過表達circNMT1促進水牛脂肪細胞的成脂分化

馮 雪，趙金輝，汪書哲，黃潔萍,3，魏雪鋒，史遠剛，馬 云,*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 寧夏回族自治區(qū)反芻動物分子與細胞育種重點實驗室，銀川 750021；2.信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，信陽 464000；3.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530000)

中國擁有豐富的水牛資源。據(jù)FAO統(tǒng)計，2019年中國水牛存欄量位于世界第三，僅次于印度和巴基斯坦。隨著農(nóng)業(yè)機械化程度的提高，水牛由過去的役用生產(chǎn)逐漸向乳肉兼用的方向發(fā)展[1]，因此通過提高水牛肉品質(zhì)，對其品種進行改良十分重要。肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat，IMF)含量決定牛肉的口感、風(fēng)味及多汁性，是影響肉類產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。

脂肪沉積是極其復(fù)雜的生理過程，受以PPARG和C/EBPα為核心的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控[2]。除了編碼RNA，目前已有研究表明非編碼RNA也參與脂肪沉積過程[3-5]。而環(huán)狀RNA(circular RNAs，circRNAs)與傳統(tǒng)的線性RNA不同，是一類不具有5′末端帽子和3′末端poly(A)尾巴以共價鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA。隨著RNA測序和生物信息技術(shù)的快速發(fā)展，circRNA在許多物種中得到鑒定[6-8]，且發(fā)現(xiàn)參與包括脂肪生成[9-11]在內(nèi)的多種生物學(xué)過程[12-14]。近年來，已有研究對人[15]、小鼠[16]、豬[9]和水牛[17]等脂肪組織或者脂肪相關(guān)細胞進行circRNA轉(zhuǎn)錄組測序，獲得circRNA的表達譜，從而篩選潛在影響脂肪沉積的功能性circRNA。

前期對水牛脂肪組織進行轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，N-肉豆蔻?；D(zhuǎn)移酶 1(N-myristoyltransferase 1，NMT1)產(chǎn)生的circRNA19:45387150|45389986可能參與脂質(zhì)代謝[17]。為了探究該circRNA在脂肪沉積中所發(fā)揮功能，本研究通過確定circNMT1真實性，對其進行核質(zhì)定位，明確時空表達模式，進一步探究其對3T3-L1細胞和水牛脂肪細胞脂質(zhì)生成的影響。該研究為提高水牛肉品質(zhì)提供分子理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究分別采集3頭中國沼澤水牛的心、肝、脾、肺、腎和背最長肌、背部皮下脂肪組織樣本。水牛集中飼養(yǎng)于信陽水牛養(yǎng)殖場(中國，河南，信陽)，以相同日糧和管理標準進行飼養(yǎng)，水牛在6月齡時斷奶，30月齡時屠宰。屠宰后立即對各組織進行取樣，并在液氮中冷凍帶回實驗室，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。試驗中?T3-L1細胞購于上海ATCC細胞庫。對新鮮背部皮下脂肪組織取樣，將其保存在含有1%鏈霉素和青霉素的PBS中，并帶回實驗室進行脂肪細胞的分離和培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT Master Mix、TB GreenTMPremix Ex TaqTM II均購于TaKaRa公司；Lucigen RNR07250 Ribonuclease R kit(RNase R)購自Lucigen-Simplifying Genomics公司；PARIS kit購自Life Technologies公司；Lipofectamine 3000購自Invitrogen公司；2×Power Raq PCR Master購自Bioteke公司；質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒購于天根生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素抗體、胰酶均購于Hyclone公司；羅格列酮、地塞米松、IBMX、胰島素和油紅O均購自Sigma公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序分析獲得的circRNA序列信息與Ensembl對比，獲得對應(yīng)的序列。對向引物用以鑒定circRNA接口序列的存在，以及作為定量引物進行定量檢測。使用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)和 Primer5.0進行引物設(shè)計(表1)。

1.4 水牛前體脂肪細胞的分離、培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

簡單來說，將水牛背部脂肪組織采集后，用含1%鏈霉素和青霉素的PBS進行洗滌，剝?nèi)ブ窘M織外表皮，同時剔除組織樣品中肉眼可見的結(jié)締組織及血管，將脂肪組織分離成黃豆大小(直徑約1～3 cm)的組織塊，盡量均勻種植到90 mm細胞培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿倒置放入37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6 h后，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基(20% FBS血清+1%鏈霉素和青霉素+DMEM高糖培養(yǎng)基)正置培養(yǎng)7～15 d。待游離出細胞后，剔除組織塊進行消化離心，將細胞分離出單獨進行培養(yǎng)。當細胞密度達到80%～90%，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+1 μmol·L-1地塞米松+0.5 mmol·L-1IBMX+0.01 mg·mL-1胰島素+1 μmol·L-1羅格列酮)，對其進行誘導(dǎo)分化。誘導(dǎo)2 d后，將誘導(dǎo)培養(yǎng)基更換為維持培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.01 mg·mL-1胰島素+1 μmol·L-1羅格列酮)，每2 d更換1次維持培養(yǎng)基，直至誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細胞(誘導(dǎo)6～10 d左右)。詳細過程見文獻[18]。

1.5 RNA的提取、cDNA的合成、半定量PCR和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)擴增

組織和細胞的總RNA過程與檢測方法參考文獻[18]，水牛脂肪細胞的細胞質(zhì)、細胞核RNA的提取與分離參考文獻[19]。cDNA的合成主要是用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系(20.0 μL)：5×PrimerScript RT Master Mix I 4.0 μL，RNA 1 000 ng, RNase Free ddH2O 添加至20 μL；反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃保存。半定量PCR的過程參考文獻[20]。qRT-PCR以GAPDH和β-actin作為內(nèi)參基因。此外，β-actin也被用作細胞定位中細胞質(zhì)的標記物。qRT-PCR反應(yīng)體系(10 μL)：TB Green Premix Ex Taq II 5 μL，PCR Forward Primer(10 μmol·L-1)0.5 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.5 μL，cDNA 1 μL，RNase Free dH2O添加至10 μL；反應(yīng)程序：95 ℃ 120 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40個循環(huán)；95 ℃ 10 s；60 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s。使用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達水平。每個樣品進行3次重復(fù)，qRT-PCR試驗進行3次重復(fù)。所用引物序列見表1。

表1 qRT-PCR的引物信息

1.6 RNase R核糖核酸外切酶消化線性試驗

使用Lucigen RNR07250 Ribonuclease R(RNase R)試劑盒進行RNA線性消化試驗。將提取的原始RNA樣品等分為兩份，一份做RNase R 處理，另外一份不處理，此時兩組RNA等量。RNase R消化反應(yīng)體系：RNA<5 μg：10×Reaction 2 μL，RNase R(20 U·μL-1)3～4 U·μg-1RNA，RNase Free dH2O添加至20 μL；RNA>5 μg：10×Reaction 5 μL，RNase R(20 U·μL-1)3～4 U·μg-1RNA，RNase Free dH2O添加至50 μL；反應(yīng)程序：37 ℃反應(yīng)25 min。

1.7 載體構(gòu)建和腺病毒包裝

mouse-pCD2.1-circNMT1重組載體由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司構(gòu)建完成。將小鼠circRNA 序列克隆到 pCD2.1-ciR載體的KpnI和BamH I限制性位點。腺病毒包裝在漢恒生物技術(shù)有限公司(中國上海)進行。將水牛circRNA全長序列連接到AdMax系統(tǒng)以獲得Ad-circRNA。其中，EGFP綠色熒光標簽用作轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的指標，Ad-EGFP為陰性對照。

1.8 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)

對于3T3-L1細胞，當細胞密度達到80%時，使用Lipofectamine 3000試劑按照說明書將mouse-pCD2.1-circRNA重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染后48 h用誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理細胞。誘導(dǎo)2 d后用維持培養(yǎng)基處理細胞。以后，每2 d更換1次維持培養(yǎng)基，直到細胞誘導(dǎo)分化第6天。腺病毒轉(zhuǎn)染與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染類似，根據(jù)腺病毒說明書，當水牛前體脂肪細胞密度達到80%時，進行腺病毒轉(zhuǎn)染水牛前體脂肪細胞。誘導(dǎo)分化過程同上。誘導(dǎo)分化6 d后進行油紅O染色和異丙醇定量。

1.9 油紅O染色和定量

誘導(dǎo)分化完成的脂肪細胞用PBS洗滌3次，用等量的10%福爾馬林對細胞處理5 min和1 h后，用60%異丙醇洗滌細胞并用油紅O工作液染色20 min，隨后用PBS洗滌細胞3～5次，在顯微鏡下觀察。為了量化細胞中的脂質(zhì)積累，使用100% 異丙醇洗脫油紅O。最后，以100%異丙醇作為空白對照，在波長為510 nm處對油紅O的分光光度吸光度進行定量。

1.10 統(tǒng)計分析

使用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析，P<0.05被認為表明具有統(tǒng)計學(xué)意義，用GraphPad Prism7軟件進行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 circNMT1序列信息

通過NCBI數(shù)據(jù)庫尋找NMT1基因全長序列，并與測序得到的circRNA序列進行比對。結(jié)果表明，circRNA19:45387150|45389986是由NMT1基因(ENSBTAT00000007950)產(chǎn)生的，具體信息在先前的研究已有描述[17]。circRNA19:45387150|45389986是通過剪接和環(huán)化NMT1基因的第2和3個外顯子形成的(圖1)。因此，將該circRNA命名為circNMT1。

2.2 circNMT1的特性分析

通過核酸外切酶耐受性試驗對circNMT1進行鑒定，證實circRNA的真實性，并通過分離水牛前體脂肪細胞的細胞質(zhì)和細胞核RNA對circNMT1進行定位，推測circRNA可能發(fā)揮的功能作用。對線性化RNA處理后，半定量PCR結(jié)果表明，circNMT1仍然存在于水牛前體脂肪細胞中(圖2A)。同樣的，qRT-PCR的結(jié)果表明，盡管經(jīng)過RNase R處理后，circNMT1的表達量有所減少，但它仍然高度表達(圖2B)。同時，半定量PCR和qRT-PCR結(jié)果表明，circNMT1在水牛前體脂肪的細胞核和細胞質(zhì)中均表達(圖2C，D)。進一步序列比對發(fā)現(xiàn)，mouse-circNMT1和buffalo-circNMT1具有一定的保守性(同源率為88.98%，圖2E)。

A、B.半定量PCR和qRT-PCR檢測RNase R處理前、后circNMT1的表達量；C、D.通過半定量和qRT-PCR對circNMT1進行核質(zhì)定位；E.Mouse-circNMT1和circNMT1(buffalo-circNMT1)序列比對結(jié)果。牛-β-actin作為標準化參考基因。數(shù)據(jù)表示為“平均值 ± SD”，n = 3，***.P<0.001

2.3 水牛前體脂肪細胞的分離、培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化體系的建立

通過對水牛背部脂肪組織進行采集，分離水牛前體脂肪細胞。組織塊分離法可以觀察到，培養(yǎng)4 d有少數(shù)的細胞爬出(圖3A)。對分離得到的細胞培養(yǎng)，并對其進行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)分化第0天，幾乎觀察不到脂滴(圖3B)。將基礎(chǔ)培養(yǎng)基更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對細胞進行誘導(dǎo)分化，2 d后細胞產(chǎn)生少量的脂滴(圖3C)。隨后將誘導(dǎo)培養(yǎng)基更換為維持培養(yǎng)基，且以后每2 d更換一次。即誘導(dǎo)分化第4(圖3D)、第6(圖3E)及第10天(圖3F)可以觀察到脂滴在不斷的增多。表明水牛脂肪細胞的分離、培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化體系建立成功。

A.組織塊法對水牛前體脂肪細胞進行分離培養(yǎng)(4 d)，比例尺為100 μm；B.對前體脂肪細胞誘導(dǎo)分化0 d，比例尺為100 μm；C-F.對前體脂肪細胞誘導(dǎo)分化2、4、6、10 d，比例尺為50 μm

2.4 circNMT1的表達模式

為了研究circNMT1在水牛不同組織(心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪組織)中的表達，使用TRIzol從不同組織中收集并提取了總RNA，通過qRT-PCR檢測circNMT1實際表達。在脂肪組織中檢測到circNMT1具有最高的表達(圖4A，P<0.001)。進一步檢測了circNMT1在水牛脂肪細胞分化不同階段的表達，發(fā)現(xiàn)circNMT1的表達隨著細胞分化的程度而增加，并在分化的第10天表達量最高(圖4B，P<0.001)。

A.circNMT1在水牛心、肝、脾、肺、腎、肌肉和脂肪組織中的表達譜(所有數(shù)據(jù)以心歸一化)；B.circNMT1在水牛脂肪細胞分化過程中的表達模式(第0、2、6和10天，所有數(shù)據(jù)以day_0歸一化)。GAPDH作為標準化參考基因。數(shù)據(jù)表示為“平均值 ± SD”，n = 3，**.P<0.01，***.P<0.001，下同

2.5 circNMT1促進3T3-L1細胞成脂分化

mouse-circNMT1和buffalo-circNMT1序列比對表明具有保守性(圖2E)。為了更好的探究circNMT1在脂肪沉積中發(fā)揮的功能，在3T3-L1細胞中進行了mouse-circNMT1的功能獲得性試驗。正如預(yù)期的那樣，與pCD2.1-ciR組相比，mouse-pCD2.1-circNMT1組中circNMT1的表達水平顯著上調(diào)(圖5C，P<0.001)，與此同時，PPARG、C/EBPα和FABP4的表達水平也顯著上調(diào)(圖5D-F，P<0.01)。誘導(dǎo)分化后，mouse-pCD2.1-circNMT1組中的脂滴累積顯著高于pCD2.1-ciR組(圖5A，B，P<0.01)。

A.將pCD2.1-ciR和mouse-pCD2.1-circNMT1轉(zhuǎn)染到3T3-L1細胞中誘導(dǎo)分化6天后的油紅O染色圖像，比例尺為200 μm;B.通過分光光度法對油紅O染色進行定量分析的柱狀圖;C-F.轉(zhuǎn)染48 h后circNMT、PPARG、C/EBPα和FABP4的RNA表達水平，β-actin作為標準化參考基因，control表示pCD2.1-ciR組，circNMT表示mouse-pCD2.1-circNMT1組，NC表示空白對照

2.6 circNMT1促進水牛脂肪細胞成脂分化

為了評估circNMT1對水牛脂肪沉積的影響，將circNMT1的全長連接到腺病毒系統(tǒng)中從而實現(xiàn)circRNA的過表達(Ad_circNMT1)。Ad_circNMT1轉(zhuǎn)染細胞2 d后，綠色熒光標簽GFP高度表達(圖6A)，表明具有較高的轉(zhuǎn)染效率，定量結(jié)果也表明在Ad_circNMT1組中circNMT1的表達顯著高于Ad_EGFP組(圖6D，P<0.001)。同時，水牛前體脂肪細胞分化6 d后，相比較Ad_EGFP組，Ad_circNMT1組的脂滴累積顯著增多(圖6B，C，P<0.01)。至于成脂標志基因，PPARG、C/EBPα和FABP4的mRNA表達在轉(zhuǎn)染2 d后顯著上調(diào)(圖6E-G，P<0.01)。

A.Ad_GFP(對照)和Ad_circNMT1組中含有GFP標簽的陽性細胞轉(zhuǎn)染2 d的顯微照片，比例尺為200 μm;B.將Ad_GFP和Ad_circNMT1轉(zhuǎn)染到水牛脂肪細胞中誘導(dǎo)分化6 d后的油紅O染色圖像，比例尺為200 μm;C.分光光度法對油紅O染色進行定量分析;D-G.轉(zhuǎn)染48 h后的circNMT(D)、PPARG(E)、C/EBPα(F)和FABP4(G)的RNA表達水平，GAPDH作為標準化參考基因，NC表示空白對照

3 討 論

NMT1是一種關(guān)鍵的細胞酶，通過促進肉蔻酸酯(一種14碳飽和脂肪酸)與幾種蛋白質(zhì)分子的N-末端甘氨酸連接進行脂質(zhì)修飾并增加蛋白質(zhì)的親脂性[21]。編碼蛋白基因可通過可變剪切產(chǎn)生circRNA，能被鑒定到的circRNA一般為表達豐度高且具有生物學(xué)功能，而且與來源基因之間會存在著一定的相關(guān)性[22]。因此，由NMT1基因產(chǎn)生的circNMT1被認為是功能性的circRNA。

環(huán)狀RNA與線性RNA不同的是，circRNA的環(huán)狀閉合結(jié)構(gòu)具有核酸外切酶耐受性，可抵抗RNase R酶的消化作用，穩(wěn)定性較高。circNMT1經(jīng)核酸外切酶處理后仍穩(wěn)定表達(圖2A，2B)，表明circNMT1在脂肪細胞中以環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在。這與報道的circRNA經(jīng)去線性處理的研究結(jié)果相一致[23-25]。circNMT1在水牛前體脂肪細胞的細胞核和細胞質(zhì)中均表達(圖2C，2D)。而circRNA因所處于核質(zhì)的位置不同，發(fā)揮的功能具有很大區(qū)別。大多數(shù)的circRNA主要存在細胞質(zhì)中，可作為ceRNA與mRNA競爭性結(jié)合miRNA，從而調(diào)控mRNA的表達[14,23,26]。少數(shù)通過內(nèi)含子環(huán)化而成的circRNA位于細胞核中，主要發(fā)揮對親本基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用[27]。結(jié)果提示，circNMT1發(fā)揮的功能可能較為復(fù)雜，需要進一步對其參與機制進行研究。circNMT1在水牛和小鼠中具有較高的同源性(同源率為88.98%，圖2E)，這與報道的circRNA在不同物種中具有保守性[28-30]相一致。而circNMT1在脂肪組織和成熟的脂肪細胞中高表達(圖4A，4B,P<0.01)，提示該circRNA可能調(diào)節(jié)脂肪細胞的分化[31]。

動物的脂肪組織從沉積位置分為皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪和IMF。皮下脂肪是指在腹部、背部及腹股溝等動物皮下部位沉積的脂肪組織，內(nèi)臟脂肪是指在內(nèi)臟周圍沉積的脂肪，而IMF是在肌纖維和肌束間沉積的脂肪組織，含量和分布是衡量牛肉品質(zhì)的重要指標。由于其位置的特異性，IMF不同于皮下脂肪[32-34]和內(nèi)臟脂肪[35]，但彼此之間相互影響。日本和牛IMF沉積豐富，可作為研究牛IMF沉積的動物模型[36]。有研究發(fā)現(xiàn)，日本和牛背最長肌中IMF含量與皮下脂肪百分比[35]、成熟度[37]呈正相關(guān)。即IMF與皮下脂肪呈正相關(guān)。故而，體外培養(yǎng)的皮下脂肪細胞可作為研究脂肪沉積(IMF)分子調(diào)控機制的細胞模型，這在前期研究中也有所提及[18]。3T3-L1小鼠胚胎成纖維細胞(前脂肪)對其進行誘導(dǎo)分化后也是探究脂質(zhì)累積的常用研究細胞模型[38-40]。

功能獲得性試驗表明，將circNMT1過表達于3T3-L1細胞和水牛前體脂肪細胞中，會上調(diào)脂肪生成標記基因PPARG、C/EBPα和FABP4的表達(圖5D～F；圖6E～G，P<0.01)。從前體脂肪細胞分化為成熟的脂肪細胞涉及到復(fù)雜且高度協(xié)調(diào)的基因表達。作為脂肪細胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子PPARG和C/EBPα，會在啟動子區(qū)域的多個結(jié)合位點上合作，共同調(diào)節(jié)發(fā)育和成熟的脂肪細胞表達各種基因[41-43]。PPARG會激活編碼C/EBPα基因的啟動子，反之亦然，從而形成一個正反饋回路[2]。此外，PPARG和C/EBPα也會誘導(dǎo)參與胰島素敏感性、脂肪生成基因以及脂肪分解基因的表達，包括葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT4)、脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP4)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、單?；视土姿狨；D(zhuǎn)移酶2(AGPAT2)、perilipin、分泌因子脂聯(lián)素和瘦素[2]。通過眾多的脂肪相關(guān)基因所參與的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最終促使前體脂肪細胞分化為含有大量脂滴的成熟脂肪細胞。然而，對過表達circNMT1的前體脂肪細胞進行誘導(dǎo)分化后，相比對照組，脂滴累積極顯著增多(圖5A、B；圖6B、C，P<0.01)，表明circNMT會促進脂肪細胞的分化。

IMF是衡量牛肉品質(zhì)的重要指標[44]，牛肉的嫩度、口感、多汁性都會受到其含量的影響[45]。但水牛肉的IMF相對黃牛較低[46]。因此，充分開發(fā)水牛肉用性能，找到有效且可用于水牛肉IMF沉積改良的分子標記和關(guān)鍵調(diào)控因子至關(guān)重要。本研究結(jié)果提示，circNMT1可作為影響水牛脂肪沉積(IMF)的潛在調(diào)控因子，但參與脂肪生成的調(diào)控機制需要進一步探索。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究通過對影響脂質(zhì)代謝的候選circNMT1進行核質(zhì)定位，時空表達模式分析以及發(fā)揮功能進行探究，獲得以下結(jié)論：1)circNMT1是真實存在且穩(wěn)定表達的circRNA。2)circNMT1在水牛前體脂肪細胞的細胞核和細胞質(zhì)中均表達，且在脂肪組織和成熟的脂肪細胞中高表達。3)在3T3-L1細胞和水牛脂肪細胞，過表達circNMT1會上調(diào)成脂標志基因PPARG、C/EBPα和FABP4的表達水平。4)在3T3-L1細胞和水牛脂肪細胞，過表達circNMT1會促進脂肪細胞的脂滴累積。結(jié)果提示，circNMT1可能是水牛脂肪細胞分化的正調(diào)控因子，這為深入探究circNMT1對水牛脂肪沉積的調(diào)控機制提供了基礎(chǔ)。