非小細胞肺癌組織中miR-371-5p、miR-452、miR-5100、LZTS1表達水平及臨床意義

李 雪 朱亞芯 雷立鋒 胡會杰

在臨床中，肺癌為常見的一種惡性腫瘤，在惡性腫瘤病死率中居于首位，其中非小細胞肺癌占肺癌的80%[1]。非小細胞肺癌有大細胞癌、腺癌、鱗癌，有較緩慢的癌細胞分裂生長、較晚轉(zhuǎn)移擴散的特點，所以，雖然醫(yī)療科技已經(jīng)非常發(fā)達，但是依然存在約75%的病患于發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)為中晚期，5年生存率極低[2]。微小RNA(miRNA)屬于非編碼序列，有高度保守性，長度往往有18～24個核苷酸，它由RNA聚合酶Ⅲ與RNA聚合酶Ⅱ自身的基因或連接于內(nèi)～外顯子、外顯子、內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄為原始miRNA[3]。通過細胞核的DGCR8與Drosha實施處理之后，結(jié)合靶基因mRNA之3'UTR或5' UTR，對翻譯mRNA進行抑制或使其降解[4]。大量的證據(jù)顯示，對于不一樣的腫瘤類型，miRNA有特異性，它的表達譜能夠?qū)δ[瘤組織及正常組織進行區(qū)分[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，抑癌基因亮氨酸拉鏈腫瘤抑制基因1(LZTS1)在肺癌組織內(nèi)有表達異常的狀況[6]。基于此，本研究對非小細胞肺癌組織中miR-371-5p、miR-452、miR-5100、LZTS1表達水平及臨床意義進行探討?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年6月到2020年12月在我院治療的非小細胞肺癌患者100例為研究對象。男性53例，女性47例；年齡25～76歲，平均(53.75±7.26)歲；鱗癌60例，腺癌40例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例，沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例；吸煙64例，不吸煙36例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期61例。

1.2 實驗方法

將通過病理確診的非小細胞肺癌病患的癌組織與癌旁正常組織在液氮罐中放置，然后保存于-80℃的冰箱中，檢測時從冰箱中取出，于液氮環(huán)境下研磨，選擇TRIzol法對標本中的總RNA進行抽提。使用實時熒光定量法(qRT-PCR)對miR-371-5p、LZTS1進行檢測，使用實時聚合酶鏈反應(PCR)對miR-452、miR-5100進行檢測。

1.2.1 miR-371-5p、LZTS1檢測 選擇紫外分光光度計(Nano-Drop 2000C)對RNA濃度、純度測定，A260與A280比值介于1.6～2.0者選取實施下一步；對逆轉(zhuǎn)錄體系進行配置,把總的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cD-NA；按照qRT-PCR的擴增反應試劑盒擴增、檢測cDNA，LZTS1、miR-371-5p以GAPDH、U6為內(nèi)參，它們相應的引物序列為：LZTS1正義鏈5'ACGGGCTGCTGAG-GTTTGG3'，反義鏈：5' GGGCTTTCTGGCTGACCTT-GAT3'；GAPDH 正義鏈5' GTGAAGGTCGGAGTCG-GAGTCAACGG3'，反義鏈:5' CCTGGAAGATGGT-GATGGGA3'。miR-371-5p正義鏈:5'GATCGCCGC-CTTGCCGCATCC3'，反義鏈:5' GAGACATCGTGG-TAGACTTT3'；U6正義鏈：5'GAGTACATCTTCAAGC-CATCCTG3'，反義鏈：5' TGCTCTATCTTTCTTTG-GTCTGC3'。LZTS1、miR-371-5p計算相對表達量選擇2-△△Ct。

1.2.2 miR-452、miR-5100檢測 95℃反應條件，10 min預變性，15 s變性，60℃退火1 min，循環(huán)45個。miR-452正向引物5'-GCGCAACTGTTTGCAGAG-3'，反向引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。miR-5100正向引物5'-TGGCTCTGCCTTTATTCCCTAGT-3'，反向引物5'-AAATAAGGTGCTTTGGGAATCTGT-3'。U6正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。內(nèi)參為U6，miR-452、miR-5100計算相對表達量選擇2-△△Ct。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織與癌旁正常組織中miR-371-5p、miR-452、miR-5100、LZTS1的表達水平

肺癌組織中miR-371-5p、miR-452、LZTS1水平明顯低于癌旁正常組織，miR-5100水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 肺癌組織與癌旁正常組織中miR-371-5p、miR-452、miR-5100、LZTS1的表達水平比較

2.2 癌組織中miR-371-5p、miR-452、miR-5100、LZTS1表達水平與臨床病理特征的關(guān)系

在非小細胞肺癌組織中miR-371-5p、miR-452、miR-5100、LZTS1都以相對表達水平的均值作為界限，小于平均值為低表達組，大于平均值為高表達組。miR-371-5p、miR-452、miR-5100、LZTS1低表達組分別有51、47、50、53例。非小細胞肺癌組織中miR-371-5p、LZTS1表達水平與年齡、吸煙、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)；miR-452表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型顯著相關(guān)(P<0.05)；miR-5100表達水平同TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 癌組織miR-371-5p、miR-452、miR-5100、LZTS1表達水平與臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

3 討論

惡性腫瘤的所有病患中，發(fā)生肺癌的幾率及由肺癌致死的幾率都是最高的，外科手術(shù)是治療肺癌的主要方式[7]。然而，TNM分期屬于Ⅰ期同時沒有轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)的病患在進行腔鏡下肺癌完全性切除術(shù)或開胸肺癌根治術(shù)后，依然會有25%～30%的病患復發(fā)[8]。所以，更進一步研究肺癌的轉(zhuǎn)移及侵襲機制，對于尋找有效的治療與診斷肺癌的靶點及改善肺癌病患預后都有非常重要的意義。

分子檢測技術(shù)在近幾年得到了大力發(fā)展，所以對microRNAs等基因的功能研究也取得了重要成果[9]。雖然microRNAs為不進行編碼的蛋白質(zhì)，然而它能夠同mRNA靶基因的3'UTR進行配對對蛋白質(zhì)的翻譯作用進行抑制或直接對mRNA進行降解，在靶基因中發(fā)揮負性調(diào)控作用[10]。microRNAs能夠?qū)C體細胞的數(shù)種生理進程如細胞分化、增殖、發(fā)育、凋亡等進行廣泛的參與，在卵巢癌、血液腫瘤、乳腺癌、非小細胞肺癌、食管鱗癌、胰腺癌等惡性腫瘤中能夠作為早期的診斷指標，聯(lián)合數(shù)種miRNA進行檢測亦或是同血清學、影像學等輔助手段進行聯(lián)合檢測，能夠有效提升早期診治腫瘤特異度、靈敏度[11]。

有文獻顯示，在結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌中miR-371-5p的表達水平不正常，能夠動態(tài)監(jiān)測消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，能夠作為生物學標志物[12-13]。本研究的結(jié)果說明miR-371-5p有可能對非小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程產(chǎn)生影響并進行參與。

相關(guān)文獻證實，在惡性腫瘤中miR-452一方面能夠起到促癌基因作用，另一方面又能起到抑癌基因作用，如于乳腺癌病患體內(nèi)，miR-452有較高水平，但是于食管癌病患體內(nèi)，miR-452有較低水平[14-15]。本研究中與正常癌旁組織比較，miR-452于癌組織內(nèi)水平較低，這可以說明miR-452低水平對形成非小細胞肺癌有促進作用，它在非小細胞肺癌內(nèi)起到抑癌基因作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，miR-452低表達同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型相關(guān)，這說明miR-452低水平能夠?qū)δ[瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及增殖過程發(fā)揮促進作用。

相關(guān)研究顯示，胰腺癌細胞內(nèi)，miR-5100增加外源性表達能夠使細胞侵襲遷移及增殖得到抑制，于肺癌細胞株與組織內(nèi)miR-5100表達增加，同時miR-5100能使細胞增殖，所以，miR-5100兼具抑癌基因與促癌基因作用[16-17]。本研究結(jié)果顯示同正常癌旁組織比較，miR-5100于癌組織內(nèi)水平較高，起到促癌作用。于肺上皮細胞內(nèi)，Smad2/3能夠被miR-5100激活，對細胞出現(xiàn)EMT發(fā)揮促進作用，目前miR-5100于非小細胞癌內(nèi)的作用機制還不清楚[18]。

在各種細胞質(zhì)、正常組織中，LZTS1均有表達，然而于數(shù)種惡性腫瘤內(nèi)表達不正常，LZTS1于肺癌內(nèi)表達不正常，是受到了miR-135b的調(diào)控，它在激發(fā)肺癌中可能起到了一定的作用[19-20]。本研究結(jié)果說明LZTS1在非小細胞肺癌中可能發(fā)揮重要作用。

綜上所述，非小細胞肺癌組織中miR-371-5p、miR-452、LZTS1均為低表達，miR-5100為高表達。癌組織中miR-371-5p、LZTS1表達水平與年齡、吸煙、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)，miR-452同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型顯著相關(guān)，miR-5100同TNM分期顯著相關(guān)，故miR-371-5p、miR-452、miR-5100、LZTS1都有可能參與非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展。