宿主細胞轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子2 對EIAV 復制影響的初步研究

馬官芹，王 巖，林躍智，王曉鈞

（中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/馬傳染病和慢病毒病研究創(chuàng)新團隊，黑龍江 哈爾濱 150069）

轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）屬于CNC（Cap-ncollar）轉(zhuǎn)錄因子家族成員，是細胞重要的抗氧化因子。阻滯Nrf2 的激活則會加重機體的氧化應激狀態(tài)，Nrf2 的激活依賴其負調(diào)控因子胞漿蛋白kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）。Nrf2 和Keap1 形成復合物以其非活性狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中，并通過Keap1 介導的泛素化持續(xù)降解Nrf2，以保持生理狀態(tài)下Nrf2 的低水平狀態(tài)[1]。當發(fā)生氧化應激時，機體會通過多種方式誘導或促進Nrf2 和Keap1 的解離，導致Keap1 對Nrf2 的泛素化減弱，Nrf2 蛋白則會發(fā)生細胞質(zhì)到細胞核的移位和磷酸化，啟動下游抗氧化反應元件（ARE）靶基因的表達，調(diào)控Ⅱ相代謝酶（GST、NQO1 等）、抗氧化酶（SOD、HO-1 過氧化物酶-1 等）的轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮其抗氧化損傷作用[2]。

宿主細胞Keap1-Nrf2-ARE 通路不僅在病毒感染中起重要作用，其調(diào)控病毒在機體內(nèi)復制的機制也很復雜[3]。病毒對該通路具有雙向調(diào)控作用：一方面病毒要利用感染造成的氧化應激環(huán)境復制，因此要抑制Nrf2-ARE 抗氧化通路的激活。如呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）可通過蛋白酶體途徑誘導Nrf2 的去乙酰化和泛素化[4]，牛皰疹病毒1 型（Bovine herpesvirus 1，BoHV-1）可促進Nrf2 的降解和抑制Nrf2 的乙?；瑥亩种芅rf2 的激活[5]；另一方面持續(xù)性的氧化應激會致宿主細胞的損傷，已證實有多種病毒需要通過激活Nrf2-ARE 通路來調(diào)控氧化與抗氧化的平衡。如人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiencyvirus，HIV-1）通過gp120 和Tat誘導星形膠質(zhì)細胞中Nrf2-ARE 的激活[6]，乙型肝炎病毒（Hepatitis B，HBV）也可通過編碼HBx 和膜蛋白LHB 激活該通路[7]。總之，病毒已演化出多種調(diào)控Nrf2-ARE 通路的途徑和方式來“綁架”宿主的抗氧化進程，以便利于自身的復制。

近年來，CRISPR/Cas9 技術(shù)由于具有操作簡便，實驗周期短等優(yōu)勢在基因組編輯以及治療癌癥、感染和遺傳疾病方面顯示出巨大潛力。Cas9 和sgRNA是CRISPR/Cas9 系統(tǒng)基因組編輯的重要組成部分：sgRNA 負責定位，Cas9 參與靶位點DNA 的切割。靶位點的識別需要前間隔序列鄰近基序（PAM），因此任何含有NGG 基序的DNA 序列均可被識別為靶位點，從而可快速實現(xiàn)對靶基因的敲除、敲入及修飾等?；诖?，本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建Nrf2基因敲除的HEK293T 細胞系，利用該細胞初步研究了Nrf2 對EIAV 的抗病毒效果，為進一步研究和闡明Nrf2 調(diào)控病毒復制的機制研究提供有效工具。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料人胚胎腎細胞（HEK293T）由本實驗室購買并保存；EIAV 假病毒包裝質(zhì)粒（VSVG、Pony8.1、UKgp）、EIAV 感染性克隆（CMV3-8）、pVR1012-flag-Nrf2 表達載體均由本實驗室構(gòu)建并保存；ExTaqDNA 聚合酶購自Toyobo 公司；限制性內(nèi)切酶BsmB I 購自Thermo Fisher Scientific 公司；Lenti-CRISPRv2-GFP 載體購自Addgene 公司；RNA 提取試劑盒購自Bio Flux 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、DNA 小提試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；TRIzol 試劑購自Invitrogen 公司；CCK-8 細胞活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細胞裂解液、5×蛋白上樣緩沖液由本實驗室制備；蛋白Marker 購自Thermo Fisher Scientific 公司；DNA 轉(zhuǎn)染試劑PolyjetTM購自Sigma Gen Laboratories 公司；Pen Strep（雙抗）購自Gibco 公司；鼠源Nrf2 單克隆抗體（MAb）、EIAV 核蛋白（p26）MAb 由本實驗室制備并純化；兔源Flag標簽抗體、兔源actin 標簽抗體、鼠源actin 標簽抗體、紅外熒光標記羊抗兔IgG（IgG-Dylight700）、紅外熒光標記羊抗鼠IgG（IgG-Dylight800）、Reverse Transcriptase Assay 試劑均購自Sigma 公司；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）有限公司。實驗中所涉及的引物和測序均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 sgRNA 的設(shè)計根據(jù)GenBank 登錄的Nrf2 基因序列（S74017.1），利用張鋒實驗室網(wǎng)站（http://crispr.mit.edu/）靶向Nrf2 基因設(shè)計特異性sgRNA，依照sgRNA 的設(shè)計原則，選擇評分較高的2 組序列作為sgRNA（圖1）。

圖1 Nrf2基因敲除sgRNA的設(shè)計Fig.1 Design strategy of sgRNA for Nrf2 knockout

1.3 LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA 質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定利用設(shè)計的特異性sgRNA（表1），通過程序性退火將兩對sgRNA 分別合成雙鏈DNA（98 ℃30 min，95 ℃5 min）后，利用T4 連接酶將該雙鏈DNA 在室溫連接至經(jīng)BsmB I 線性化的載體LentiCRISPRv2-GFP 中，構(gòu)建重組質(zhì)粒LentiCRISPRv2-GFP-sgRNAN1 和LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N2，并分別經(jīng)測序鑒定后用于敲除細胞系的構(gòu)建。

表1 靶向Nrf2基因的sgRNA序列Table 1 The sequence of sgRNA targeting Nrf2 gene

1.4 不同sgRNA 沉默Nrf2 基因效率的檢測將生長狀態(tài)良好的HEK293T 細胞鋪至6 孔板內(nèi)，待細胞密度達到80%時，分4 個組利用PolyjetTM轉(zhuǎn)染以下質(zhì)粒：pVR1012-flag-Nrf2+LentiCRISPRv2-GFP（陰性對照）、pVR1012-flag-Nrf2+LentiCRISPRv2-GFP-sgRNAN1、pVR1012-flag-Nrf2+LentiCRISPRv2-GFP-sgRNAN2 和pVR1012-flag-Nrf2+LentiCRISPRv2-GFP-sgRNAN1+LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N2。轉(zhuǎn)染24 h 后棄去培養(yǎng)液，PBS 清洗后，每孔加入200 μL 細胞裂解液，10 min 后12 000 r/min 離心5 min，取120 μL 上清加入30 μL 預熱的5×loading buffer，98 ℃10 min 后經(jīng)SDS-PAGE 后。分別以兔源Flag 抗體（1∶5 000）和兔源actin 抗體（1∶10 000）作為一抗，以紅外熒光標記羊抗兔IgG（1∶10 000）作為二抗經(jīng)western blot 檢測，并利用Image Studio 軟件進行蛋白灰度分析，篩選出沉默Nrf2 基因效率最高的sgRNA。

1.5 Nrf2 基因敲除的HEK293T 細胞系的制備、篩選及鑒定將生長狀態(tài)良好的HEK293T 細胞鋪至6孔板內(nèi)，待細胞密度達到80%時，利用PolyjetTM試劑轉(zhuǎn)染沉默Nrf2 基因效率最高的LentiCRISPRv2-GFPsgRNA-N1 質(zhì)粒2 μg，24 h 后收獲細胞，利用超速流式分選系統(tǒng)分選出表達GFP 的單一細胞于96 孔板中培養(yǎng)10 d 左右，在顯微鏡下挑選由單個細胞長成的細胞集落，將其轉(zhuǎn)移至6 孔板內(nèi)擴大培養(yǎng)。待6 孔板中細胞密度約為80%時，收集細胞，一部分加入細胞裂解液，提取細胞總蛋白（同1.4）后分別利用鼠源Nrf2 MAb（1∶2 000）和兔源actin 抗體（1∶10 000）作為一抗，紅外熒光標記羊抗鼠IgG（1∶10 000）、紅外熒光標記羊抗兔IgG（1∶10 000）作為二抗經(jīng)western blot 檢測蛋白敲除情況，利用近紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（Odyssey CLX）結(jié)合Image Studio 軟件進行蛋白灰度分析。

采用TRIzol 法提取另一部分細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，依據(jù)sgRNA 所對應的Nrf2 基因序列位點，設(shè)計引物（5′-ATGCAGCCAGATCCCAGGCCTA GCGGGGCT- 3′/5′- ACAGGTACAGTTCTGCTGGTCAAT CTGCTT-3′）經(jīng)PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定。

1.6 敲除Nrf2 基因后細胞的遺傳穩(wěn)定性檢測將經(jīng)上述方法鑒定為Nrf2 基因敲除的單克隆細胞株（HEK293T-Nrf2KO）傳代培養(yǎng)至第10 代（G10）、15 代（G15）、20 代（G20）時分別收取細胞，采用1.5 中的western blot 方法鑒定Nrf2 的表達；按照1×104個/孔分別將HEK293T 和HEK293T-Nrf2KO細胞鋪至96 孔板內(nèi)，設(shè)置3 個復孔，待細胞密度達到80%時，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，混勻后37 ℃培養(yǎng)1 h，使用酶標儀讀取OD450nm處的吸光值，分析Nrf2 敲除后對細胞活力是否產(chǎn)生影響。

1.7 敲除Nrf2 基因?qū)IAV 復制影響的檢測將生長狀態(tài)良好的HEK293T 和HEK293T-Nrf2KO細胞鋪至6 孔板，參照1.5 的方法分別將EIAV 的感染性克隆CMV3-8及Nrf2 基因回補的感染性克?。–MV3-8+pVR1012-flag-Nrf2）轉(zhuǎn)染至HEK293T-Nrf2KO細胞中，設(shè)CMV3-8轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞作為對照。轉(zhuǎn)染24 h后收獲上清和細胞，分別利用鼠源Nrf2 MAb（1∶2 000）、EIAV 核蛋白（p26）抗體（1∶5 000）、兔源actin 抗體（1∶10 000）以及兔源Flag 抗體（1∶5 000）作為一抗，分別以紅外熒光標記的羊抗鼠IgG（1∶10 000）、紅外熒光標記的羊抗兔IgG（1∶10 000）作為二抗對上清和細胞中的病毒蛋白經(jīng)western blot 檢測，并對蛋白表達結(jié)果經(jīng)灰度分析EIAV 的復制情況。

1.8 敲除Nrf2 基因后細胞上清中病毒的反轉(zhuǎn)錄酶試驗（Reverse transcriptase assay，RT）將1.7 中收獲的細胞上清各取100 μL 原液、10 倍、20 倍和40 倍稀釋液分別與50 μL PEG 8000 混勻，冰浴8 h 后4 ℃，8 000 r/min 離心10 min，棄上清，用40 μL 病毒裂解緩沖液重懸，室溫孵育30 min。按照表2 稀釋標準品（試劑盒中附帶），在重懸的病毒團塊和稀釋好的標準品中分別加入20 μL 反轉(zhuǎn)錄反應混合液（試劑盒中附帶），37 ℃孵育1 h。將反轉(zhuǎn)錄反應后的樣品加入MP 孔（試劑盒中附帶）中，另設(shè)置60 μL PBS 對照，37 ℃孵育1 h。棄去反應液，用wash buffer 洗滌3 次，每孔加入200 μL地高辛過氧化物酶抗體，37 ℃孵育1 h。棄去反應液，用wash buffer 洗滌3 次，每孔加入200 μL 顯色底物，室溫孵育5 min～10 min，至出現(xiàn)肉眼可見的綠色。讀取OD405nm值，根據(jù)標準品的吸光值做出標準曲線，根據(jù)標準曲線計算出樣品值，以分析培養(yǎng)液上清中病毒粒子的含量。

表2 標準品的稀釋Table 2 Standard diluent

1.9 EIAV 假病毒感染敲除Nrf2 的細胞后病毒復制水平的檢測將包裝EIAV 假病毒所需要的質(zhì)粒UKgp、Pony8.1、VSV-G 按照3∶3∶1 的比例共轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞，48 h 收獲含有病毒的上清液。將生長狀態(tài)良好的HEK293T 和HEK293T-Nrf2KO細胞分別鋪至24 孔板內(nèi)，設(shè)置3 個復孔，待細胞生長密度達到80%時，加入100 μL 假病毒上清液，24 h 后棄去上清，每孔加100 μL 細胞裂解液，利用微孔板化學發(fā)光檢測儀檢測病毒液螢火蟲熒光素酶的活性值，分析EIAV 假病毒在細胞中的復制水平。

2 結(jié) 果

2.1 LentiCRISPRv2-sgRNA 基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定結(jié)果將sgRNA-N1 和sgRNA-N2 分別退火獲得雙鏈DNA，克隆至LentiCRISPRv2-GFP載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N1 和LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N2，經(jīng)測序分析結(jié)果顯示，可檢測到正確的sgRNA序列，表明重組質(zhì)粒正確構(gòu)建。

2.2 不同sgRNA 沉默Nrf2 基因效率的檢測結(jié)果將構(gòu)建的兩個LentiCRISPRv2-GFP-sgRNAs 分別與表達Nrf2 的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞，western blot 檢測Nrf2 的表達并進行蛋白灰度值分析。結(jié)果顯示，與對照組相比，LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N1 和LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N2 以及LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N1+LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N2 均能顯著下調(diào)Nrf2 的表達（P＜0.01）（圖2A、圖2B），表明設(shè)計的sgRNA均具有較高的沉默效率，本研究選擇LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N1質(zhì)粒用于后續(xù)實驗。

圖2 sgRNA敲除Nrf2基因的western blot檢測（A）和灰度值分析（B）Fig.2 Western blot detection(A)and gray value analysis(B)of sgRNA knockout Nrf2 gene

2.3 Nrf2 基因敲除的HEK293T 細胞系的構(gòu)建與篩選將LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N1 轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，通過流式細胞儀和有限稀釋法篩選表達GFP的單細胞克隆。經(jīng)過10 d 培養(yǎng)，將單克隆細胞長成的細胞集落經(jīng)western blot 鑒定。結(jié)果顯示，N2 和N4 2 株單細胞克隆株未檢測到Nrf2 的內(nèi)源性表達（圖3A）。隨后提取2 株細胞總RNA，PCR 擴增后測序鑒定，結(jié)果顯示，Nrf2基因敲除的細胞基因組缺失一個堿基T，導致Nrf2 基因發(fā)生移碼突變無法表達（圖3B）。表明獲得了Nrf2基因敲除的HEK293T 細胞。

圖3 HEK293T-Nrf2KO細胞中Nrf2基因表達的western blot（A）和測序（B）鑒定結(jié)果Fig.3 Western blot(A)and sequencing(B)identification of Nrf2 gene expression in HEK293T-Nrf2KO cells

2.4 敲除Nrf2 基因后細胞的遺傳穩(wěn)定性檢測結(jié)果將獲得的HEK293T-Nrf2KO細胞傳代，并隨機選取G10、G15、G20 代次的細胞經(jīng)western blot 檢測Nrf2的表達。結(jié)果顯示，3 個代次細胞中均未檢測到內(nèi)源性Nrf2 的表達（圖4A、圖4B）。利用CCK-8 試劑盒檢測HEK293T-Nrf2KO細胞的活性，結(jié)果顯示，該細胞與HEK293T 具有相似的生長活性，即Nrf2 基因的敲除未對細胞活性產(chǎn)生影響（圖4C）。以上結(jié)果表明獲得了Nrf2 基因敲除的穩(wěn)定細胞系。

圖4 Nrf2基因敲除細胞系的遺傳穩(wěn)定性的western blot（A）及其灰度值分析（B）和CCK-8法檢測細胞的活性（C）Fig.4 Genetic stability of Nrf2 knockout cell lines by western blot(A)and its gray value analysis(B)and CCK-8 assay for cell activity(C)

2.5 敲除Nrf2 基因?qū)IAV 增殖影響的檢測結(jié)果為了研究所獲得的Nrf2 敲除細胞系是否影響EIAV的復制，將EIAV 的感染性克隆CMV3-8及Nrf2 基因回補的感染性克隆（CMV3-8+pVR1012-flag-Nrf2）分別轉(zhuǎn)染至HEK293T-Nrf2KO細胞中，并設(shè)置轉(zhuǎn)染CMV3-8的HEK293T 細胞作為對照。通過western blot 檢測各組細胞中病毒蛋白Gag（剪切體為p55、p26，p26 可分泌至細胞外）和上清中病毒蛋白（p26）的表達水平。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染CMV3-8的HEK293T 細胞相比，轉(zhuǎn)染CMV3-8的HEK293T-Nrf2KO細胞與上清中病毒蛋白Gag 的表達量均上調(diào)約1.5 倍，而轉(zhuǎn)染CMV3-8+pVR1012-flag-Nrf2 的HEK293T-Nrf2KO細胞與上清中病毒蛋白Gag 的表達量均下調(diào)約50%（圖5A、圖5B），可見敲除Nrf2 基因促進了細胞和上清中Gag 蛋白的表達（本實驗室制備的p26抗體可同時檢測到Gag兩個剪切體p55、p26）。表明Nrf2 基因可以抑制EIAV 在HEK293T細胞中的表達。

圖5 敲除Nrf2對EIAV增殖影響的western blot檢測結(jié)果（A）及其灰度值分析（B）Fig.5 Detection results of the effect of Nrf2 knockout on EIAV proliferation(A)and analysis of its grayscale values(B)

2.6 敲除Nrf2 基因后細胞上清中病毒的RT 結(jié)果將收獲的上述各組細胞上清各取原液及不同倍數(shù)的稀釋液分別與50 μL PEG8000 混勻、離心、裂解后，利用RT檢測其中病毒反轉(zhuǎn)錄酶的含量，以分析各組培養(yǎng)液上清中病毒粒子的含量。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染CMV3-8的HEK293T細胞相比，轉(zhuǎn)染CMV3-8的HEK293T-Nrf2KO細胞上清中病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的含量上調(diào)約1.5倍，而轉(zhuǎn)染CMV3-8+pVR1012-flag-Nrf2 的HEK293T-Nrf2KO細胞上清中的病毒逆轉(zhuǎn)錄酶含量下調(diào)約50%（圖6）。再次證明Nrf2 基因具有抑制EIAV 復制的作用。

圖6 敲除Nrf2基因后細胞中病毒復制能力的檢測結(jié)果Fig.6 Detection of viral replication capacity in cells after knockout of Nrf2

2.7 EIAV假病毒感染Nrf2基因敲除細胞后的病毒復制水平的檢測結(jié)果為進一步探究Nrf2 調(diào)控EIAV 復制的分子機制，本研究利用重組質(zhì)粒UKgp、Pony8.1、VSV-G 共轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞制備EIAV 假病毒，將其分別感染HEK293T 和HEK293T-Nrf2KO細胞，24 h 后裂解細胞通過檢測螢火蟲熒光素酶的活性，評價該假病毒在細胞內(nèi)的復制水平。結(jié)果顯示，假病毒感染的HEK293T-Nrf2KO細胞上清中熒光素酶的活性與其轉(zhuǎn)染的HEK293T 細胞相比上調(diào)約2.5 倍（P＜0.01）（圖7），進一步表明Nrf2 抑制了EIAV 在HEK293T 細胞中的復制。

圖7 EIAV假病毒感染敲除Nrf2細胞后的病毒復制水平檢測結(jié)果Fig.7 Detection of viral replication levels after Nrf2 knockout cells infection with EIAV pseudovirus

3 討 論

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)應用最廣泛，且具有設(shè)計簡單、易于使用和多路復用（能夠同時編輯多個基因）的優(yōu)點，同時，它還能夠有效地修飾各物種和不同細胞類型的內(nèi)源性基因[8-9]。另外，帶有轉(zhuǎn)錄抑制因子或激活因子的改良CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以強有力的轉(zhuǎn)錄抑制或激活靶基因[10]。但在長期的應用中發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9 技術(shù)經(jīng)常發(fā)生脫靶的問題[11]，所以本研究在進行CRISPR/Cas9 試驗時，利用NCBI 檢索了Nrf2 全基因，之后利用張峰實驗室網(wǎng)站靶向Nrf2第一和第二外顯子分別設(shè)計了sgRNA。試驗結(jié)果表明，本研究所設(shè)計的兩條sgRNA的切割效率均高效。

Nrf2-ARE 作為宿主抗氧化防御的核心途徑，在調(diào)控宿主的抗氧化損傷過程中發(fā)揮重要作用，并參與腫瘤、凋亡、自噬和炎癥等多種病理過程的調(diào)控。目前，主要研究的是Nrf2的抗病毒功能，而對其抗病毒機制研究的較少。本研究利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，設(shè)計了2 條靶向Nrf2 的sgRNAs，將sgRNAs 插入LentiCRISPRv2-GFP 載體，獲得Nrf2 基因敲除的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞，通過流式篩選和無限稀釋的方法獲得Nrf2 基因敲除的HEK293T 細胞系HEK293T-Nrf2KO細胞，通過多次傳代并鑒定后確定該細胞系可穩(wěn)定遺傳。本研究將EIAV 的感染性克隆CMV3-8，及EIAV 的假病毒分別感染該細胞系，通過western blot、RT及熒光素酶活性檢測表明Nrf2蛋白能夠抑制EIAV在細胞內(nèi)的復制。

Nrf2-ARE 是宿主細胞抗氧化防御體系的第一道防線，是其對抗病毒感染引起氧化應激最重要的防御系統(tǒng)。許多具有抗氧化防御功能的蛋白質(zhì)，都依賴于Nrf2 通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Nrf2-ARE 通路對宿主細胞氧化還原平衡的維持、氧化應激致細胞損傷的預防及炎癥平衡的調(diào)節(jié)機制是復雜多樣的。而機體內(nèi)氧化/抗氧化這一平衡的移動方向直接關(guān)系到病毒所致疾病的發(fā)展方向。因此，對病毒和宿主Nrf2 通路調(diào)控機制的深入認知，明確如何調(diào)控抗氧化途徑治療病毒性疾病，成為氧化應激相關(guān)疾?。ú《拘约膊　┌Y、心血管系統(tǒng)疾病和炎癥等）預防和治療的熱點。本研究團隊還利用該細胞系檢測了敲除Nrf2 基因?qū)︸R流感病毒復制的影響，獲得的結(jié)果與本研究結(jié)果一致（數(shù)據(jù)未顯示），推測Nrf2 對病毒在細胞中復制的抑制作用可能具有普遍性。本研究構(gòu)建的HEK293T-Nrf2KO細胞系可為Nrf2 基因的抗病毒機制研究提供重要的技術(shù)平臺，也可為Nrf2-ARE 通路調(diào)控病毒機制的研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。