RFRP-3對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響

賈金美，馮建豪，陽(yáng)美霞，張羽芳，張虹亮，王水蓮

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

卵母細(xì)胞的成熟是哺乳動(dòng)物雌性生殖和胚胎發(fā)育的關(guān)鍵，需要經(jīng)歷復(fù)雜的減數(shù)分裂停滯和恢復(fù)，該過(guò)程受多種激素和生長(zhǎng)因子的調(diào)控[1]。緊密?chē)@在卵母細(xì)胞周?chē)穆亚痤w粒細(xì)胞參與了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的阻滯和恢復(fù)，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟.。卵丘顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞相互作用，進(jìn)行雙向的營(yíng)養(yǎng)傳遞與信息交換，這種聯(lián)系在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中必不可少[2-3]。體外培養(yǎng)裸卵會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)發(fā)育異常，但培養(yǎng)卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)時(shí)，細(xì)胞則正常成熟[4-5]。在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，卵丘顆粒細(xì)胞逐漸擴(kuò)展，卵丘擴(kuò)展需要卵丘擴(kuò)展因子透明質(zhì)酸合酶2(hyaluronan synthase 2, HAS2)、穿透素3(pentraxin 3, PTX3)和前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2, PTGS2)的參與，其中HAS2是生成透明質(zhì)酸的關(guān)鍵酶，透明質(zhì)酸是卵丘擴(kuò)展基質(zhì)的基本成分，PTGS2和PTX3具有維持?jǐn)U展基質(zhì)的作用[6-7]。卵母細(xì)胞自身分泌的生長(zhǎng)分化因子9(growth differentiation factor 9, GDF9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(bone morphogenetic protein 15, BMP15)通過(guò)誘導(dǎo)卵丘擴(kuò)展因子(PTGS2、HAS2和PTX3)表達(dá)，引起細(xì)胞外基質(zhì)分泌，促進(jìn)卵丘細(xì)胞擴(kuò)展[8-9]。王兆琛等[10]體外添加GDF9和BMP15培養(yǎng)綿羊卵母細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，GDF9和BMP15有利于卵丘擴(kuò)展，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。卵丘顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)被運(yùn)送到卵母細(xì)胞內(nèi)[11]，細(xì)胞內(nèi)不斷累積的cAMP能夠啟動(dòng)cAMP依賴(lài)性蛋白激酶(PKA)途徑，阻止成熟促進(jìn)因子(maturation promoting factor，MPF)活化，使卵母細(xì)胞停滯在M期[12]。MPF是由細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，CDK1)和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白B(cyclin B)組成的復(fù)合物，主要調(diào)控卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)。MPF的活性主要由細(xì)胞質(zhì)中的調(diào)節(jié)亞基cyclin B在細(xì)胞周期中的不斷活化和衰減來(lái)調(diào)節(jié)，隨著卵母細(xì)胞的成熟，cyclin B含量逐漸上升，誘導(dǎo)CDK1蛋白發(fā)生去磷酸化，形成活化的MPF進(jìn)而調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟[13]。

Tsutsui等[14]于2000年在日本鵪鶉中發(fā)現(xiàn)了一種C端具有RF酰胺結(jié)構(gòu)的神經(jīng)肽，它以劑量依賴(lài)的方式抑制了體外培養(yǎng)的鵪鶉垂體中促性腺激素釋放激素的釋放，因此被命名為促性腺激素抑制激素(GnIH)。隨后的研究表明，哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在與鳥(niǎo)類(lèi)GnIH具有相似生理作用的同源物RFRP-3[15]。在哺乳動(dòng)物中，Li等[16]發(fā)現(xiàn)RFRP-3的同源物GnIH除定位在豬的下丘腦等中樞神經(jīng)系統(tǒng)外，同樣在其它器官中也有表達(dá)，尤其在生殖系統(tǒng)細(xì)胞中，推測(cè)RFRP-3可能在豬的生殖系統(tǒng)中也發(fā)揮調(diào)控作用。研究表明，使用不同劑量的RFRP-3處理豬下丘腦細(xì)胞可以顯著抑制促性腺激素釋放激素分泌及相關(guān)基因水平的表達(dá)，處理豬顆粒細(xì)胞可以顯著降低雌二醇(estradiol, E2)的濃度[17]。汪瑤等[18]也證實(shí)RFRP-3可作用于母豬促性腺激素釋放激素的神經(jīng)元，抑制E2的產(chǎn)生與分泌。此外，RFRP-3處理垂體細(xì)胞還能夠抑制發(fā)情周期中豬促黃體生成素(luteinizing hormone, LH)的合成和分泌[19]。RFRP-3不僅可以調(diào)控豬生殖激素的分泌，還能夠通過(guò)降低CDK1和cyclinB1 mRNA的表達(dá)水平，抑制cyclinB-CDK1復(fù)合物的活化，使部分細(xì)胞阻滯在G2/M期，進(jìn)而影響豬顆粒細(xì)胞的增殖[18]。綜上，目前RFRP-3關(guān)于豬的研究主要集中在對(duì)生殖激素和顆粒細(xì)胞的調(diào)控，還沒(méi)有關(guān)于RFRP-3對(duì)豬卵母細(xì)胞影響的研究，因此，本試驗(yàn)通過(guò)在豬卵母細(xì)胞培養(yǎng)基中添加RFRP-3，探究其對(duì)體外培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞成熟的影響，為揭示RFRP-3對(duì)哺乳動(dòng)物繁殖的調(diào)控作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

TCM199培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，人源RFRP-3購(gòu)自Phoenix Pharmaceuticals公司，青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，馬絨毛膜促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)購(gòu)自寧波第二激素廠(chǎng)，豬促成熟因子(MPF)和豬環(huán)磷酸腺苷(cAMP)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自睿信生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、丙酮酸鈉、L-半胱氨酸、牛血清白蛋白(BSA)、D-葡萄糖、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白(ITS)和礦物油均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 豬卵母細(xì)胞的采集與體外培養(yǎng)

豬卵巢采集于長(zhǎng)沙市紅星盛業(yè)屠宰場(chǎng)，將卵巢置于含有2%雙抗的37 ℃的生理鹽水中，在2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。使用10 mL的注射器抽取卵巢上直徑約為3～6 mm的卵泡，靜置15 min后棄去上清，在顯微鏡下用自制口吸管挑取胞質(zhì)均勻、且包被3層及以上顆粒細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，將COCs培養(yǎng)于含激素的TCM199成熟培養(yǎng)基(Ⅰ液：卵泡液、丙酮酸鈉、L-半胱氨酸、BSA、D-葡萄糖、孕馬血清促性腺激素、人絨毛膜促性腺激素、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為飽和濕度，38.5 ℃，5% CO2，培養(yǎng)22～24 h后換液，換成不含激素的TCM199成熟培養(yǎng)基(Ⅱ液：卵泡液、丙酮酸鈉、L-半胱氨酸、BSA、D-葡萄糖)繼續(xù)培養(yǎng)20～22 h。在培養(yǎng)基中添加10-6和10-8mol·L-1RFRP-3為RFRP-3處理組，不添加RFRP-3為空白對(duì)照組。

1.3 卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展與卵母細(xì)胞成熟的判定

體外培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞44 h后，通過(guò)體式顯微鏡觀(guān)察卵丘擴(kuò)展情況并計(jì)算卵丘擴(kuò)展指數(shù)(cumulus expansion index, CEI)，卵丘擴(kuò)展指數(shù)=組內(nèi)COCs卵丘擴(kuò)展情況分值總和/組內(nèi)所有COCs數(shù)。卵丘擴(kuò)展分級(jí)：0級(jí)表示卵丘無(wú)擴(kuò)展，計(jì)0分；1級(jí)表示僅最外圍1～2層卵丘細(xì)胞發(fā)生擴(kuò)展，計(jì)2分；3級(jí)表示除放射冠之外所有卵丘細(xì)胞均發(fā)生擴(kuò)展，計(jì)3分；4級(jí)表示所有卵丘細(xì)胞均發(fā)生擴(kuò)展，計(jì)4分。

體外培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞44 h后，用0.3%的透明質(zhì)酸酶脫去卵丘顆粒層，以第一極體的排出作為COCs成熟的判定標(biāo)準(zhǔn)，并統(tǒng)計(jì)各組的第一極體排出率。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

從各組隨機(jī)挑取150個(gè)卵母細(xì)胞，使用微量RNA提取試劑盒(QIAGEN，德國(guó))提取卵母細(xì)胞RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系為：5 μL TB Green Premix Ex Taq II, 0.2 μL ROX Reference Dye,正、反向引物各0.2 μL, cDNA 2 μL，DEPC水2.4 μL，每孔3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、57 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、61 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s、40個(gè)循環(huán)。各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量通過(guò)2-ΔΔCT法計(jì)算[20]。引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.5 ELISA檢測(cè)豬卵母細(xì)胞cAMP和MPF的含量

收集各組培養(yǎng)44 h的COCs，用0.3%透明質(zhì)酸酶脫去顆粒層，使用蛋白酶溶解透明帶，經(jīng)過(guò)PBS洗凈后，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)卵母細(xì)胞cAMP和MPF的含量。

1.6 放射免疫檢測(cè)雌二醇和孕酮的濃度

分別收集COCs培養(yǎng)22 和44 h的培養(yǎng)基，送北京北方生物技術(shù)研究所有限公司，通過(guò)放射免疫檢測(cè)雌二醇和孕酮的濃度。

1.7 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)”表示，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 RFRP-3對(duì)豬COCs體外成熟率的影響

體外添加不同濃度(0、10-6和10-8mol·L-1)RFRP-3培養(yǎng)豬卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體44 h，然后脫去卵丘顆粒層，統(tǒng)計(jì)第一極體排出率。結(jié)果顯示，與對(duì)照組((71.8±3.39)%)相比，10-8mol·L-1RFRP-3添加組的成熟率((53±1.80)%)極顯著降低(P<0.01)，但添加10-6mol·L-1RFRP-3對(duì)豬COCs的成熟率((69.27±0.35)%)無(wú)顯著影響(P>0.05)(圖1)。表明10-8mol·L-1RFRP-3可抑制豬COCs的體外成熟。

“*”表示與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；“**”表示與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P< 0.01)，下同

2.2 RFRP-3對(duì)豬COCs卵丘擴(kuò)展的影響

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，本研究后續(xù)試驗(yàn)將選擇10-8mol·L-1RFRP-3作為RFRP-3處理組。添加10-8mol·L-1RFRP-3培養(yǎng)豬COCs 44 h后，通過(guò)顯微鏡觀(guān)察各組的卵丘擴(kuò)展情況并計(jì)算卵丘擴(kuò)展指數(shù)。結(jié)果顯示，RFRP-3添加組的卵丘擴(kuò)展指數(shù)(3.46±0.1)與對(duì)照組(3.24±0.08)相比無(wú)明顯變化(P>0.05)(圖2A-E)。采用qRT-PCR檢測(cè)RFRP-3添加組中卵丘擴(kuò)展相關(guān)因子PTGS2、HAS2和PTX3基因的表達(dá)水平。結(jié)果如圖2F所示，10-8mol·L-1RFRP-3處理COCs可極顯著下調(diào)PTGS2、HAS2和PTX3基因的表達(dá)水平(P<0.01)。表明添加RFRP-3對(duì)豬COCs卵丘擴(kuò)展無(wú)影響，但可降低相關(guān)卵丘擴(kuò)展因子的表達(dá)水平。

A.Control組卵丘細(xì)胞擴(kuò)展情況(40×)；B.Control組卵丘細(xì)胞擴(kuò)展情況(100×)；C.RFRP-3組卵丘細(xì)胞擴(kuò)展情況(40×)；D.RFRP-3組卵丘細(xì)胞擴(kuò)展情況(100×)；E.RFRP-3對(duì)卵丘擴(kuò)展的影響；F.RFRP-3對(duì)卵丘擴(kuò)展因子表達(dá)的影響

2.3 RFRP-3對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟相關(guān)因子的影響

為進(jìn)一步探索RFRP-3抑制豬COCs體外成熟的機(jī)制，添加RFRP-3培養(yǎng)COCs成熟后，脫去卵丘顆粒層，收集卵母細(xì)胞裂解物，采用ELISA檢測(cè)卵母細(xì)胞胞質(zhì)中MPF和cAMP的含量。結(jié)果表明，RFRP-3添加組與空白對(duì)照組相比可極顯著降低細(xì)胞質(zhì)中MPF的含量(P<0.01)，但對(duì)cAMP的含量無(wú)明顯影響(P>0.05)(圖3A,3B)。采用qRT-PCR檢測(cè)添加RFRP-3培養(yǎng)COCs后對(duì)GDF9和BMP15表達(dá)的影響。結(jié)果如圖3C所示，與對(duì)照組相比，添加RFRP-3可極顯著提高卵母細(xì)胞GDF9基因的表達(dá)(P<0.01)，顯著提高BMP15的表達(dá)(P<0.05)。

A.MPF水平；B.環(huán)磷酸腺苷水平；C.生長(zhǎng)分化因子9和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15基因的表達(dá)

2.4 RFRP-3對(duì)豬卵母細(xì)胞周期相關(guān)基因的影響

添加RFRP-3培養(yǎng)COCs成熟后，脫去卵丘顆粒層，收集卵母細(xì)胞裂解物，利用qRT-PCR檢測(cè)豬卵母細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)基因CCNB1和CDK1的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，添加RFRP-3培養(yǎng)豬COCs可以顯著降低卵母細(xì)胞中CCNB1和CDK1基因的表達(dá)水平(P<0.05，圖4)。

圖4 RFRP-3對(duì)豬卵母細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.5 RFRP-3對(duì)豬COCs激素分泌的影響

添加RFRP-3培養(yǎng)COCs后，分別收集22(Ⅰ液)和44 h(Ⅱ液)的培養(yǎng)基，檢測(cè)培養(yǎng)基中雌二醇和孕酮的濃度。結(jié)果表明，RFRP-3可極顯著降低培養(yǎng)基中雌二醇(E2)和孕酮(P4)的濃度(P<0.01)(圖5)。

A.雌二醇濃度；B.孕酮濃度

3 討 論

在哺乳動(dòng)物卵巢中，RFRP-3主要表達(dá)在顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞中，在卵母細(xì)胞中的表達(dá)研究較少。Wang等[21]研究表明，添加10-6和10-8mol·L-1RFRP-3可顯著降低豬顆粒細(xì)胞cyclin B1和CDK1的表達(dá)水平。cyclin B和CDK1可以組成異二聚復(fù)合體(即成熟促進(jìn)因子，MPF)，MPF對(duì)于卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂恢復(fù)是必不可少的，因此本試驗(yàn)選擇添加0、10-6和10-8mol·L-1RFRP-3體外培養(yǎng)豬COCs，結(jié)果顯示，添加10-8mol·L-1RFRP-3可極顯著降低卵母細(xì)胞的成熟率，而添加10-6mol·L-1RFRP-3對(duì)豬COCs的體外成熟率無(wú)顯著影響。Singh等[22]用RFRP-3處理小鼠，也表明RFRP-3可以明顯抑制卵泡發(fā)育，使得卵母細(xì)胞無(wú)法成熟。卵母細(xì)胞成熟的實(shí)質(zhì)就是減數(shù)分裂的阻滯與恢復(fù)，該過(guò)程主要由cAMP和MPF調(diào)控。研究表明，高水平的cAMP可以抑制cyclin B的表達(dá)，磷酸化CDK1的蘇氨酸Thr-14和酪氨酸Tyr-15殘基，導(dǎo)致CDK/cyclin B 蛋白復(fù)合物失活，MPF的活性被抑制[23]，但隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟，cAMP被cAMP磷酸二酯酶降解，cAMP濃度降低，誘導(dǎo)MPF活化，引起卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)[24]。郭振偉等[25]體外添加褪黑素培養(yǎng)水牛卵母細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，褪黑素能夠抑制cAMP合成, 進(jìn)而促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。本研究利用ELISA法檢測(cè)了豬卵母細(xì)胞cAMP和MPF的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RFRP-3可以使卵母細(xì)胞中MPF的濃度極顯著降低，但cAMP的濃度無(wú)明顯變化，推測(cè)正是這一變化導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯，抑制卵母細(xì)胞的成熟。李贊[26]的研究也表明，添加減數(shù)分裂的抑制劑AMH，可降低MPF的濃度，維持高水平的cAMP，阻礙卵母細(xì)胞成熟。本試驗(yàn)通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞CCNB1和CDK1的基因表達(dá)水平顯著下降，推測(cè)RFRP-3可能是通過(guò)降低CCNB1和CDK1基因的表達(dá)，從而下調(diào)了MPF。與本研究結(jié)果類(lèi)似，Wang等[21]研究表明，添加RFRP-3可以降低豬顆粒細(xì)胞cyclinB和CDK1的表達(dá)水平，抑制cyclin B-CDK1復(fù)合物(MPF)的激活從而誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期停滯，阻礙豬顆粒細(xì)胞增殖。推測(cè)RFRP-3可能通過(guò)調(diào)節(jié)MPF和cAMP的水平，進(jìn)而調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟。

GDF9和BMP15作為卵母細(xì)胞分泌因子，可以與卵丘顆粒細(xì)胞相互作用，促進(jìn)卵丘擴(kuò)展，調(diào)控卵母細(xì)胞成熟[27]。魏莉娜等[28]研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞中GDF9和BMP15參與調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟。在本試驗(yàn)中，RFRP-3顯著抑制了豬卵母細(xì)胞的成熟，但RFRP-3處理組中卵母細(xì)胞GDF9和BMP15的基因表達(dá)水平卻顯著升高。有研究表明，體外添加高濃度(300 ng·mL-1)的GDF9可以顯著降低卵母細(xì)胞的成熟率[29]，過(guò)表達(dá)BMP15可以阻礙卵母細(xì)胞的成熟[30]，據(jù)此推測(cè)，體外添加RFRP-3可能通過(guò)增加卵母細(xì)胞內(nèi)的GDF9和BMP15表達(dá)，進(jìn)而抑制豬卵母細(xì)胞的成熟。

卵母細(xì)胞的成熟與排卵受多種細(xì)胞和信號(hào)因子的調(diào)控，其中卵丘細(xì)胞通過(guò)復(fù)雜的縫隙連接為卵母細(xì)胞提供部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯和恢復(fù)，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟[31]。趙子墨等[32]研究證明，培養(yǎng)COCs的存活率與成熟率顯著高于裸卵組，表明卵丘細(xì)胞對(duì)于卵母細(xì)胞的成熟是必不可少的。其中卵丘細(xì)胞擴(kuò)展在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，卵丘擴(kuò)展后卵丘細(xì)胞才能與卵母細(xì)胞進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)傳遞與信息交換。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在豬COCs體外培養(yǎng)體系中添加RFRP-3對(duì)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展無(wú)明顯影響。Nikoloff等[33]研究也證明，添加不飽和脂肪酸EPA，體外培養(yǎng)COCs雖然可以顯著降低卵母細(xì)胞的成熟率，但對(duì)卵丘細(xì)胞擴(kuò)展無(wú)明顯影響，這一點(diǎn)與本研究結(jié)果一致。卵丘擴(kuò)展需要卵丘基質(zhì)來(lái)維持，卵丘基質(zhì)的合成依賴(lài)于卵丘擴(kuò)展因子[34]。Pan等[35]研究發(fā)現(xiàn)，在卵母細(xì)胞培養(yǎng)基中添加E2可以增強(qiáng)卵丘擴(kuò)展因子(PTGS2、HAS2和PTX3)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。Nagyova等[36]研究證明，添加10 μmol·L-1表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶的抑制劑(lapatinib)，可以使卵丘擴(kuò)展因子TNFAIP6和PTGS2的表達(dá)顯著降低，阻礙豬卵母細(xì)胞成熟。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，RFRP-3可通過(guò)抑制卵丘擴(kuò)展因子(PTGS2、HAS2和PTX3)的表達(dá)來(lái)降低卵母細(xì)胞的成熟。研究表明，卵丘顆粒細(xì)胞不僅通過(guò)卵丘擴(kuò)展因子影響卵母細(xì)胞的成熟，顆粒細(xì)胞分泌的E2和P4也可以維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的停滯與恢復(fù)，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟[37-38]。本研究結(jié)果顯示，添加RFRP-3體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞，可極顯著降低培養(yǎng)基中E2和P4的濃度，表明RFRP-3可通過(guò)抑制卵丘顆粒細(xì)胞分泌E2和P4，進(jìn)而抑制卵母細(xì)胞的成熟。

4 結(jié) 論

RFRP-3可以通過(guò)降低豬COCs卵丘擴(kuò)展因子(PTGS2、HAS2和PTX3)、周期相關(guān)因子(CCNB1和CDK1)的基因表達(dá)，增加卵母細(xì)胞分泌因子(GDF9和BMP15)的基因表達(dá)，抑制卵母細(xì)胞MPF的生成，抑制卵丘顆粒細(xì)胞雌二醇和孕酮的分泌，進(jìn)而抑制豬卵母細(xì)胞的成熟。本研究可以為揭示RFRP-3對(duì)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的調(diào)控作用及機(jī)制提供理論依據(jù)。