基于近紅外光譜技術(shù)建立濕加松針葉黃芪苷含量的預(yù)測模型*

彭冠明 呂欣欣 毛積鵬, 歐惠玲謝 諾 李福明

（1. 臺山市紅嶺種子園，廣東 臺山529223；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院/廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室，廣東 廣州 510642）

《本草綱目》中有關(guān)于松針入藥的記載“細(xì)切，以水及面飲服之，或搗屑丸服，可斷谷及治惡疾”。通過現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，松針中含有包括揮發(fā)油、色素及維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)類、黃酮類、莽草酸、可溶性糖類、木質(zhì)素等多種化學(xué)成分[1]，其中黃酮類化合物具有降血糖[2]、調(diào)血脂[3]、抗氧化[4]、抑菌[5]、消炎[6-7]等作用。隨著生活水平的提高，導(dǎo)致現(xiàn)實生活中人們被各種疾病所困擾，對具有保健功能的純天然綠色保健品需求也越來越大，作為松樹的主要副產(chǎn)品之一，松針在保健品中的應(yīng)用前景非常廣闊。黃芪苷是松針中多種黃酮類化合物，是多種中藥材的重要有效成分之一[8]，主要的提取方法是通過溶劑提取法[9]。隨著提取工藝的不斷改進(jìn)，超聲波輔助提取法、減壓內(nèi)部沸騰法等方法被應(yīng)用于松針黃酮類化合物的提取過程中，結(jié)果表明可以提高松針黃酮的得率[10-11]。

傳統(tǒng)的植物黃酮類化合物含量測定需要借助于高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）、紫外分光光度計法等，然而這些提取方法都有一定的局限性，如需要用到具有污染性的化學(xué)試劑、成本高、耗時長且對受測樣品造成了一定的損壞。近紅外光譜分析技術(shù)是一項綠色環(huán)保的分析技術(shù)，具有速度快、成本低、易操作等特點，在農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域的研究和應(yīng)用十分廣泛[12-13]，例如紫花苜蓿Medicago sativa品質(zhì)的評價[14]，桔梗中總皂苷的快速檢測[15]，食用產(chǎn)品瑪咖粉的真假鑒定[16]等。近紅外光譜技術(shù)在植物有效成分含量的預(yù)測方面有大量的成功案例，如朱斌等[17]利用近紅外光譜分析技術(shù)建立了能夠定量測定金絲桃Hypericum monogynum藥材中的金絲桃苷與貫葉金絲桃素的近紅外預(yù)測模型；黃倩倩等[18]采用偏最小二乘算法建立了近紅外漫反射光譜技術(shù)快速測定中藥黃芩Scutellaria baicalensis中主要活性成分黃芩苷和總黃酮含量的方法。

濕加松Pinus elliottii×P. oaribaea是松科松屬的常綠喬木，是濕地松與加勒比松的雜交后代，又稱雜種松、雜交松，它綜合了其雙親干型通直、生長迅速、適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)脂量高等優(yōu)點，濕加松還是世界上發(fā)達(dá)國家商品林基地的主要樹種之一[19-20]。本研究旨在建立一種能夠快速預(yù)測濕加松針葉中黃芪苷成分含量的近紅外模型，以期為濕加松針葉黃酮類成分含量的測定提供更加快捷有效的方法，為高黃酮類含量的濕加松選育工作提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以種植于廣東省臺山市紅嶺種子園的6 a 生濕加松子代測定林為研究材料，于2019 年8 月分別隨機(jī)采取了112 個生長旺盛且無病蟲害單株的當(dāng)年生松針組織部位鮮樣約100 g。75 ℃條件下烘72 h，充分粉碎后過60 目篩，得112 份濕加松松針粉末樣本。隨機(jī)選擇其中94 份樣本作為預(yù)測集，其余18 份樣本作為外部驗證集。

1.2 樣本制備與標(biāo)準(zhǔn)品配制

各樣本分別稱取100 mg 于10 mL EP 管中，隨后加入5 mL 甲醇溶液，充分混勻后在室溫下超聲60 min，4 ℃條件下，120 00 rpm 離心12 min。取上清液濃縮至干后加200 μL 甲醇復(fù)溶，混勻后取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，濾液保存于進(jìn)樣瓶中用于LS-MS 分析。稱取黃芪苷的標(biāo)準(zhǔn)品適量，并與80%的甲醇溶液混合制成母液。量取適量母液，用80%甲醇稀釋至合適濃度，制成工作標(biāo)準(zhǔn)液置于-80 ℃待LC-MS 分析。

1.3 色譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集

色 譜 條 件：ACQU ITY UPLC?BEH C18 色譜 柱（2.1×100 mm，1.7 μm， 美 國Waters 公司），進(jìn)樣量5 μL，柱溫40 ℃，流動相A 為0.1%甲酸，流動相B 為甲醇，流速設(shè)置為0.25 mL/min。梯度洗脫條件為0～1 min，10% B；1～3 min，10%～33% B；3～10 min，33% B；10～15 min，33%～50% B；15～20 min，50%～90% B；20～21 min，90% B；21～22 min，90%～10% B；22～25 min，10% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離（ESI）源，負(fù)離子電離模式。離子源溫度500 ℃, 離子源電壓4 500 V，碰撞氣6 psi，氣簾氣30 psi，霧化氣和輔助氣均為50 psi。采用多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）進(jìn)行掃描。

1.4 近紅外光譜數(shù)據(jù)收集

采用DA7200 近紅外光譜分析儀掃描樣品，收集近紅外光譜數(shù)據(jù)，首先將儀器室溫度控制在22 ℃左右，并將樣本提前于儀器室放置24 h。開機(jī)后預(yù)熱30 min，近紅外光光斑直徑為3.5 cm，近紅外光譜掃描范圍為950～1 650 nm，儀器分辨率為5 nm，光譜采集速度約為100 條光譜/s，掃描次數(shù)為100 次/s。每一個松針粉樣品掃描3 次和重復(fù)裝樣3 次，取其平均近紅外光譜作為樣品的原始光譜。

1.5 近紅外建模方法

通過采用偏最小二乘法回歸（Partial Least Square Regression，PLS）法對近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，能夠?qū)馍⑸浜推渌M分帶來的干擾做出補(bǔ)償，比對逐個因變量做多元回歸更有效。適用于復(fù)雜體系，而且模型比較穩(wěn)定、分析性能和預(yù)測精度更好。因此，本研究采用偏最小二乘法對實驗樣品進(jìn)行近紅外建模。

1.6 模型評價方法

模型的預(yù)測準(zhǔn)確性從兩個方面評價，一方面是相關(guān)系數(shù)，包括校正集相關(guān)系數(shù)（Related coefficient of calibration,Rc）和交互驗證集相關(guān)系數(shù)（Related coefficient ofvalidation,Rv），校正集均方根誤差（Root Mean Square Error of Calibration,RMSEC）和交互驗證集均方根誤差 （Root Mean Square Error of validation, RMSEV）。所建模型應(yīng)具有較高的Rc和Rv，較低的RMSEC 和RMSEV，其中主要以Rv和RMSEV 作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。另一方面，模型應(yīng)該具有較高的相關(guān)系數(shù)，即預(yù)測值與實測值的相關(guān)系數(shù)（Related coefficient,r）和較低的預(yù)測均方根誤差（Root Mean Square Error of prediction, RMSEP）。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2019 和R 3.5.1 軟件對各樣本中黃芪苷含量進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用軟件The Unscrambler 9.7 對近紅外光譜圖進(jìn)行處理和模型建立。

2 結(jié)果與分析

2.1 松針粉黃芪苷實測值的數(shù)據(jù)特征

利用LC-MS 對所有樣本中的黃芪苷進(jìn)行定量檢測，各數(shù)據(jù)集樣本黃芪苷含量的統(tǒng)計結(jié)果如表1 所示。94 個校正集樣本黃芪苷含量的最小值為3.67 μg·g-1，最大值為27.67 μg·g-1，平均值為10.24 μg·g-1，標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.99 μg·g-1。18 個驗證集樣本黃芪苷含量的最小值為4.84 μg·g-1，最大值為17.11 μg·g-1，平均值為10.74 μg·g-1，標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.11 μg·g-1。

表1 濕加松針葉校正集和驗證集樣本黃芪苷含量的基本統(tǒng)計特征Table 1 Descriptive statistics about content of astragalin of calibration set and validation set of P. elliottii × P. caribaea needles

2.2 不同光譜預(yù)處理方法的比較

本研究比較了歸一化（Normalization）、多元散射校正（Multiplicative Scattering Correction，MSC）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量轉(zhuǎn)換法( Standard Normal Variate Transformation，SNV)、 一 階 導(dǎo) 數(shù)（First Deviation，F(xiàn)D）、濾波擬合（Savitzky golay，SG)以及FD+SG 與FD+SNV 共7 種光譜預(yù)處理方法。并以校正集相關(guān)系數(shù)、校正集均方根誤差、交互驗證集相關(guān)系數(shù)及交互驗證集均方根誤差為評價指標(biāo)，其中Rc在4 個參數(shù)中起著主導(dǎo)作用，Rc和Rv越 大 越 好，RMSEC 和RMSEV 越 小 越 好[21]。從表2 可以看出，SNV、SG、FD+SG 預(yù)處理下中的Rc都小于0.8，偏低；在Rc高于0.8 的4 個預(yù)處理方法中，F(xiàn)D+SNV 的Rc 值最大，RMSEC 和RMSEV 均為最小，模型最好。

表2 不同光譜預(yù)處理方法下濕加松針葉黃芪苷含量預(yù)測模型的參數(shù)比較Table 2 Comparison of parameters of content of astragalin prediction model in P. elliottii × P. caribaea needles under different spectral pretreatment methods

對比無預(yù)處理光譜圖（圖1），經(jīng)過FD+SNV預(yù)處理的光譜圖中（圖2），光譜分布更加集中，吸收峰更加明顯。這表明，經(jīng)過預(yù)處理后，近紅外光譜數(shù)據(jù)能夠更好的反應(yīng)樣品中成分含量的近紅外吸收特點，對于近紅外預(yù)測模型的建立有更好的優(yōu)化效果。

圖1 94 個濕加松針葉校正集樣品近紅外原始反射光譜Figure 1 Near infrared original reflection spectrum of 94 correction set samples of P. elliottii × P. caribaea needles

圖2 FD+SNV 法處理濕加松松針黃芪苷含量預(yù)測模型近紅外光譜圖Figure 2 Near infrared spectrum of astragaloside content prediction model of wet plus pine needle treated by FD + SNV method

2.3 黃芪苷定量分析模型的建立

將近紅外光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件The Unscrambler 9.7，進(jìn)行光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理和模型建立，采用FD+SNV 預(yù)處理，950～1 650 nm 建模波段，主成分?jǐn)?shù)為6，建模結(jié)果如圖3 所示。Rc=0.808 2，RMSEC=1.931 4，Rv=0.710 9，RMSEV=2.398 8。黃芪苷含量校正集相關(guān)系數(shù)最大，校正集和交互驗證集均方根誤差均最低，說明模型預(yù)測性能較好。

圖3 濕加松黃芪苷含量近紅外預(yù)測模型Figure 3 The near-infrared prediction model of content of astragalin in P. elliottii × P. caribaea

2.4 近紅外模型的外部驗證

為檢驗預(yù)測模型的可靠性，本研究利用所建預(yù)測模型對18 個驗證集樣本的黃芪苷含量進(jìn)行了預(yù)測并與其實際測定值進(jìn)行比較分析（圖4）。結(jié)果表明，驗證集樣本的預(yù)測值與實際測定值之間存在絕對誤差，但最大為6.21，R=0.812 9，RMESP=2.973 8，接近于RMSEC，表明模型預(yù)測效果好，可信度高。

圖4 黃芪苷含量近紅外預(yù)測模型的外部驗證結(jié)果Figure 4 External verification results of near infrared prediction model of astragaloside content

3 討論

本研究基于近紅外光譜技術(shù)的應(yīng)用，結(jié)合偏最小二乘法建立了濕加松松針黃芪苷含量近紅外快速預(yù)測模型，其Rc值為0.808 2，利用外部驗證集來對模型進(jìn)行驗證，得到r=0.812 9。吳憲等[22]根據(jù)尾葉桉拉丁名木材密度光譜特征值建立了尾葉桉木材密度近紅外預(yù)測模型，該模型的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.83，具有較高的檢測精度。本研究與前人的研究結(jié)果相近，說明該模型能夠準(zhǔn)確預(yù)測濕加松針葉黃芪苷的含量。

濕加松的研究多集中在其產(chǎn)脂量的和木材性質(zhì)的提高上，關(guān)于濕加松針葉的生物活性成分含量研究鮮有相關(guān)報道。本研究建立的濕加松針葉黃芪苷含量近紅外快速預(yù)測模型可以用來進(jìn)行濕加松松針黃芪苷含量的快速預(yù)測，在濕加松高活性成分含量的良種選育和利用近紅外光譜技術(shù)預(yù)測植物的活性成分含量工作以及應(yīng)用推廣中起到奠定基礎(chǔ)的作用。但是在本研究中的試驗樣品僅包含于臺山市紅嶺種子園現(xiàn)有濕加松種質(zhì)資源，為了進(jìn)一步擴(kuò)大模型的適用性、提高模型的準(zhǔn)確率，還需要在模型中加入其他分布地的濕加松樣品。