牛發(fā)情特異信息素的研究進展

董智豪，張秋雪，郭冠華，段晨瑩，趙羚均，白俊艷，王 棟

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.河南科技大學動物科技學院，洛陽 471203；3.寧城縣動物疫病預防控制中心，赤峰 024200；4.山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，太谷 030801；5.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，長春 130118)

發(fā)情鑒定一直是牛場的繁殖管理重點，其準確程度是人工授精成功的前提基礎[1]。為此，研發(fā)了觀察法、直腸檢查法、陰道溫度監(jiān)測法[2]、超聲波和激素監(jiān)測法[3-4]等發(fā)情鑒定方法，這些方法有時可聯(lián)合使用，檢出率較高，但都必須依靠人力，耗時費力，也無法解決夜間發(fā)情的準確鑒定問題，而且，需要技術員有較高的技術水平和責任心；某些方法固有的侵入性，也易使動物產(chǎn)生應激，并且增加了動物受傷和病原微生物感染的風險[5]。近年來，基于加速度傳感器研發(fā)的計步器發(fā)情鑒定方法，實現(xiàn)了自動化，解決了夜間發(fā)情無人值守問題，但是，越來越多的研究表明，20%以上發(fā)情?；顒恿吭黾硬幻黠@，隱性發(fā)情使計步器發(fā)情鑒定面臨巨大挑戰(zhàn)[6]。在本交情況下，配種前，種公牛要先找出發(fā)情母牛，并嗅聞其排泄物、陰部，經(jīng)過公母牛接觸、交流，進行爬跨配種。這給人以啟示，除視覺、聽覺、觸覺刺激外，嗅覺刺激在公母牛性行為中發(fā)揮了重要作用。不同性別間通過信息素(pheromones)化學分子傳遞兩性信息的交流方式在昆蟲中普遍存在，且這些種內(nèi)信息素交流可能是生物進化的結果[7]，例如，雌性飛蛾通過性信息素吸引雄蛾完成兩性交配[8]。長角甲蟲、飛蛾等農(nóng)業(yè)害蟲的信息素被人類破解后，被用于這些害蟲的生物防治[9-12]。信息素與昆蟲繁殖和社會行為息息相關[13]。同樣，信息素在哺乳動物繁殖中也發(fā)揮了重要作用[14-17]，公牛嗅聞母牛排泄物及母牛陰部，也是因為受到其中信息素化學成分的刺激[18]。目前，關于牛信息素的研究為揭示公母牛的性交流提供了重要信息[19-23]，也為母牛發(fā)情監(jiān)測技術的研發(fā)開辟了新思路。為此，本文將對母牛信息素相關研究進行綜述，希望通過研究發(fā)情牛信息素交流規(guī)律，為及時、準確、無侵入式的母牛發(fā)情鑒定技術研發(fā)，提供重要參考。

研究表明，哺乳動物尿液、糞便、陰道分泌物、唾液都含有信息素，汗腺等專門的氣味腺也是其主要的釋放部位[17, 24]，同類動物主嗅覺系統(tǒng)(main olfactory system, MOS)與犁鼻系統(tǒng)(vomeronasal system, VNS)可接收相應信息素，并獲取相關信息[25-26]。這些信息素中，與動物繁殖和性吸引相關的化學信號也被稱為性信息素。當公牛嗅聞到發(fā)情母牛性信息素時，會產(chǎn)生上唇持續(xù)翻起的性嗅反射行為(Flehmen)，以及重復性爬跨行為[27]，為此，一些研究用公牛的這兩種反應驗證相關性信息素[20-21, 28]。很多研究在奶牛糞便、尿液等排泄物及陰道液、唾液和牛奶等分泌物中發(fā)現(xiàn)了一些發(fā)情特異性信息素[19-20, 22, 28-29]。這些研究結果可能有助于發(fā)情監(jiān)測方法的創(chuàng)新研發(fā)。

1 糞便信息素

動物排出的糞便有時會攜帶影響同種動物行為的特異性化合物(包括揮發(fā)性和非揮發(fā)性的)[30-32]。例如，母馬糞便含有發(fā)情特異性化合物十四烷酸和十六烷酸，研究表明，這兩種化合物可作為信息素吸引公馬與母馬交配[33]；讓雄性大鼠嗅聞發(fā)情雌性大鼠、狐貍及母馬糞便，可引起雄性大鼠陰莖勃起，有趣的是，當聞到發(fā)情狐貍糞便時，雄性大鼠不但陰莖勃起，還呈現(xiàn)出瑟瑟發(fā)抖的恐懼狀態(tài)，說明性欲刺激和危險信號并存時，大鼠會受到性欲的支配[34]；在母豬糞便中含有甲基吲哚和十四烷酸，可以作為母性信號吸引仔豬，并減少仔豬間打斗，改善保育效果[35]。同樣，Sankar和Archunan[20]在娟姍(Jersey)奶牛糞便中發(fā)現(xiàn)10種反映發(fā)情狀態(tài)的化合物，其中，丁酸、戊酸、羧酸、2-丙烯酯只存在于發(fā)情前期糞便中，乙酸、丙酸和1-碘十一烷只被發(fā)現(xiàn)于發(fā)情期，而丁烷、3-己醇、膦酸只被發(fā)現(xiàn)于發(fā)情后期，通過公牛驗證，發(fā)現(xiàn)發(fā)情期獨有的3種化合物(乙酸、丙酸和1-碘十一烷)可能是引起公牛性嗅反射、爬跨等性行為的原因之一，并且，用這3種化合物組合處理臺牛比單獨用某一種成分處理臺牛更容易使種公牛產(chǎn)生性嗅反射和爬跨反應。但Mozūraitis等[36]并沒有在同期發(fā)情處理荷斯坦奶牛糞便中檢測出1-碘十一烷，乙酸、丙酸也不是發(fā)情期特有，只是在發(fā)情期有一個峰值。兩者研究差異很大，推斷可能是奶牛品種和采樣方法差異(前者是乙醚萃取，后者是固相微萃取)導致的。Mozūraitis等[36]針對發(fā)情奶牛糞便中乙酸、丙酸兩種信息素，結合傳感器技術，與Wiegerinck等[37]合作開發(fā)出電子鼻，進行母牛自動化發(fā)情鑒定，但發(fā)情檢出率僅為70%。此外，Manikkaraja等[38]基于L-酪氨酸功能化銀納米離子開發(fā)了奶牛發(fā)情鑒定技術，利用預處理銀納米離子遇到乙酸或丙酸時由黃色變成紅棕色的現(xiàn)象，通過顏色變化進行發(fā)情鑒定。而對莫拉水牛的研究發(fā)現(xiàn)，4-甲基苯酚和反式戊烯醇為發(fā)情水牛糞便所特有，而十一烷僅不存在于發(fā)情期，或許可單獨或與發(fā)情特異化合物聯(lián)合進行發(fā)情預測[21]。分析上述研究結果，不同品種(如澤西奶牛和荷斯坦奶牛)發(fā)情牛糞便信息素組成相似，但不同屬(奶牛和水牛)發(fā)情期牛糞便信息素差別極大，表明糞便信息素有一定種屬特異性。此外，還從發(fā)情階段各個時期的糞便中檢測到孕酮、類固醇等非揮發(fā)性化合物，這些物質不同時期的含量差異一定程度上也反映了動物的發(fā)情階段特征[39-40]。因此，糞便化學物質尤其是發(fā)情期特異性化合物的檢測，為奶牛發(fā)情鑒定方法研發(fā)開辟了新思路，Sankar和Archunan[20]及Mozūraitis等[36]對奶牛的鑒定結果雖然不太理想，但證明了通過糞便發(fā)情信息素檢測進行發(fā)情鑒定的可行性，然而，目前對母牛糞便中發(fā)情期特異性信息素的檢測尚存爭議，還缺乏權威、科學的分析結果，只有系統(tǒng)科學地揭示母牛糞便的發(fā)情特異性信息素，才能利用這些生命奧秘服務于母牛發(fā)情鑒定技術研發(fā)。

2 唾液信息素

唾液是一種含有無機鹽、脂肪酸、蛋白質等多種分泌物成分的生物體液[41-44]，成分的復雜性賦予了其復雜的功能，尤其是發(fā)情動物唾液的一些特定化合物在動物繁殖過程中發(fā)揮了化學信號(信息素)作用，對其繁殖和社會行為產(chǎn)生了重要影響。對蒙古沙鼠的研究表明，與非發(fā)情雌鼠唾液相比，有性經(jīng)驗的雄鼠更喜歡發(fā)情雌鼠的唾液，說明雌鼠唾液中性信息素對雄鼠有較強的性引誘作用[45-46]。公豬唾液中也檢測到性信息素，并被用于誘導母豬發(fā)情[47]。Sankar等[28]發(fā)現(xiàn)，發(fā)情前期奶牛唾液含有碳酸、二氯化膦、丁酸和2-丙烯酯，發(fā)情期含有三甲胺、乙酸、丙酸、戊酸和4-丙基苯酚，發(fā)情后期含有3-己醇、丁酸、2-丙烯酯和戊酸，用公牛驗證后發(fā)現(xiàn)，不同于丁酸和2-丙烯酯，用三甲胺、乙酸、丙酸、戊酸、4-丙基苯酚處理臺牛，可引起公牛更多性嗅反射反應和爬跨次數(shù)，其中，對三甲胺的反應效果極顯著高于其他化合物，而對戊酸的反應效果最不明顯。三甲胺等對公牛引誘效果明顯的化合物，值得進一步研究。Muthukumar等[48]在發(fā)情水牛唾液中檢測到27種蛋白質，其中β-烯醇酶和TOLL樣受體4(TLR4)在發(fā)情期階段特異表達，可作為發(fā)情特異性標記物。Shashikumar等[49]發(fā)現(xiàn),Cullin相關 NEDD8 解離蛋白 1(cullin associated NEDD8-dissociated protein 1)、熱休克蛋白 1A(70 ku)、Ⅰ型17-β-羥基類固醇脫氫酶、抑制素βA 鏈、睪丸素等唾液蛋白是發(fā)情特異性的。唾液是一種反映身體生理和生化變化的診斷介質，還可用于評估內(nèi)分泌功能，反映激素循環(huán)水平[50-52]，研究唾液中的發(fā)情特異性物質，對于發(fā)情鑒定方法研發(fā)具有重要意義，但是，不同于公、母豬，生產(chǎn)中很少發(fā)現(xiàn)公、母牛通過唾液進行交流，可能不同體液在不同物種中作用大小有差異。

3 尿液信息素

哺乳動物尿液含有尿酸、尿素、蛋白質[53]等非揮發(fā)性物質及短鏈脂肪酸等揮發(fā)性和半揮發(fā)性物質[54-56]，也含有一些同種動物間信號交流分子即信息素。研究表明，白足鼠(Peromyscusleucopus)群體中成年雌鼠尿液能抑制幼齡雌鼠性成熟[57]；而發(fā)情雌性鼠尿液能促進幼齡小鼠性成熟，但同時用發(fā)情鼠、懷孕鼠和哺乳期鼠尿液處理幼齡小鼠卻沒有這種作用[58]。推斷尿液可能是哺乳動物發(fā)情信息交流的一種重要途徑。這些發(fā)情特異性信息素在尿蛋白配體承載下，進行化學信號傳遞[59]，發(fā)情雌小鼠尿液中較高的蛋白排泄量表明，同種異性個體間信息交流具有重要作用，是發(fā)情期雌鼠對雄鼠產(chǎn)生強烈性吸引的重要途徑，推測，尿液的信息素成分對于小鼠繁殖不可或缺。

受小鼠研究啟發(fā)，牛尿液信息素研究也取得重要進展。Kumar等[19]在奶牛尿液中檢測到了7種化學物質，其中，鄰苯二甲酸二丙酯和1-碘十一烷僅存在于奶牛發(fā)情期，其后續(xù)Archunan[60]研究表明，奶牛尿液中的1-碘十一烷可作為發(fā)情特異標志物。針對一種歐洲蠅類可區(qū)分瑞典紅牛和瑞典荷斯坦奶牛黃體期和發(fā)情期尿液現(xiàn)象，進行的尿液成分檢測表明，發(fā)情期尿液中1-十六醇的含量(5.49±0.89)ng·μL-1顯著高于黃體期尿液(1.86±0.36)ng·μL-1，由此推斷，1-十六醇可能也是發(fā)情母牛分泌的信息素[61]。Rajanarayanan和Archunan[62]及Samuthirapandi等[63]研究了正常發(fā)情和同步發(fā)情水牛的尿液成分，檢測出4-甲基苯酚、9-十八碳烯酸為發(fā)情牛尿液特有；并且，基于4-甲基苯酚開發(fā)出發(fā)情檢測試劑盒，向該試劑盒加入發(fā)情期尿液時無顏色變化，加入發(fā)情前期尿液時尿液顏色變粉色，而加入發(fā)情間期尿液時顏色變深粉色[64]。盡管僅達到約60%的檢測效率，但開辟了通過尿液信息素成分檢測研發(fā)母牛發(fā)情檢測技術的重要方向。如果能深入揭示尿液中信息素成分及其存在形式，或許能推動該研究方向取得突破性進展。

4 陰道黏液信息素

發(fā)情動物陰部對同種異性動物有較強吸引力，不僅是因為性器官對視覺的感官刺激，雄性動物還表現(xiàn)出強烈的性嗅反射，說明陰道黏液中含有可刺激雄性動物性行為的信息物質，這種物質可誘引雄性動物嗅、舔發(fā)情母畜陰部，并表現(xiàn)出持續(xù)的性嗅反射行為[65]。雌性倉鼠陰道分泌物可誘引雄性倉鼠嗅聞和舔這些分泌物，并產(chǎn)生性行為[66]；狗經(jīng)過訓練后，也可通過嗅聞陰道黏液找出發(fā)情母牛，證明牛陰道黏液中存在性信息素[67]。研究表明，牛陰道黏液中除存在能吸引公、母牛的信息素外，還包含動物本身的個體氣味[65, 68]。

陰道黏液中化學物質種類、含量等的變化以及因此產(chǎn)生的黏液物理特性改變，可用來預測動物發(fā)情階段[69-70]。很多研究進行了牛陰道液的化學物質檢測，例如，Ma等[71]在發(fā)情周期各階段奶牛陰道液中均檢測到乙醛，但乙醛會在發(fā)情前0～3 d內(nèi)出現(xiàn)一個濃度峰值；Sankar和Archunan[72]研究發(fā)現(xiàn)，三甲胺、乙酸、丙酸為發(fā)情期母牛陰道液所特有，可促進公牛產(chǎn)生性行為；Pluta等[73]發(fā)現(xiàn)，小母牛陰道黏液中存在 47 種揮發(fā)性有機物(volatile organic compounds，VOC)，其中豐度較高的2-丁酮、丙酮、2-戊酮、4-甲基 2-戊酮、1-(1-甲基乙氧基)-2-丙酮、乙醇、2-甲基-2-丙醇和2-丁醇等物質的含量在發(fā)情開始后 24～47 h之間達到峰值(排卵發(fā)生在發(fā)情開始后((26.6±5.6)h)。研究還表明，經(jīng)PGF2α同期發(fā)情誘導后，嗅聞到發(fā)情牛陰道黏液的荷斯坦母牛同步化程度高于未嗅聞母牛[74]。與未嗅聞發(fā)情牛陰道黏液的PGF2α處理牛比，嗅聞組瑞典紅牛的血液LH濃度變化幅度更小((1.03±0.09)ng·mL-1vs.(0.87±0.09)ng·mL-1)(P=0.001)，最低濃度更高((1.79 ±0.16)ng·mL-1vs.(2.04±0.1)ng·mL-1)(P<0.001)，峰值濃度更接近((2.83±0.13)ng·mL-1vs.(2.92±0.17)ng·mL-1)(P=0.375)，受到陰道黏液信息素的影響，母牛生理活動更穩(wěn)定可靠，同步效果更好[75]，但其背后的調(diào)節(jié)機制以及參與的信息素尚需深入探索，該機制研究可能會進一步促進同期排卵效果改善，提高人工授精妊娠率。此外，Nordéus等[76]研究還顯示，嗅聞發(fā)情牛陰道黏液和尿液后，瑞典紅牛發(fā)情周期長度無明顯變化，LH濃度變化與前述結果相似，但對發(fā)情強度(陰道狀況、躁動情況、黏液狀態(tài))可能有負面影響。這一點很值得思考，處理母牛生理指標正常且穩(wěn)定，排卵一致性較好，穩(wěn)定的激素水平及神經(jīng)調(diào)節(jié)應該強化母牛發(fā)情表現(xiàn)，或至少不應影響到發(fā)情表現(xiàn)，所以，對上述對發(fā)情強度的負面影響還需進行試驗驗證。也許現(xiàn)代的集約化養(yǎng)殖，過高的養(yǎng)殖密度等導致了母牛發(fā)情抑制，甚至造成部分奶牛安靜發(fā)情。

有些研究還從牛陰道黏液中檢測到了胺類、酯類[77]、HSP70(熱休克蛋白)[78]等信息素類化合物。這些揮發(fā)性和非揮發(fā)性信息素類物質共存，對研發(fā)原創(chuàng)性發(fā)情鑒定技術具有重要指導意義。此外，陰道黏液信息素可能還與陰道微生物的種類和豐度有關，探究陰道微生物及其代謝物的變化規(guī)律對于了解動物繁殖階段可能也有重要意義[79]。

5 其它部位的信息素

除上述常見部位外，哺乳動物乳汁、皮毛、皮膚腺也是一些信息物質重要來源[24, 65, 80-81]。其中，關于皮毛信息素的報道多見于綿羊和山羊研究[82]，在奶牛上并沒有相關報道，可能是奶牛汗腺不發(fā)達，信息素分泌較少。

乳汁信息素一般具有吸引幼崽、幫助幼崽尋找母體乳房等作用[83]。但公牛嗅聞發(fā)情奶牛牛奶，性嗅反射行為持續(xù)時間((5.31±0.44)s)顯著高于嗅聞發(fā)情前、后期奶牛牛奶的持續(xù)時間((3.20±0.18)svs.(3.66±0.36)s)，推測發(fā)情牛乳汁含有吸引公牛的信息素成分[65]。不同發(fā)情階段荷斯坦奶牛、瑞士紅牛、西門塔爾奶牛和高山灰奶牛乳成分對比結果表明，各品種牛乳成分均呈現(xiàn)發(fā)情期和非發(fā)情期差異，從發(fā)情前高孕酮期到發(fā)情期，脂肪增加0.14%，其中，C14:0和C16:0下降(-0.34%和-0.48%)，C18:0和C18:1cis-9增加(0.40%和0.73%)，不飽和脂肪酸、反式脂肪酸和長鏈脂肪酸增加，而飽和脂肪酸、中鏈脂肪酸和短鏈脂肪酸下降[84]。對牛奶中脂肪酸的專門檢測表明，發(fā)情當天乙酸(P<0.001)、戊酸(P=0.016)、己酸(P<0.001)和十四烷酸(P=0.035)均顯著高于發(fā)情后第14天，而花生四烯酸濃度卻顯著降低(P=0.004)[29]，以此推斷，發(fā)情奶牛乳成分還有待深入研究，或許可基于乳汁檢測建立非侵入性發(fā)情鑒定技術。

皮膚腺信息素的報道多見于兩棲類動物相關研究[80, 85-86]，其在兩棲類動物繁殖中發(fā)揮了重要作用，而在哺乳動物中鮮見報道。Melo和Gonzlez-Mariscal[81]綜述了兔子的相關研究，異性兔子通過皮膚腺體(下頜腺、肛門腺、哈德氏腺、淚腺、包皮腺)和乳腺-乳頭復合體進行繁殖相關的信息傳遞。有研究對同期發(fā)情母牛會陰部位注射腎上腺素促進其會陰腺分泌，用公牛驗證發(fā)現(xiàn)，相比于未注射組，公牛嗅聞注射組會陰分泌物次數(shù)更多，說明會陰腺中存在對公牛具有吸引作用的信息素[87]。然而，與牛皮膚腺信息素相關的研究很少，這些分泌物中都含有什么成分，是什么成分向公牛傳遞了發(fā)情信息，這些都有待深入、系統(tǒng)的科學研究。

6 小 結

除聽覺、視覺、觸覺等感官刺激作用外，嗅覺刺激對于種公牛精準的發(fā)情鑒定至關重要，受到仿生學的啟發(fā)，人們企圖通過破譯母牛信息素，創(chuàng)新發(fā)情鑒定技術，解決目前無法突破的安靜發(fā)情產(chǎn)業(yè)瓶頸。有關母牛唾液、陰道黏液、尿液、糞便等來源的信息素研究已經(jīng)取得一定進展，為該方向研究露出了冰山一角，然而，到目前為止，公、母牛信息交流重要信息源間的關系是什么？都有什么成分，各成分是如何組合和發(fā)揮作用的？這些問題的解決還需進行更多深入、系統(tǒng)、科學的基礎研究。目前，色譜質譜分析技術、代謝組學等都取得了較快進展，生物樣品化學成分的定向測定和組學分析效率大幅提升，為不同來源母牛信息素的研究鑒定提供了更多便利條件，相信公、母牛間性交流的奧秘不久就將被揭示，并推動母牛發(fā)情鑒定技術取得突破性進展。