微核檢測(cè)在辣條食用安全性評(píng)估中的應(yīng)用*

趙 昕，陳宣齊，張燕翔，李雅軒**

（1.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048；2.北京市第十中學(xué)，北京 100072；3.首都師范大學(xué)初等教育學(xué)院，北京 100048）

0 引 言

微核（micronucleus，MCN）是細(xì)胞在分裂間期表現(xiàn)出的一種畸變類型，是環(huán)境因素的作用下，引起真核生物細(xì)胞的染色體斷裂或整條染色體移動(dòng)異常，導(dǎo)致細(xì)胞分裂后期沒(méi)有進(jìn)入子核中而產(chǎn)生的獨(dú)立于主核之外的微小核結(jié)構(gòu)[1].微核在細(xì)胞分裂間期的形狀多與主核形狀類似，大小約為主核大小的1/10～1/3，靠近主核，其染色性質(zhì)與主核相類似.一般情況下，微核自發(fā)發(fā)生率很低，故可作為檢測(cè)環(huán)境因素對(duì)遺傳物質(zhì)影響效果的指標(biāo)，即通過(guò)微核檢測(cè)研究環(huán)境因素的安全性，建立微核檢測(cè)技術(shù)[1-3].目前，微核檢測(cè)已成為毒理性檢測(cè)與評(píng)定的常規(guī)方法[4-7].

微核試驗(yàn)（micronucleus test，MNT）以動(dòng)物的骨髓細(xì)胞或外周血淋巴細(xì)胞、蠶豆等為研究對(duì)象，探究環(huán)境因素的毒理作用，且隨著生物技術(shù)的發(fā)展，其應(yīng)用范疇已從體內(nèi)檢測(cè)拓展到體外檢測(cè)[8-10].王映雪[11]、儀慧蘭和孟紫強(qiáng)[12]分別以蠶豆（Vicia faba）根尖進(jìn)行微核檢測(cè)，表明植物微核檢測(cè)方法與動(dòng)物學(xué)檢測(cè)方法具有高度一致性，且具有材料易得、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單和實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)勢(shì)；張麗霞等[5]比較了單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)和蠶豆根尖微核檢測(cè)技術(shù)，證明二者研究結(jié)果一致，且由于蠶豆根尖微核檢測(cè)技術(shù)在實(shí)驗(yàn)上的便捷性，該技術(shù)已成為對(duì)待測(cè)因素進(jìn)行遺傳毒理性分析的常用方法；劉增禹和蔡文國(guó)[6]利用微核檢測(cè)技術(shù)，表明某品牌方便面調(diào)料對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞存在遺傳毒理性；李藝等[13]利用微核檢測(cè)技術(shù)，表明杏鮑菇（Pleurotus eryugii）提取液有效降低了微核出現(xiàn)的比率；李雅軒等[14]在對(duì)有機(jī)硒粉的研究中，證實(shí)適當(dāng)濃度的有機(jī)硒粉對(duì)NaNO2所導(dǎo)致的染色體損傷具有拮抗作用，可以有效降低染色體損傷，并且具有劑量效應(yīng).以上研究結(jié)果表明，微核檢測(cè)方法是對(duì)食品安全性進(jìn)行評(píng)估的有效方法.

辣條是一種以谷物或豆類為主要原料的常見(jiàn)小零食，目前沒(méi)有統(tǒng)一的制作標(biāo)準(zhǔn)，其制作中會(huì)添加甜味劑、增味劑、乳化劑和防腐劑等食品添加劑，有些辣條甚至含有20余種食品添加劑.由于辣條的購(gòu)買成本低和經(jīng)銷商的花式營(yíng)銷手段，使得其深受青少年們的喜愛(ài)[15-19].雖然國(guó)家有相關(guān)規(guī)定限制各類食品添加劑的使用量[20-21]，但是當(dāng)多種食品添加劑疊加使用時(shí)，其食品安全性還需要進(jìn)一步確認(rèn).目前尚沒(méi)有類似研究的報(bào)告，本文以蠶豆根尖為研究對(duì)象，通過(guò)微核檢測(cè)分析辣條的食用安全性，以進(jìn)一步豐富以蠶豆為實(shí)驗(yàn)材料的遺傳毒理分析研究，希望為辣條的食品安全性評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

無(wú)水乙醇、冰醋酸和苯酚購(gòu)自北京化工有限責(zé)任公司，均為分析純；環(huán)磷酰胺購(gòu)自MACKLIN/麥克林試劑公司；品紅購(gòu)自北京Leagene/雷根生物技術(shù)有限公司.實(shí)驗(yàn)所用H2O為去離子水.

1.2 辣條提取液的制備

選擇某品牌辣條為分析對(duì)象.使用食品粉碎器粉碎辣條，取20 g加100.00 mLH2O，24℃浸泡2 h，濾紙過(guò)濾，將濾液定容至100 mL，命名為原提取液，4℃冰箱中保存.

分別取原提取液 0.25、2.50、12.50和 25.00 mL，加H2O分別稀釋至50.00 mL，得到稀釋倍數(shù)分別為200、20、4和2倍的溶液，進(jìn)行后續(xù)研究.

1.3 蠶豆根尖處理

選取美農(nóng)匯種子公司生產(chǎn)的臨蠶9號(hào)種子（青皮蠶豆）為實(shí)驗(yàn)測(cè)試用種子，要求籽粒均勻飽滿、形態(tài)大小相似.培養(yǎng)步驟：（1）將種子浸泡于H2O中24 h；（2）將膨脹后的種子轉(zhuǎn)移至鋪有雙層濕紗布和有少量H2O的白瓷盤中，24℃下繼續(xù)培養(yǎng)催根，每隔12 h換1次H2O；（3）待種子的初生根長(zhǎng)度達(dá)到2 cm左右時(shí)，選取42粒種子，隨機(jī)分為7組，分別為空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1～5組（按稀釋倍數(shù)由高到低排序），每組6粒種子；（4）分別加入50.00 mL的H2O、5 mg/L 環(huán)磷酰胺[22-23]和不同稀釋倍數(shù)（200、20、4、2和0倍）的辣條提取液，24℃培養(yǎng)蠶豆根尖6 h；（5）用H2O清洗種子和根尖3次，置于墊有雙層濕紗布的培養(yǎng)皿內(nèi)，以H2O緩苗培養(yǎng)24 h；（6）取2 cm根尖置于卡諾固定液中，固定24 h；（7）取固定后的根尖放于70%乙醇溶液中，4℃冰箱中冷藏，待測(cè).每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.4 微核分析

使用濟(jì)南騰覽儀器有限公司生產(chǎn)的Leica DM 500型顯微鏡觀察統(tǒng)計(jì)處理后根尖中的微核數(shù).以常規(guī)方法進(jìn)行制片[24]，每個(gè)蠶豆根尖觀察1 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組觀察2個(gè)根尖，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，共計(jì)觀察6 000個(gè)細(xì)胞.統(tǒng)計(jì)每個(gè)根尖具有微核的細(xì)胞數(shù)（n），計(jì)算微核率（P）和微核指數(shù)（IM），對(duì)應(yīng)計(jì)算公式為：

式中：P實(shí)和P空分別為實(shí)驗(yàn)1～5組（或?qū)φ战M）與空白組的P；IM也稱為污染指數(shù)（pollution index，PI），當(dāng) 0＜IM＜1.50為基本無(wú)遺傳毒性，1.50≤IM＜2.00為具有輕度遺傳毒性，2.00≤IM＜3.50為中度遺傳毒性，IM≥3.50為重度遺傳毒性，IM＞1.50就判定為存在致突變作用[9-10].

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以±s表示.利用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.根據(jù)微核指數(shù)判斷測(cè)試提取液的遺傳毒性，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間微核數(shù)據(jù)對(duì)比分析.利用最小二乘法構(gòu)建稀釋度的倒數(shù)與微核數(shù)的回歸方程，對(duì)回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn).P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 蠶豆根尖細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)

所有組蠶豆根尖細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)如圖1所示.空白組，根尖細(xì)胞近似為正方體，細(xì)胞核為圓形或橢圓形，形狀均勻一致；對(duì)照組，根尖細(xì)胞中可見(jiàn)明顯的細(xì)胞核變形，產(chǎn)生突出，出現(xiàn)三角形或局部銳化現(xiàn)象；實(shí)驗(yàn)1～5組，根尖細(xì)胞中均有微核出現(xiàn)，細(xì)胞核形態(tài)可見(jiàn)大量明顯變形，與對(duì)照組細(xì)胞核表現(xiàn)相類似，其中實(shí)驗(yàn)5組宏觀可見(jiàn)根尖表面顏色發(fā)暗，微觀細(xì)胞核變形更為顯著，其根尖細(xì)胞受損傷嚴(yán)重.

圖1 不同組蠶豆根尖細(xì)胞的微核結(jié)構(gòu)（a）空白組；（b）對(duì)照組；（c）實(shí)驗(yàn)1組；（d）實(shí)驗(yàn)2組；（e）實(shí)驗(yàn) 3組；（f）實(shí)驗(yàn)4組；（g）實(shí)驗(yàn) 5組

2.2 微核數(shù)據(jù)

不同組處理后蠶豆根尖細(xì)胞微核統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示.空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1～5組的微核數(shù)分別為9、39和14～30個(gè)，微核千分率分別為1.50‰±1.22‰、6.50‰±3.89‰ 和 2.33‰±1.97‰～5.00‰±2.19‰，IM分別為 1.00、4.33和 1.55～3.33.與空白組相比，實(shí)驗(yàn)1和5組的微核率有所增加，但結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)2～4組的微核率顯著增加（t=1.96、2.49和3.42，P＜0.05）；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)1和2組微核率顯著減少（t=-2.34和-2.07，P＜0.05），實(shí)驗(yàn) 3～5組的微核率降低，但結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）.

表1 不同組處理后蠶豆根尖細(xì)胞微核統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 相關(guān)性分析

對(duì)在本實(shí)驗(yàn)中顯示適于進(jìn)行微核檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)1～4組進(jìn)行相關(guān)性分析.利用最小二乘法構(gòu)建的回歸方程為y=31.11x+15.74，r=0.962；對(duì)回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知，微核數(shù)在提取液稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)的線性回歸顯著（P＜0.05）.可知，在研究處理液濃度范圍內(nèi)，微核數(shù)隨著處理液濃度的升高而增加.

3 討 論

微核數(shù)據(jù)顯示，辣條提取液處理根尖后，可見(jiàn)微核數(shù)明顯升高，說(shuō)明其對(duì)染色體有損傷作用，使得細(xì)胞中微核數(shù)增加.實(shí)驗(yàn)1組因稀釋度高，其未造成與空白組的顯著差異，說(shuō)明稀釋200倍的提取液不具明顯遺傳毒性；實(shí)驗(yàn)2～4組與空白組處理效果形成顯著差異，說(shuō)明稀釋20～2倍的辣條提取液已具有明顯的遺傳毒性，但其食用安全性有待于進(jìn)一步研究確定；實(shí)驗(yàn)5組的微核率比實(shí)驗(yàn)4組有所降低，致畸作用未見(jiàn)顯著大于實(shí)驗(yàn)4組，且與空白組亦不具有顯著差異.

分析實(shí)驗(yàn)5組數(shù)據(jù)，這是因?yàn)槲⒑说男纬?，依賴于?xì)胞周期的正常發(fā)生，文中緩苗處理，也是期待受到環(huán)境誘導(dǎo)而發(fā)生損傷的染色體，在下一個(gè)細(xì)胞周期中的間期不能進(jìn)入到子核中，形成的染色體斷片或落后染色體成為獨(dú)立于子核以外的微核，以此反映實(shí)驗(yàn)因素的遺傳毒性.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)，實(shí)驗(yàn)5組的微核總數(shù)比空白組有顯著增大，但是分布極不平均，6個(gè)根尖細(xì)胞中出現(xiàn)的微核數(shù)分別為0、0、10、0、9和0個(gè)（共19個(gè)）；而實(shí)驗(yàn)4組的6個(gè)根尖細(xì)胞中出現(xiàn)的微核數(shù)分別為8、4、4、2、7和 5個(gè)（共 30個(gè)）.結(jié)合根尖表型及其細(xì)胞表現(xiàn)特點(diǎn)，推測(cè)實(shí)驗(yàn)5組由于細(xì)胞受損或細(xì)胞分裂受到抑制，導(dǎo)致微核數(shù)降低，甚至為0，其出現(xiàn)微核的細(xì)胞來(lái)自于2個(gè)根尖，其余4個(gè)根尖的細(xì)胞中未測(cè)出微核.進(jìn)一步觀測(cè)這4個(gè)根尖的細(xì)胞分裂水平，亦發(fā)現(xiàn)處于分裂期的細(xì)胞數(shù)顯著減少，表現(xiàn)為細(xì)胞分裂受到抑制，所以未能觀察到微核出現(xiàn).結(jié)合細(xì)胞學(xué)觀察，判斷實(shí)驗(yàn)5組的根尖細(xì)胞是由于細(xì)胞分裂受到抑制，影響了微核形成的過(guò)程，說(shuō)明其影響作用更為顯著，只是不適于利用微核檢測(cè)的方法判斷其遺傳毒性，這從另一面說(shuō)明高濃度提取液對(duì)染色體的影響非常嚴(yán)重.此研究結(jié)果與前人的工作相印證，所以微核試驗(yàn)分析需要確定待測(cè)因素的適用濃度范圍[25-26]，選擇適當(dāng)?shù)臐舛染哂兄匾饬x.如果處理液過(guò)濃，可以通過(guò)增加稀釋度，得到數(shù)據(jù)后再進(jìn)行數(shù)據(jù)校正，也可得到正確的結(jié)論.

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的微核數(shù)和微核千分率均有所減少，且實(shí)驗(yàn)1和2組微核數(shù)及微核千分率顯著減少，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)1和2組辣條提取液未達(dá)到5 mg/L環(huán)磷酰胺的遺傳毒性水平；實(shí)驗(yàn)3～5組的微核率降低，但結(jié)果無(wú)顯著性差異，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組3～5提取液的遺傳毒性與5 mg/L環(huán)磷酰胺相當(dāng)，由此進(jìn)一步確認(rèn)了此稀釋度范圍內(nèi)的辣條浸提液對(duì)染色體有明顯損傷作用，與對(duì)照組具有相同的遺傳毒性.

微核指數(shù)結(jié)果表明，不同稀釋度的辣條提取液均有一定遺傳毒性（IM＞1.50）.其中稀釋200倍的提取液具有輕度遺傳毒性，IM=1.55；其余提取液均具有中度遺傳毒性，IM為2.00～3.33.在實(shí)驗(yàn)2～4組稀釋度的范圍內(nèi)，隨著稀釋度的降低（濃度增大）微核數(shù)在增多，相關(guān)分析結(jié)果顯示，微核數(shù)與濃度的簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)高且線性回歸顯著，說(shuō)明在此研究稀釋度范圍內(nèi)，辣條提取液的濃度與誘導(dǎo)所產(chǎn)生的微核數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系.

辣條包裝上的成分表顯示，在其生產(chǎn)中使用了多種食品添加劑，包括了谷氨酸鈉、單硬脂酸甘油酯、丙三醇、環(huán)已基氨基硫酸銨、乳酸鈉、三氯蔗糖、特丁基對(duì)苯二酚、紐甜和食用香精香料等，成分過(guò)于復(fù)雜.結(jié)合本研究，有理由推測(cè)多種食品添加劑的使用，無(wú)論是劑量或種類的疊加作用都會(huì)對(duì)食品安全性產(chǎn)生不利的影響.

2019年12月10 日，我國(guó)市場(chǎng)監(jiān)管總局發(fā)布《關(guān)于加強(qiáng)調(diào)味面制品質(zhì)量安全監(jiān)管的公告》[20-21]顯示，各地市場(chǎng)監(jiān)管部門對(duì)“辣條”類食品統(tǒng)一按照“方便食品（調(diào)味面制品）”生產(chǎn)許可類別進(jìn)行管理，提出了更加嚴(yán)格的制作要求和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，凡與此不一致的，應(yīng)當(dāng)于2020年1月31日前調(diào)整到位.參照方便食品管理意味著，能添加的防腐劑僅為“乳酸鏈球菌素”，將大大減少添加劑的種類.而隨著其性質(zhì)的明確，辣條在添加劑使用、產(chǎn)品保質(zhì)期等方面將面臨更高的要求，這也意味著辣條行業(yè)生產(chǎn)將會(huì)更加規(guī)范化.

4 結(jié)束語(yǔ)

本研究利用微核檢測(cè)技術(shù)，以原提取液及不同稀釋倍數(shù)的辣條提取液處理蠶豆根尖細(xì)胞，表明實(shí)驗(yàn)稀釋度范圍內(nèi)的辣條提取液均可誘導(dǎo)微核產(chǎn)生，具有一定遺傳毒性，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng).辣條提取液越濃，對(duì)染色體具有明顯損傷作用.本研究是依據(jù)前人的工作，以蠶豆根尖細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行了研究分析.在今后的工作中，可以模式動(dòng)物作為研究對(duì)象進(jìn)行更深入研究，對(duì)辣條提取液中具體成分進(jìn)行具體毒理性分析，從而對(duì)確立辣條生產(chǎn)中的食品安全性指標(biāo)提供參考依據(jù).