘤裸鼠的生物學(xué)分布及診斷HCC的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c裸鼠飼養(yǎng)條件為無特異性病原體(Specific Pahtogen Free，SPF)無菌飼養(yǎng)室。將人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞株(購自中科院細(xì)胞庫)接種于BALB/c裸鼠(購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)： SCXK(滬)2017-0005，待瘤體體積>100 mm3用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)顯像前荷瘤裸鼠禁食給水8 h以上。

1.2 顯像劑18F-乙基膽堿、11C-膽堿、18F-FDG的制備采用醫(yī)用回旋加速器(HM-7型，日本住友重機(jī)械株式會(huì)社)、氟多功能標(biāo)記模塊(PET-MF-2V-IT-Ⅰ，北京派特生物技術(shù)有限公司)、碳多功能化學(xué)合成專用合成模塊(CFN-MPS100，日本住友重機(jī)械株式會(huì)社)、FDG專用合成模塊(PET-FDG-IT-Ⅱ，北京派特生物技術(shù)有限公司)合成18F-乙基膽堿(18F-fluoroethylcholine,18F-FECh)、11C-膽堿(11C-choline,11C-Cho)、18F-FDG，放射化學(xué)純度均大于>95%。

1.3實(shí)驗(yàn)方法人肝癌HepG2荷瘤裸鼠共3只，采用自身對(duì)照顯像方法，同一只荷瘤裸鼠分別進(jìn)行18F-FECh、11C-膽堿、18F-FDG 3次顯像，相鄰顯像間隔1 d。首先將荷瘤裸鼠麻醉(麻醉劑為1%～2%的異氟烷)后放置于掃描床，用醫(yī)用膠帶固定，并建立尾靜脈注射通道，注射放射性藥物劑量約0.5 mCi，注射完畢后，開始動(dòng)態(tài)掃描采集數(shù)據(jù)。

1.4 microPET動(dòng)態(tài)顯像采集模式為Emission，能窗范圍均為350～650 Kev，設(shè)置采集程序參數(shù)：選擇放射性核素18F或11C，設(shè)置18F-FECh、18F-FDG顯像采集時(shí)長為60 min，因11C的半衰期較短(僅20 min)，設(shè)置11C-膽堿顯像時(shí)長為30 min；設(shè)置重建方法為3D 有序子集最大期望(Ordered Subsets Expectation Maximization, OSEM)算法和基于Bayesian的最大后驗(yàn)(Maximum A Posterior, MAP)算法，然后進(jìn)行定位并將裸鼠移動(dòng)至FOV中心，尾靜脈推藥、同時(shí)點(diǎn)擊啟動(dòng)鍵開始掃描，儀器自動(dòng)記錄數(shù)據(jù)。

1.5圖像重建、數(shù)據(jù)提取及數(shù)據(jù)分析對(duì)microPET數(shù)據(jù)進(jìn)行重組，18F-FECh和18F-FDG顯像分別形成5、10、20、30、45、60 min時(shí)間點(diǎn)的序列數(shù)據(jù)，11C-膽堿顯像形成5、10、20、30 min時(shí)間點(diǎn)的序列數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行圖像重建。圖像重建方法為3D OSEM和MAP、迭代2次、子集數(shù)18。在腦、心(腔)、肝、肺、腎(皮質(zhì))、肌肉(下肢近端)、腫瘤等器官組織勾畫感興趣區(qū)(ROI)，提取ROI放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克組織百分?jǐn)z取率(%ID/g)：

%ID/g=感興趣區(qū)放射性攝取(μCi/g)/總注射量(μCi)×100%

所有數(shù)據(jù)提取遵循相同的ROI定位勾畫，每個(gè)器官選取3個(gè)器官顯像較好層面進(jìn)行ROI勾畫、提取放射性計(jì)數(shù)，并求均值。以肝攝取代表人肝癌HepG2腫瘤組織生長背景、肌肉攝取代表軀體組織本底，計(jì)算18F-FECh、11C-膽堿、18F-FDG microPET顯像腫瘤/肝比值(瘤/肝比)、腫瘤/肌肉比值(瘤/肌比)。

2 結(jié) 果

2.1 荷瘤裸鼠18F-FECh、11C-膽堿、18F-FDG microPET顯像測(cè)定活體生物分布18F-FECh在肝攝取最高，腎早期排出較快、20 min后排出緩慢，而其他組織攝取均較低，其中腫瘤攝取略高于其他組織且隨時(shí)間延長緩慢增加，60 min內(nèi)腫瘤攝取值為3.06～4.12% ID/g，見圖1。11C-膽堿在腎分布最高、此后持續(xù)下降，肝次之，心臟有一定攝??；而其他組織攝取均較低，其中腫瘤攝取略高于肌肉組織、與肺組織攝取相近，30 min內(nèi)腫瘤攝取值為0.38%～0.43% ID/g，見圖2。18F-FDG在腎、心臟、肝、腦攝取高，這與臨床PET/CT顯像所見相似，18F-FDG在腫瘤有高攝取，高于肌肉、肺和肝組織，60 min內(nèi)腫瘤攝取值為7.46%～6.16% ID/g。

2.2 荷瘤裸鼠18F-FECh、11C-膽堿、18F-FDG microPET腫瘤顯像組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)18F-FECh、11C-膽堿瘤/肝比和瘤/肌比平穩(wěn)，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而18F-FDG比值隨時(shí)間延長而增高，10、20、30 min瘤/肝比依次顯著增加。組間比較顯示不同時(shí)間點(diǎn)18F-FDG瘤/肝比明顯高于18F-FECh、11C-膽堿(P<0.01)，18F-FECh、11C-膽堿之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。20、30 min18F-FDG和18F-FECh瘤/肌比均高于11C-膽堿(P<0.05)，30、45、60 min18F-FDG瘤/肌比高于18F-FECh(P<0.05)，見表1、表2。

圖 1 不同時(shí)間點(diǎn)荷瘤鼠18F-FECh組織攝取

圖 2 不同時(shí)間點(diǎn)荷瘤鼠11C-膽堿組織攝取

表 1 荷瘤鼠18F-FECh、11C-膽堿、18F-FDG microPET顯像瘤/肝比

表 2 荷瘤鼠18F-FECh、11C-膽堿、18F-FDG microPET顯像瘤/肌比

3 討 論

PET在腫瘤的診斷、分期、療效評(píng)價(jià)和腫瘤復(fù)發(fā)檢測(cè)中起了重要作用[4-5]，但18F-FDG PET顯像對(duì)HCC的診斷敏感性僅為40%～60%，主要是因?yàn)椴煌谥?、低分化HCC葡萄糖-6-磷酸酶含量較低、己糖激酶含量較高出現(xiàn)18F-FDG高濃聚而易被檢測(cè)，高分化HCC葡萄糖-6-磷酸酶含量較高(與正常肝組織相似)，葡萄糖-6-磷酸酶可將 6-磷酸-FDG去磷酸化，使18F-FDG通過細(xì)胞膜從腫瘤細(xì)胞清除而無法形成18F-FDG濃聚，出現(xiàn)假陰性結(jié)果，難以檢出高分化HCC。因此孤立性肝病變18F-FDG PET/CT顯像陰性時(shí)不能排外HCC，限制了18F-FDG PET在肝癌病灶診斷中的價(jià)值[6]。希望借助于其他的生物學(xué)分布良好的顯像劑來彌補(bǔ)18F-FDG PET/CT對(duì)高分化HCC檢出的低敏感性。磷脂酰膽堿(即卵磷脂)是細(xì)胞膜的重要成分，也參與細(xì)胞的分子識(shí)別和信息傳遞。細(xì)胞在分裂、增殖過程中需要大量膽堿作為前體經(jīng)過CDP膽堿途徑合成磷脂酰膽堿，惡性腫瘤細(xì)胞增殖增多，對(duì)磷脂的需求增多，CDP途徑上調(diào)，對(duì)膽堿的攝取增多[6-7]，因此本文探討核素標(biāo)記膽堿類顯像劑18F-FECh、11C-膽堿在荷肝癌裸鼠活體生物學(xué)分布以及在HCC顯像診斷的價(jià)值。

本研究結(jié)果表明膽堿生物分布與18F-FDG有差異，腦組織和心臟的膽堿攝取較低。18F-FECh與11C-膽堿活體生物分布相似，腎和肝是膽堿代謝、排泄的主要器官，對(duì)膽堿攝取程度高。早期(20 min之內(nèi))18F-FECh經(jīng)腎排泄較快，20 min之后大多數(shù)含顯像劑的尿液到達(dá)膀胱而腎顯像劑分布較穩(wěn)定，而11C-膽堿放射性活度持續(xù)降低，這可能是早期11C-膽堿經(jīng)尿液排泄，以及在后期(20 min后)11C-膽堿轉(zhuǎn)變?yōu)?1C-三甲銨乙內(nèi)酯進(jìn)一步隨尿液排泄清除有關(guān)，這結(jié)果與Roivainen等[7]的研究一致，發(fā)現(xiàn)注射11C-膽堿5 min之后，動(dòng)脈血漿之中大多數(shù)11C是以11C-三甲銨乙內(nèi)酯的形式存在，而18F-氟代膽堿沒有相似的氧化代謝途徑，20 min之后腎顯像劑清除變慢[7-8]。除了腎、肝，其他正常組織顯像劑攝取程度較低，這與DeGrado等[9]在前列腺癌荷瘤鼠中的研究發(fā)現(xiàn)一致，提示18F-FECh與11C-膽堿在非靶組織的攝取低，生物學(xué)分布良好。

60 min之內(nèi)18F-FDG的瘤/肝比和瘤/肌比隨時(shí)間延長而增高，10、20、30 min18F-FDG瘤/肝比依次顯著增高，且組間比較顯示60 min內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)18F-FDG瘤/肝比、20～60 min時(shí)間點(diǎn)18F-FDG瘤/肌比明顯高于18F-FECh和11C-膽堿，提示了其在腫瘤顯像中敏感性高，能清晰地顯示腋下腫瘤。

不同時(shí)間點(diǎn)18F-FECh、11C-膽堿瘤/肝比和瘤/肌比平穩(wěn)，同樣的Kolthammer等[10]在HCC土撥鼠模型的18F-FECh和11C-膽堿50 min動(dòng)態(tài)掃描研究中，發(fā)現(xiàn)注射后10 min腫瘤/本底比達(dá)到平臺(tái)期，說明了18F-FECh、11C-膽堿PET顯像能穩(wěn)定地顯示腫瘤，可用于HCC識(shí)別。而且Kwee等[11]進(jìn)行了18F-氟代膽堿PET/CT顯像檢測(cè)HCC膽堿代謝與其脂質(zhì)組成的影像-病理相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)HCC腫瘤含有高度飽和磷脂酰膽堿，18F-氟代膽堿顯像能識(shí)別這些腫瘤，對(duì)HCC的診斷敏感性達(dá)到84%，因此核素標(biāo)記膽堿類顯像劑能對(duì)CDP途徑起始階段的膽堿代謝進(jìn)行分子顯像，從而診斷HCC。

同為膽堿類顯像劑，可能是因?yàn)镕ECh與膽堿不是同一個(gè)分子，在代謝過程中，膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)兩者的轉(zhuǎn)運(yùn)效率、細(xì)胞酶如膽堿激酶和膽堿磷酸胞苷酰基轉(zhuǎn)移酶等對(duì)兩者的綁定親和力存在差異[8]，5、10、20、30 min18F-FECh瘤/肝比與11C-膽堿無顯著差異，但在20、30 min18F-FECh瘤/肌比顯著高于11C-膽堿，提示了腫瘤中18F-FECh的攝取更多，更容易觀察腫瘤，加上11C-膽堿的半衰期短難以在臨床廣泛應(yīng)用而18F的半衰期較長，因此我們可以選用18F-FECh替代11C-膽堿進(jìn)行腫瘤顯像，提高診斷靈敏度。在Aujay 等[12]的臨床研究中，9例HCC患者治療前所有癌灶18F-膽堿攝取明顯增高，清晰地顯示腫瘤，最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值(maximum standard uptake value，SUVmax)為7.3～25.9，并能預(yù)測(cè)經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈放療栓塞術(shù) (Transarterial radioembolization, TARE) 治療的療效。Wallace 等[13]的研究中，接受局部治療的29例早期HCC患者(共39個(gè)HCC病變)行18F-氟膽堿PET/CT顯像，與SUVmax>13患者相比，基線時(shí)間病變SUVmax<13患者中位無進(jìn)展生存期更長；與基線和治療后SUVmax下降小于45%患者相比，SUVmax下降>45%患者平均無進(jìn)展生存期更長(36.1個(gè)月vs11.6個(gè)月，P=0.034)。本文及相關(guān)臨床研究提示了18F-膽堿顯像在HCC診斷、療效評(píng)價(jià)、預(yù)后預(yù)測(cè)中的潛在價(jià)值。

因此，我們可選用18F-FECh替代11C-膽堿作為18F-FDG的補(bǔ)充，形成18F-FDG和18F-FECh雙探針PET/CT顯像模式，提高肝細(xì)胞癌和轉(zhuǎn)移灶的檢出和診斷準(zhǔn)確性，并可進(jìn)一步分析腫瘤不同分化程度、不同病理類型在雙探針模式下的不同表型，更好地探討個(gè)體腫瘤的生物學(xué)特征，以利于更好地進(jìn)行療效評(píng)價(jià)、預(yù)后預(yù)測(cè)。