牛種布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)對巨噬細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞凋亡的影響

楊 琴，鄧肖玉，謝珊珊，易繼海，王 勇，張 倩，王 震，陳創(chuàng)夫*

(1.石河子大學動物科技學院，石河子 832000；2.人獸共患傳染性疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心，石河子 832000；3.新疆農(nóng)墾科學院省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，石河子 832000；4.動物疫病防控兵團重點實驗室，石河子 832000)

布魯氏菌病(brucellosis)是一種由布魯氏菌(Brucella)感染引起的人獸共患病，是我國重大的公共衛(wèi)生問題之一[1]。布魯氏菌致病機制的關(guān)鍵是它與宿主細胞的相互作用，巨噬細胞作為機體重要的免疫細胞，常常是布魯氏菌入侵的首選對象[2]，布魯氏菌可利用自身的多種機制逃避宿主細胞的識別及殺傷，適應胞內(nèi)環(huán)境并進行生存及復制[3]。布魯氏菌的T4SS是一組由virB啟動子(virB1～virB12)調(diào)控表達的多蛋白復合物，也是布魯氏菌主要的毒力因子，主要通過分泌效應蛋白發(fā)揮毒力作用，協(xié)助布魯氏菌順利到達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，完成胞內(nèi)的入侵及繁殖[4-5]。布魯氏菌侵入宿主細胞后能通過調(diào)控細胞凋亡來影響自身的存活，因此研究布魯氏菌調(diào)控細胞凋亡的具體機制成為越來越多學者關(guān)注的方向。研究表明，羊種布魯氏菌能夠誘導宿主細胞發(fā)生凋亡[6]，最新研究發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌的一種核效應蛋白BspJ能夠發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用[7]。細胞凋亡發(fā)生途徑通常有三條，近年來，經(jīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡途徑愈發(fā)走進學者們的視野[8-9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)加工、折疊及運輸?shù)闹饕獔鏊彩羌毎匾拟}庫，對于細胞穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要[10-11]，同時也是布魯氏菌賴以生存的復制基地，然而，大量研究證實，正是因為布魯氏菌在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的大量復制，常常會導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)失衡，發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[12-13]，若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激強度過強或持續(xù)時間過長，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)無法及時恢復，細胞就會走向凋亡。研究已經(jīng)證實，T4SS效應蛋白VceC以及VceA的缺失能夠影響布魯氏菌調(diào)控的細胞凋亡[14]，且VceC能夠直接參與布魯氏菌對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的調(diào)控[15]。但這些研究只是對布魯氏菌T4SS效應蛋白所調(diào)控的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞凋亡作了闡述，而對于整個T4SS在布魯氏菌誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞凋亡過程中發(fā)揮的作用還不清除。

因此，本研究用牛種布魯氏菌T4SS啟動子缺失株A19ΔVirB侵染小鼠RAW264.7細胞，探究T4SS對牛種布魯氏菌感染引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及細胞凋亡的影響，深入了解T4SS在布魯氏菌胞內(nèi)寄生過程中的作用，為進一步解析布魯氏菌的致病機制及T4SS的功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和細胞 小鼠巨噬細胞系 RAW264.7和牛種布魯氏菌A19疫苗株及其T4SS啟動子缺失株A19ΔVirB[16]為兵團動物疫病防控重點實驗室保存。細胞的培養(yǎng)和侵染方法按文獻[17]進行。

1.1.2 主要試劑及儀器 RNA提取試劑盒和cDNA第一鏈合成試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；兔抗GRP78單克隆抗體、兔抗CHOP單克隆抗體、兔抗BCL-2 單克隆抗體和兔抗BAX單克隆抗體均購自美國CST公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自上海愛必信生物科技有限公司；高通量實時熒光定量PCR儀購自賽默飛世爾科技公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 參照GenBank中公布的GRP78、CHOP、BAX和BCL-2基因的mRNA序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計對應的qRT-PCR引物(引物序列見表1)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2 qRT-PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平 布魯氏菌A19和A19ΔVirB以100∶1的感染復數(shù)侵染RAW264.7細胞[16]，在侵染的6、12和24 h用Trizol裂解細胞，收集的細胞裂解液置于無 RNAase 的EP 管中，按照康為世紀RNA提取試劑盒說明書進行細胞總RNA的提取，取1 μL樣品進行 RNA 濃度和純度的測定；而后繼續(xù)按照康為世紀cDNA 第一鏈合成試劑盒的說明書將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA；最后以 cDNA 為模板，GAPDH為內(nèi)參基因，用實時熒光定量PCR儀進行檢測，qRT-PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；試驗完成后，用2-ΔΔCt法來計算各基因的相對轉(zhuǎn)錄量。

1.2.3 Western blot 檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、凋亡相關(guān)基因的蛋白表達水平 布魯氏菌A19和A19ΔVirB以100∶1的感染復數(shù)侵染RAW264.7細胞，在侵染的6、12和24 h收集細胞，在收集細胞前5 min先在冰上按照比例配制好RIPA和蛋白酶抑制劑混合物，用配制好的混合物在冰上裂解細胞約10 min，而后用細胞刮輕輕將細胞刮下，收集裂解液于無菌EP管中；按照凱基 BCA 蛋白含量檢測試劑盒說明書進行蛋白濃度的測定，并進行蛋白濃度的調(diào)齊；最后進行SDS-PAGE 凝膠電泳，對比蛋白Marker的大小切下目的條帶后轉(zhuǎn)膜，分別孵育GRP78、CHOP、BCL-2和BAX抗體，按照Western blot常規(guī)步驟進行檢測。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況 布魯氏菌A19和A19ΔVirB以100∶1的感染復數(shù)侵染RAW264.7細胞,在侵染的6、12和24 h用不含EDTA的胰酶消化細胞，消化下來的細胞收集到無菌EP管中，800 r·min-1離心5 min，棄上清，用無菌PBS漂洗細胞，離心后棄上清，用Binding buffer將細胞重懸，按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行相應抗體的孵育，立即上機進行檢測。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0軟件進行差異顯著性分析，并用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 牛種布魯氏菌T4SS對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志性分子GRP78和CHOP轉(zhuǎn)錄水平的影響

通過收集感染不同時間點的RAW264.7細胞，提取細胞總RNA，檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志性分子GRP78和CHOP的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，在侵染的6、12和24 h，缺失株A19ΔVirB組GRP78的轉(zhuǎn)錄水平均顯著低于親本株A19組(P<0.05)(圖1A)；在侵染后的6 h，缺失株組CHOP的轉(zhuǎn)錄水平也顯著低于親本株(P<0.05)，12 h時升高(P>0.05),而到了24 h，缺失株組CHOP的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了顯著高于親本株(P<0.01)的現(xiàn)象(圖1B)。本試驗結(jié)果初步表明T4SS的缺失能夠降低牛種布魯氏菌誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的能力。

A.GRP78；B.CHOP。NC.正常對照組；A19.A19感染組；A19ΔVirB.A19ΔVirB感染組；與A19組相比，*.差異顯著(P<0.05), **.差異極顯著(P<0.01)；下同

2.2 牛種布魯氏菌T4SS對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志性分子GRP78和CHOP蛋白表達水平的影響

通過收集感染不同時間點的RAW264.7細胞，提取細胞總蛋白，檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志性分子GRP78和CHOP的蛋白表達變化，結(jié)果顯示，在侵染的6、12和24 h，缺失株組GRP78的蛋白表達水平均顯著低于親本株(P<0.05或P<0.01)(圖2A、B)；在侵染后的6 h，缺失株組CHOP的蛋白表達水平也顯著低于親本株(P<0.05)，而到了24 h，變成了顯著高于親本株(P<0.05)(圖2C、D)。本試驗結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果相符，更進一步表明T4SS的缺失能夠降低牛種布魯氏菌誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的能力。

A.GRP78的蛋白表達水平；B.A圖的灰度值分析；C.CHOP的蛋白表達水平；D.C圖的灰度值分析

2.3 牛種布魯氏菌T4SS對凋亡相關(guān)分子BAX和BCL-2轉(zhuǎn)錄水平的影響

通過收集感染不同時間點的RAW264.7細胞，提取細胞總RNA，檢測凋亡相關(guān)分子BAX和BCL-2的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，在侵染的24 h，缺失株A19ΔVirB組BAX的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于親本株(P<0.05)(圖3A)，而缺失株組抗BCL-2的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于親本株(P<0.01)(圖3B)，本試驗結(jié)果初步表明T4SS的缺失能夠促進牛種布魯氏菌誘導細胞凋亡的能力。

A.BAX；B.BCL-2

2.4 牛種布魯氏菌T4SS對凋亡相關(guān)分子BAX和BCL-2蛋白表達水平的影響

通過收集感染不同時間點的RAW264.7細胞，提取細胞總蛋白，檢測凋亡相關(guān)分子BAX和BCL-2的蛋白表達變化，結(jié)果顯示，在侵染的24 h，缺失株A19ΔVirB組BAX的蛋白表達水平顯著高于親本株(P<0.05)(圖4A、B)，而BCL-2的蛋白表達水平顯著低于親本株(P<0.05)(圖4C、D)，本試驗結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果相符，更進一步表明T4SS的缺失能夠促進牛種布魯氏菌誘導細胞凋亡的能力。

A.BAX的蛋白表達水平；B.A圖的灰度值分析；C.BCL-2的蛋白表達水平；D.C圖的灰度值分析

2.5 牛種布魯氏菌T4SS對RAW264.7細胞凋亡的影響

通過收集感染不同時間點的RAW264.7細胞，按照凋亡試劑盒說明書進行抗體的孵育，用流式細胞儀進行檢測，結(jié)果顯示，在侵染的24 h，缺失株A19ΔVirB引起的細胞凋亡率顯著高于親本株(P<0.05)(圖5、6)，與qRT-PCR和Western blot結(jié)果相符，證實T4SS的缺失確實增強了布魯氏菌誘導細胞凋亡的能力。

A～C.對照組6、12和24 h；D～F.布魯氏菌A19侵染組6、12和24 h；G～I.布魯氏菌A19ΔVirB侵染組6、12和24 h

3 討 論

布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生菌，利用其特有的胞內(nèi)寄生機制在機體內(nèi)建立起慢性感染。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞維持穩(wěn)態(tài)的重要細胞器，同時也是布魯氏菌肆虐繁殖的場所[18]。virB編碼的T4SS是布魯氏菌主要的毒力因子之一，在它的幫助下，布魯氏菌逃避了被溶酶體降解的命運，順利到達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)開始大量的增殖[19]。然而，也正因為布魯氏菌在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的肆虐繁殖，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)喪失其原本平衡的環(huán)境，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激便應然而生。有報道稱，粗糙型布魯氏菌能通過促進T4SS分泌的方式誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[20]，也有報道發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌T4SS分泌的效應蛋白VceC能夠誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，甚至能夠操控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激從而保證布魯氏菌的胞內(nèi)存活[15]。GRP78通常在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生時大量表達，是參與維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的重要蛋白[21]，CHOP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡途徑中扮演著重要角色[22]，二者是衡量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生與否的重要指示性分子。本研究結(jié)果顯示，親本株A19及其T4SS啟動子缺失株A19ΔVirB均能引起GRP78的表達水平升高，且變化趨勢一致，前期升高明顯，后期則出現(xiàn)下降，這可能是細胞的一種防御機制，通過GRP78表達的升高來幫助恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，延長細胞在失衡環(huán)境下的存活時間；缺失株A19ΔVirB的GRP78的表達水平始終低于親本株，提示缺失株引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的能力較親本株弱，這可能是因為virB的缺失使T4SS無法正常表達，限制了其幫助布魯氏菌順利到達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的能力，從而降低了布魯氏菌誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的能力；此外，兩株菌中CHOP的表達水平也始終高于對照組，但趨勢則與GRP78相反，呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，此結(jié)果與支飛杰[23]在山羊肺泡巨噬細胞中的研究結(jié)果相似，其中的機制可能是因為隨著GRP78的表達下降，細胞挽回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的能力減弱，無法及時恢復穩(wěn)態(tài)，最終啟動了CHOP介導的細胞凋亡途徑；缺失株組CHOP的表達水平在感染前期顯著低于親本株，與GRP78的表達變化相呼應，更進一步地證實缺失株引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的能力較親本株弱，但到了感染的24 h，出現(xiàn)了顯著高于親本株的現(xiàn)象，提示CHOP介導的凋亡途徑可能被激活，而這可能是因為virB的缺失使T4SS無法正常表達，因而無法正常分泌一些對細胞凋亡具有抑制作用的蛋白，從而更容易啟動CHOP主導的細胞凋亡途徑，誘發(fā)凋亡。

圖6 細胞凋亡率分析

當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激程度過強或者持續(xù)時間太久，就會發(fā)生細胞凋亡[24]。細胞凋亡是細胞“自我犧牲”的體現(xiàn)，也是宿主對抗病原菌感染的重要途徑[25]。布魯氏菌常常通過抑制被感染細胞凋亡的方式促進自身的存活，而被感染細胞則通過凋亡來限制布魯氏菌生存。史靜雪[14]發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌T4SS分泌的效應蛋白VceC和VceA均具有促進人滋養(yǎng)層細胞凋亡的作用；而最新的一項研究表明，布魯氏菌T4SS分泌的效應蛋白VceC能夠抑制CHOP介導的山羊胚胎滋養(yǎng)層細胞凋亡從而有利于布魯氏菌的胞內(nèi)復制[12]。本研究通過qRT-PCR和Western blot檢測了細胞凋亡關(guān)鍵分子BAX和BCL-2的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平，結(jié)果表明，缺失株引起促凋亡基因BAX表達水平升高的能力較親本株強，且缺失株抑制抗凋亡基因BCL-2的能力也較親本株強，表明缺失株引起細胞凋亡的能力強于親本株；為了進一步證實細胞凋亡確實發(fā)生，又使用流式細胞術(shù)檢測了兩株菌感染后細胞凋亡的情況，發(fā)現(xiàn)缺失株引起細胞凋亡的能力比親本株強，與BAX和BCL-2的表達水平變化結(jié)果相符，而出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是因為virB缺失后T4SS喪失了毒力功能，使布魯氏菌的毒力減弱，從而更容易被宿主細胞識別并啟動細胞凋亡將其清除。本研究整體表明，牛種布魯氏菌T4SS的缺失降低了布魯氏菌誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的能力，反而增強了其誘導凋亡的能力，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是因為布魯氏菌誘導的凋亡是多種因素相互作用的結(jié)果，而其中的具體機制還需進一步探索。

4 結(jié) 論

使用牛種布魯氏菌T4SS啟動子缺失株A19ΔVirB侵染RAW264.7細胞后發(fā)現(xiàn)，牛種布魯氏菌T4SS的缺失能夠降低布魯氏菌誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的能力，卻增強布魯氏菌誘導細胞凋亡的能力，這對于布魯氏菌致病機制的闡明具有一定的意義，為今后T4SS功能的研究奠定了基礎(chǔ)，也為布魯氏菌有效疫苗的研發(fā)提供了科學依據(jù)。