SIRT6通過下調(diào)CD36增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的機制研究

王婷婷，李妍，張明明，蔣國健，張東偉

急性心肌梗死在全球死因中居于首位，而不穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊是導(dǎo)致急性心肌梗死的重要誘因［1］。不穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的特點主要包括：大量的巨噬細胞演變成泡沫細胞并在斑塊中不斷聚集、斑塊中炎癥反應(yīng)的不斷加劇、脂質(zhì)壞死核心面積的持續(xù)擴大，最終斑塊破裂導(dǎo)致惡性心血管事件的發(fā)生［2］。雖然大量研究表明，動脈粥樣硬化的典型病理過程是大量吞噬氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）的泡沫細胞在內(nèi)皮下不斷聚集［1］，然而，如何有效抑制巨噬細胞對脂蛋白的攝取進而抑制泡沫細胞的形成尚不明確，因此，闡明泡沫細胞形成的病理機制、提出增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的干預(yù)策略，是目前心血管醫(yī)生亟需解決的關(guān)鍵問題。

SIRT6主要在組蛋白H3第9位賴氨酸和第56位賴氨酸脫乙酰基上發(fā)揮作用［3］，其活性異常參與了心血管疾病、癌癥和糖尿病等多種疾病的病理進程［4］。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT6能夠刺激胰島β細胞中的胰島素分泌，促進ATP的產(chǎn)生，進而促進葡萄糖代謝［5］。此外，三酰甘油（triacylglycerol，TG）的合成和脂質(zhì)代謝也與SIRT6的活性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT6基因被敲除后可以導(dǎo)致小鼠肝細胞中TG合成增加，而TG的過度積累可導(dǎo)致脂肪肝或肝脂肪變性［6］。本研究旨在通過動物實驗和細胞實驗分析SIRT6增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的機制，以期為臨床治療動脈粥樣硬化提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2019年12月至2021年12月。

1.2 實驗材料

1.2.1 實驗動物 雄性SPF級野生型C57BL小鼠10只，鼠齡8周齡，體質(zhì)量25 g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)動物中心；雄性ApoE-/-小鼠20只，鼠齡8周齡，體質(zhì)量25 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。所有小鼠飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)動物中心，SPF級環(huán)境，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在18～29 ℃；相對濕度控制在40%～70%。構(gòu)建動脈粥樣硬化模型所需要的高脂飼料成分包括15%脂肪、1.25%膽固醇、0.2%膽酸鹽。

1.2.2 實驗細胞 RAW 264.7巨噬細胞購自美國ATCC公司。

1.2.3 主要實驗試劑與儀器 ox-LDL購自廣州益源生物科技有限公司，SIRT6抗體（貨號：#8864S）、GAPDH抗體（貨號：#8864S）、CD68抗體（貨號：#26042）、CD36抗體（貨號：#14347）購自美國CST公司，二抗購自西安壯志生物科技有限公司，TUNEL試劑盒購自美國羅氏公司，小鼠麻醉用異氟烷購自河北一品制藥股份有限公司，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司，Ad-SIRT6、Ad-CD36購自上海漢恒生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物實驗

1.3.1.1 實驗動物分組及干預(yù)方法 將10只雄性C57BL小鼠作為空白對照組；將20只雄性ApoE-/-小鼠隨機分為動脈粥樣硬化組和動脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組，每組10只。采用高脂飼料喂養(yǎng)動脈粥樣硬化組和動脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組小鼠16周以構(gòu)建動脈粥樣硬化小鼠模型。持續(xù)監(jiān)測各組小鼠血脂指標(biāo)，16周后用異氟烷麻醉并處死各組小鼠，分離小鼠主動脈，通過油紅O染色發(fā)現(xiàn)小鼠動脈管腔內(nèi)形成了動脈粥樣硬化斑塊，視為造模成功。動脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組通過尾靜脈注射200 μl滴度為1×109eg/ml的腺相關(guān)病毒（adrenoassociated virus，AAV）-SIRT6，共注射3次，在1周內(nèi)完成注射，以過表達SIRT6。

1.3.1.2 HE染色檢測各組小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積干預(yù)16周后，采用異氟烷麻醉并處死小鼠，分離小鼠主動脈，取出動脈粥樣硬化斑塊組織，送病理科，包埋后制作石蠟切片，脫蠟至水，進行HE染色，梯度脫水后在顯微鏡下觀察結(jié)果，藍色代表細胞核，紅色代表細胞質(zhì)，通過Image J軟件分析動脈粥樣硬化斑塊面積［7］。

1.3.1.3 Masson染色檢測各組小鼠動脈粥樣硬化斑塊中膠原含量 干預(yù)16周后，采用異氟烷麻醉并處死小鼠，分離小鼠主動脈，取出動脈粥樣硬化斑塊組織，送病理科，包埋后制作石蠟切片，脫蠟至水，將切片置于Bouin液中固定10～15 min，用Harris蘇木素染色4～5 min，流水下沖洗2 min，進而在0.5%鹽酸酒精中分化10～30 s，繼續(xù)流水沖洗5 min，用Masson復(fù)合染色液染色4～5 min，0.2%醋酸水溶液沖洗，5%磷鉬酸分化5～10 min，0.2%醋酸水溶液沖洗，2%苯胺藍染色液復(fù)染10～30 s，經(jīng)無水乙醇脫水后用甘油封固。顯微鏡下采集圖像，藍色代表膠原纖維，紅色代表肌纖維、纖維素和紅細胞，用Image J軟件分析膠原含量。

1.3.1.4 免疫組化染色檢測各組小鼠動脈粥樣硬化斑塊中CD68表達水平 干預(yù)16周后，采用異氟烷麻醉并處死小鼠，分離小鼠主動脈，取出動脈粥樣硬化斑塊組織，送病理科，包埋后制作石蠟切片，脫蠟至水，進行抗原修復(fù)，用3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后用山羊血清進行封閉，加1∶100稀釋的一抗CD68，4 ℃孵育過夜后滴加與一抗種屬相對應(yīng)的二抗，室溫下孵育60 min；滴加新鮮配制的DAB顯色液，棕黃色區(qū)域為CD68陽性表達；復(fù)染細胞核后用中性樹膠封固；顯微鏡下觀察到細胞核在蘇木素的染色下變成藍色。計算棕黃色區(qū)域占比，即CD68表達水平。

1.3.2 細胞實驗

1.3.2.1 細胞培養(yǎng) 將RAW 264.7巨噬細胞置于含15%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為消毒滅菌細胞孵箱（37 ℃，含5% CO2，濕度95%），24 h后觀察貼壁細胞情況，培養(yǎng)基渾濁后及時更換新鮮培養(yǎng)基。

1.3.2.2 Western blotting法檢測巨噬細胞中SIRT6、CD36表達水平 取對數(shù)生長期的巨噬細胞，將其分為空白對照組、ox-LDL組（采用50 μg/ml的ox-LDL干預(yù)24 h［7］）、ox-LDL+Ad-SIRT6組（轉(zhuǎn)導(dǎo)腺病毒Ad-SIRT6 24 h，用50 μg/ml的ox-LDL干預(yù)24 h）。用PBS洗滌各組巨噬細胞并充分消化，提取蛋白后按照操作流程進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。提前按1∶100配好SIRT6、CD36、GAPDH抗體；脫脂奶粉封閉后于4 ℃冰箱中過夜進行一抗孵育，滴加山羊抗兔IgG抗體孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光法利用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)檢測各組巨噬細胞中SIRT6、CD36表達水平。實驗獨立重復(fù)3次。

1.3.2.3 TUNEL染色檢測巨噬細胞凋亡率 取對數(shù)生長期的巨噬細胞，將其分為空白對照組、ox-LDL組（采用50 μg/ml的ox-LDL干預(yù)24 h［7］）、ox-LDL+Ad-SIRT6組（轉(zhuǎn)導(dǎo)腺病毒Ad-SIRT6 24 h，用50 μg/ml的ox-LDL干預(yù)24 h）、ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組（轉(zhuǎn)導(dǎo)腺病毒Ad-SIRT6 24 h，轉(zhuǎn)導(dǎo)腺病毒Ad-CD36 24 h，用50 μg/ml的ox-LDL干預(yù)24 h）。采用TUNEL試劑盒檢測巨噬細胞凋亡率，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。使用終濃度為100 ng/ml的DAPI染液對細胞染色10 min，流水沖去染液，加1滴熒光封片液，凋亡的巨噬細胞在共聚焦顯微鏡下表現(xiàn)為綠色熒光，細胞核在共聚焦顯微鏡下表現(xiàn)為藍色熒光。計算巨噬細胞凋亡率。實驗獨立重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad Prism 6.0進行統(tǒng)計分析。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積 空白對照組小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積為0。動脈粥樣硬化組小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積為（43.0±8.6）%，高于動脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組的（13.2±2.6）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.489，P＜0.001），見圖1。

圖1 HE染色檢測空白對照組、動脈粥樣硬化組、動脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積Figure 1 Area of atherosclerotic plaques detected by HE staining in blank control group，atherosclerosis group and atherosclerosis+SIRT6 Tg group

2.2 小鼠動脈粥樣硬化斑塊中膠原含量 空白對照組小鼠動脈粥樣硬化斑塊中膠原含量為0。動脈粥樣硬化組小鼠動脈粥樣硬化斑塊中膠原含量為（7.4±1.2）%，低于動脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組的（10.8±0.2）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.838，P＜0.001），見圖2。

圖2 Masson染色檢測空白對照組、動脈粥樣硬化組、動脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組小鼠動脈粥樣硬化斑塊中膠原含量Figure 2 Collagen content in atherosclerotic plaques detected by Masson staining in blank control group，atherosclerosis group and atherosclerosis+SIRT6 Tg group

2.3 小鼠動脈粥樣硬化斑塊中CD68表達水平 空白對照組小鼠動脈粥樣硬化斑塊中CD68表達水平為0。動脈粥樣硬化組小鼠動脈粥樣硬化斑塊中CD68表達水平為（42.3±8.4）%，高于動脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組的（23.8±4.5）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.139，P＜0.001），見圖3。

圖3 免疫組化染色檢測空白對照組、動脈粥樣硬化組、動脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組小鼠動脈粥樣硬化斑塊中CD68表達水平（×400）Figure 3 CD68 expression level in atherosclerotic plaques of mice detected by immunohistochemical staining in blank control group，atherosclerosis group，and atherosclerosis+SIRT6 Tg group

2.4 巨噬細胞中SIRT6、CD36表達水平 空白對照組、ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組巨噬細胞中SIRT6、CD36表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組巨噬細胞中SIRT6表達水平低于空白對照組，CD36表達水平高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；ox-LDL+Ad-SIRT6組巨噬細胞中SIRT6表達水平高于ox-LDL組，CD36表達水平低于ox-LDL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖4。

圖4 Western blotting法檢測空白對照組、ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組巨噬細胞中SIRT6、CD36表達水平Figure 4 Expression levels of SIRT6 and CD36 in macrophages detected by Western blotting method in blank control group，ox-LDL group and ox-LDL+Ad-SIRT6 group

表1 空白對照組、ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組巨噬細胞中SIRT6、CD36表達水平比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of SIRT6 and CD36 expression levels in macrophages in blank control group，ox-LDL group and ox-LDL+Ad-SIRT6 group

表1 空白對照組、ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組巨噬細胞中SIRT6、CD36表達水平比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of SIRT6 and CD36 expression levels in macrophages in blank control group，ox-LDL group and ox-LDL+Ad-SIRT6 group

注：ox-LDL=氧化低密度脂蛋白；a表示與空白對照組比較，P＜0.05；b表示與ox-LDL組比較，P＜0.05

組別 SIRT6 CD36空白對照組 1.000±0.018 1.000±0.023 ox-LDL組 0.464±0.042a 4.685±0.108a ox-LDL+Ad-SIRT6組 0.677±0.015ab 3.144±0.566ab F值 283.394 92.696 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.5 巨噬細胞凋亡率 空白對照組、ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組、ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組巨噬細胞凋亡率分別為（10.00±2.22）%、（7 8.0 0±9.3 6）%、（2 4.0 0±4.8 0）%、（40.00±5.60）%。空白對照組、ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組、ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組巨噬細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=70.340，P＜0.001）。ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組、ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組巨噬細胞凋亡率高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為12.240、4.585、8.626，P值分別為＜0.001、0.010、＜0.001）；ox-LDL+Ad-SIRT6組、ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組巨噬細胞凋亡率低于ox-LDL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為8.892、6.034，P值均＜0.001）；ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組巨噬細胞凋亡率高于ox-LDL+Ad-SIRT6組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.757，P=0.020），見圖5。

圖5 TUNEL染色檢測空白對照組、ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組、ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組巨噬細胞凋亡率（×200）Figure 5 Apoptosis rate of macrophages detected by TUNEL staining in blank control group，ox-LDL group，ox-LDL+Ad-SIRT6 group and ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36 group

3 討論

不穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的形成是導(dǎo)致急性心血管事件的主要原因，而大量泡沫細胞的形成在不穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的病程進展中扮演重要角色［8］。大量泡沫細胞的聚集可加劇斑塊中的炎癥反應(yīng)、促進斑塊中新生血管形成，隨著泡沫細胞的不斷聚集并且發(fā)生凋亡和壞死，斑塊中表現(xiàn)為大量脂質(zhì)池和壞死核心的形成［9］，最終導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定性［10］。泡沫細胞主要是由巨噬細胞不斷攝取ox-LDL形成的，而這一重要病理過程主要受清道夫受體諸如凝集素樣ox-LDL受體1、CD36或清道夫受體A的調(diào)節(jié)［11］。在這些關(guān)鍵受體中，CD36在泡沫細胞的形成中起主要作用［12］。據(jù)報道，干預(yù)CD36的表達可抑制巨噬細胞對ox-LDL的攝取，沉默巨噬細胞的CD36基因其對ox-LDL的結(jié)合能力明顯下降［13］。綜上，CD36在巨噬細胞攝取ox-LDL進而在泡沫細胞的形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。既往研究表明，SIRT6可以通過調(diào)控炎癥、葡萄糖和脂質(zhì)代謝來參與心血管疾病和癌癥的病理進程，其可以有效防止心肌細胞肥大，抑制心力衰竭的發(fā)生；此外，SIRT6還可以維持內(nèi)皮細胞的正常功能，從而延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展［14-15］。然而，SIRT6是否通過調(diào)控CD36來增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性目前尚無相關(guān)研究?；诖?，本研究旨在通過動物實驗和細胞實驗分析SIRT6增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的機制。

本研究動物實驗結(jié)果顯示，動脈粥樣硬化組小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積高于動脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組，動脈粥樣硬化斑塊中膠原含量低于動脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組，動脈粥樣硬化斑塊中CD68表達水平高于動脈粥樣硬化+SIRT6 Tg組，提示過表達SIRT6能夠縮小ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積，增加動脈粥樣硬化斑塊中的膠原含量及減少動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞的浸潤，從而增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性。本研究細胞實驗結(jié)果顯示，ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組巨噬細胞中SIRT6表達水平低于空白對照組，CD36表達水平高于空白對照組，提示SIRT6/CD36信號通路參與了泡沫細胞形成。ox-LDL+Ad-SIRT6組巨噬細胞中SIRT6表達水平高于ox-LDL組，CD36表達水平低于ox-LDL組；提示過表達SIRT6可下調(diào)CD36的表達水平，進而抑制泡沫細胞形成。ox-LDL組、ox-LDL+Ad-SIRT6組、ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組巨噬細胞凋亡率高于空白對照組，ox-LDL+Ad-SIRT6組、ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組巨噬細胞凋亡率低于ox-LDL組，ox-LDL+Ad-SIRT6+Ad-CD36組巨噬細胞凋亡率高于ox-LDL+Ad-SIRT6組，提示過表達SIRT6能夠降低巨噬細胞凋亡率，而過表達CD36可減弱SIRT6對巨噬細胞凋亡的抑制作用。由此推測，SIRT6通過下調(diào)CD36的表達水平來抑制巨噬細胞的凋亡。

綜上所述，SIRT6能夠縮小ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積，增加動脈粥樣硬化斑塊中膠原含量，減少動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞的浸潤，抑制巨噬細胞凋亡，從而增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性，而這一作用是通過下調(diào)CD36的表達水平來實現(xiàn)的。本研究為臨床通過干預(yù)SIRT6/CD36信號通路來治療不穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊提供了實驗依據(jù)，為減少急性心血管事件的發(fā)生提供了新的治療方案。但本研究尚存在一定局限性：首先，多種機制如炎癥反應(yīng)、自噬均參與了動脈粥樣硬化的病程進展，SIRT6通過何種機制調(diào)控CD36，進而抑制泡沫細胞形成，增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性，目前還不得而知；此外，SIRT6/CD36信號通路是否通過調(diào)控線粒體動力學(xué)，促進線粒體融合，進一步促進巨噬細胞中脂質(zhì)代謝，這些還有待進一步研究。

作者貢獻：王婷婷、張東偉進行研究的構(gòu)思與設(shè)計、可行性分析及文章的撰寫，負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責(zé)、監(jiān)督管理；王婷婷、李妍負責(zé)文章修改；張明明負責(zé)結(jié)果分析、圖片整理；蔣國健負責(zé)文獻資料收集。

本文無利益沖突。