黃瓜細(xì)菌性角斑病拮抗細(xì)菌的篩選及其防治效果

苑寶潔，李 磊，張紅杰，石延霞，柴阿麗，謝學(xué)文*，李寶聚*

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2. 河北北方學(xué)院，張家口 075000）

黃瓜細(xì)菌性角斑病是由扁桃假單胞流淚致病變種Pseudomonas amygdalipv.Lachrymans侵染引起的一種細(xì)菌性病害[1,2]，該病在苗期和成株期均可發(fā)生，苗期以子葉危害為主，成株期以葉片、葉柄以及卷須危害為主，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)還可造成莖蔓和果實(shí)的危害[3-5]，嚴(yán)重影響黃瓜產(chǎn)量。黃瓜細(xì)菌性角斑病菌主要在種子內(nèi)或隨病殘?bào)w殘留在土壤中存活，也可從傷口或氣孔侵入對(duì)黃瓜造成危害[6]。目前，黃瓜細(xì)菌性角斑病的防治主要依靠銅制劑及農(nóng)用抗生素等，與殺真菌的藥劑相比種類單一，且長期使用單一藥劑易造成抗藥性增強(qiáng)[7]。因此，有針對(duì)性地篩選黃瓜細(xì)菌性角斑病菌拮抗菌株，開發(fā)可以防治黃瓜細(xì)菌性角斑病的微生物殺菌劑是病害生物防治研究的重要方向。

芽胞桿菌具有強(qiáng)大的繁殖能力、對(duì)營養(yǎng)要求不高、在各種復(fù)雜的環(huán)境下都能夠生存等優(yōu)點(diǎn)，在生物防治中有巨大的開發(fā)潛力。已經(jīng)報(bào)道的能防治植物病害的芽胞桿菌主要有枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis、多粘類芽胞桿菌Paenibacillus polymyxa、蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis、地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis、蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus、側(cè)孢芽胞桿菌Bacillus laterosporus、短小芽胞桿菌Bacillus pumilus和貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis等[8,9]。

本試驗(yàn)旨在從黃瓜根際土壤中篩選出高效的生防細(xì)菌，并對(duì)其抑菌效果進(jìn)行初步研究，以期為黃瓜細(xì)菌性角斑病的生物藥劑開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種Pectobacterium carotovorumsubsp. carotovorum、扁桃假單胞流淚致病變種Pseudomonas amygdalipv. lachrymans、丁香假單胞番茄致病變種Pseudomonas syringaepv.tomato、西瓜嗜酸菌Acidovorax citrulli、野油菜黃單胞野油菜致病變種Xanthomonas campestrispv.campestris、密執(zhí)安棒桿菌馬鈴薯環(huán)腐致病變種Clavibacter michiganensesubsp.sepedonicums、茄匍柄霉Stemphylium solaniWeber、多主棒孢菌Corynespora cassiicola、炭疽菌Colletotrichumsp.、辣椒疫霉菌Phytophthora capsici、尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、西瓜殼二孢菌Ascochyta cittulinaSmith、茄鏈格孢菌Alternaria solani，以上菌株均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母提取物5 g、瓊脂18 g，1 L蒸餾水，用于拮抗菌株的分離和培養(yǎng)；NA固體培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g、蛋白胨 10 g、氯化鈉5 g、瓊脂 18 g，1 L蒸餾水，用于病原細(xì)菌的培養(yǎng)及拮抗試驗(yàn)；NB液體培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g、蛋白胨 10 g、氯化鈉5 g，1 L蒸餾水，用于病原細(xì)菌菌懸液的搖培；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g，1 L蒸餾水，用于病原真菌的培養(yǎng)及拮抗試驗(yàn)。

1.1.3 供試黃瓜品種 黃瓜品種“中農(nóng)6號(hào)”，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所選育。

1.2 拮抗細(xì)菌的分離及純化

先將從河北滄州，山東濰坊、壽光，北京通州、大興等地區(qū)采集的黃瓜根際土壤樣品中稱取10 g土樣放入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，置于28 ℃、180 r/min的搖床上震蕩30 min，土壤樣品充分懸浮后取出置于80 ℃的水浴鍋中水浴10 min，然后將土壤樣品按10-4、10-5、10-6進(jìn)行梯度稀釋，每個(gè)梯度吸取100 μL于LB平板上涂布，置于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，菌落長出后選取不同形態(tài)經(jīng)平板劃線法進(jìn)行純化后保存編號(hào)，備用[10-12]。

1.3 黃瓜細(xì)菌性角斑病拮抗細(xì)菌的篩選

以黃瓜細(xì)菌性角斑病為靶標(biāo)菌，采用雙層培養(yǎng)法[12]對(duì)1.2分離的拮抗細(xì)菌進(jìn)行篩選。首先將活化好的拮抗細(xì)菌和病原菌用無菌接種針挑取單菌落分別轉(zhuǎn)接到LB和NB液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃、180 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)24 h，制成菌懸液備用。在90 mm的LB固體培養(yǎng)皿中央點(diǎn)入5 μL待測(cè)拮抗細(xì)菌菌懸液，于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。待測(cè)拮抗細(xì)菌長出后取出培養(yǎng)皿倒置放入通風(fēng)櫥中，在每個(gè)培養(yǎng)皿的蓋子里加入3 mL氯仿，放置12 h取出。在4 mL 5%水瓊脂中加入100 μL黃瓜細(xì)菌性角斑病菌懸液，混勻后倒入LB平板中，作為上層。置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出觀察抑菌圈，并采用十字交叉法對(duì)抑菌圈的直徑進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算抑制率。抑菌率（%）＝抑菌直徑/對(duì)照菌落直徑×100。

1.4 拮抗細(xì)菌ZF145的鑒定

1.4.1 菌株ZF145形態(tài)觀察和生理特性測(cè)定 采用三線法用接種環(huán)挑取活化好的單菌落在 LB固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出觀察其菌落的顏色、形態(tài)和大小。依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，28 ℃培養(yǎng) 24～48 h后，對(duì)生理生化特征進(jìn)行鑒定[13]。

1.4.2 Biolog測(cè)定 挑取菌株ZF145單菌落接種至LB培養(yǎng)基試管斜面上，28 ℃培養(yǎng)24 h。由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心使用BIOLOG GENⅢ試劑盒（按照試劑盒說明書操作）對(duì)菌株ZF145進(jìn)行唯一碳源利用的測(cè)定。

1.4.3 多基因擴(kuò)增及序列分析 采用細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒（試劑盒購北京自天根生化科技有限公司）提取菌株ZF145的總DNA，利用細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），針對(duì)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)引物gyrB-F（5′-GCAGCAAAACAGT TATGATGAA-3′）和 R（5′-AGTCTTCTCCGATACCTGTGC-3′）、atpD-F（5′-ACAAGTTTGTCTTCCTC GCC-3′）和R（5′-TGAGGTCGCTCTTCATTTAGG-3′），菌株ZF145進(jìn)行PCR擴(kuò)增[11,15]。反應(yīng)總體系為50 μL，PCR 擴(kuò)增程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃補(bǔ)充延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物選用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物直接采用雙向測(cè)序方法進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序工作由北京博邁德生物技術(shù)有限公司完成。將所測(cè)得的菌株ZF145的16S rDNA序列分析上傳NCBI，利用NCBI的Blast數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)[14]，比對(duì)不同菌株的16S rDNA、atpD、gyrB基因，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其親緣關(guān)系。

1.5 菌株ZF145抑菌譜的測(cè)定

1.5.1 細(xì)菌抑菌譜測(cè)定 菌株ZF145對(duì)病原細(xì)菌的抑菌譜測(cè)定采取雙層培養(yǎng)的方法。方法參照1.3黃瓜細(xì)菌性角斑病拮抗細(xì)菌的篩選。

1.5.2 真菌抑菌譜測(cè)定 采用平板對(duì)峙法[15]檢測(cè)拮抗細(xì)菌對(duì)病原真菌的抑制效果。PDA平板中央接種直徑5 mm的待測(cè)病原菌菌餅，28 ℃培養(yǎng)2 d后，在距平板中央3.5 cm處接種5 μL OD600為0.8的拮抗菌株，以不接拮抗菌株為對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)5 d。每個(gè)處理重復(fù)3 次。測(cè)量靶標(biāo)菌的對(duì)照菌落半徑和處理菌落直徑，用抑菌率表示。抑菌率（%）＝（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100。

1.6 拮抗菌株ZF145對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的防治效果

1.6.1 盆栽防效 將病原菌和拮抗細(xì)菌在NA/LB固體平板上活化。28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后挑取單菌落轉(zhuǎn)接到NB/LB液體培養(yǎng)基，置于28 ℃、180 r/min搖床上培養(yǎng)36 h后制備成菌懸液待用。盆栽黃瓜長至2片真葉時(shí)，噴施1×108cfu/mL黃瓜細(xì)菌性角斑病菌懸浮液。接種病菌24 h后，采用噴霧接種法接種菌株ZF145菌懸液（1×108cfu/mL），以5%中生菌素可濕性粉劑為藥劑對(duì)照，清水對(duì)照只接致病菌不接生防菌。接菌后將黃瓜苗放入相對(duì)濕度 95%、溫度26 ℃～28 ℃保濕柜中保濕培養(yǎng)24 h，之后轉(zhuǎn)入相對(duì)濕度50%、溫度15 ℃～20 ℃的育苗溫室培養(yǎng)，重復(fù)3次。清水對(duì)照充分發(fā)病后計(jì)算病情指數(shù)與防治效果。黃瓜細(xì)菌性角斑?。喊唇前卟“咚既~片表面積進(jìn)行分級(jí)。0級(jí)：無病斑；1級(jí)：0～5%；3級(jí)：6%～25%；5級(jí)：26%～50%；7級(jí)：51%～75%；9級(jí)：75%以上。病情指數(shù)＝100×∑（各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×9），防治效果（%）＝100×（對(duì)照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)。

1.6.2 田間防效 本試驗(yàn)于2019年1月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院壽光蔬菜研發(fā)中心日光溫室內(nèi)檢測(cè)貝萊斯芽胞桿菌對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的田間防治效果。試驗(yàn)期間溫室內(nèi)按同一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行管理，在溫室內(nèi)設(shè)置3個(gè)獨(dú)立的隔離拱棚，每個(gè)拱棚長為10 m，寬為3 m，共計(jì)30 m2，每個(gè)拱棚內(nèi)種植2壟黃瓜，每壟種植33株，待黃瓜植株長至10片真葉時(shí)，采用噴霧接種法將1×108cfu/mL的黃瓜細(xì)菌性角斑病菌懸液接種于黃瓜植株上，每株黃瓜接種25 mL菌懸液，24 h后分別接種1×108cfu/mL貝萊斯芽胞桿菌ZF145菌懸液100倍液噴霧處理，5%中生菌素可濕性粉劑1000倍噴霧處理和清水對(duì)照。清水對(duì)照只接致病菌，待清水對(duì)照發(fā)病后，開始調(diào)查其他處理的病情指數(shù)，計(jì)算防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的分離篩選

采用平板稀釋法，對(duì)采集的7份黃瓜根際土壤樣品中的拮抗細(xì)菌進(jìn)行分離。最終獲得384株拮抗細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行保存、編號(hào)。通過雙層培養(yǎng)法測(cè)定對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的抑制效果，篩選到8株對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病抑制效果較好的拮抗菌株，其中菌株ZF145抑菌圈直徑最大（圖1），顯著高于其他菌株的抑菌直徑，為5.60 cm，抑制效果為62.22%（表1）。

圖1 菌株ZF145對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的抑制效果Fig. 1 The inhibitory effect of antagonistic strain ZF145 on bacterial angular leaf spot of cucumber

表1 拮抗細(xì)菌菌株對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的防效Table 1 Control effect of antagonistic bacterial strains on bacterial angular leaf spot of cucumber

2.2 拮抗細(xì)菌ZF145的鑒定

菌株ZF145在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，在LB固體培養(yǎng)皿上菌落為乳白色，邊緣不規(guī)則，有褶皺（圖2）。生理生化測(cè)定結(jié)果表明，菌株ZF145為革蘭氏陽性菌，在NaCl含量1%～8%的培養(yǎng)基上均能生長，檸檬酸鹽利用、明膠液化為陰性；Biolog檢測(cè)結(jié)果表明，菌株ZF145可以利用α-D-葡萄糖、氯化鋰、亞碲酸鉀、1%乳酸鈉，但不能利用 D-山梨醇、D-甘露醇、丙三醇、L-谷氨酸、D-天冬氨酸、D-絲氨酸，初步鑒定菌株 ZF145屬于芽胞桿菌屬（表2）。菌株 ZF145全基因組長 3929800 bp (登錄號(hào)GCA-014622705.1），分析菌株ZF145的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，該菌株與貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensisCP055160.聚在一簇，確定菌株ZF145為貝萊斯芽胞桿菌。

圖2 貝萊斯芽胞桿菌ZF145在LB培養(yǎng)基的菌落形態(tài)Fig. 2 The colony morphology ofBacillus velezensisZF145 on LB medium

表2 ZF145生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of ZF145

圖3 菌株ZF145基于多基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on the multigene sequences of strain ZF145

2.3 菌株ZF145抑菌譜的測(cè)定

拮抗菌株ZF145可以明顯抑制胡蘿卜軟腐果膠桿菌、丁香假單胞番茄致病變種、馬鈴薯環(huán)腐病菌、野油菜黃單胞野油菜致病變種和西瓜嗜酸菌5種病原細(xì)菌的生長，且對(duì)病原真菌也有明顯的抑制效果，可以抑制番茄匍柄霉病、灰葡萄孢、西瓜殼二孢、尖孢鐮孢菌、茄鏈格孢、辣椒炭疽病菌、多主棒孢菌、辣椒疫霉菌8種病原真菌的生長，表明拮抗菌株ZF145具有較為廣譜的抑菌能力（表3）。

表3 菌株ZF145對(duì)病原菌的抑菌效果Table 3 The inhibitory effect of ZF145 on 14 different pathogenic fungi

2.4 拮抗菌株ZF145對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病防治效果

2.4.1 盆栽防效 采用噴霧接種法對(duì)兩葉一心的黃瓜植株接種黃瓜細(xì)菌性角斑病菌4 d后，清水對(duì)照開始發(fā)病，其病情指數(shù)21.09，而接種拮抗菌株ZF145菌懸液（1×108cfu/mL）后，黃瓜植株的病情指數(shù)為6.10，防治效果為71.10%，與對(duì)照藥劑中生菌素的防治效果無明顯差異（表4）。研究表明從土壤樣品中分離出來的貝萊斯芽胞桿菌ZF145在溫室條件下對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病具有良好的防治效果。

表4 菌株ZF145對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的盆栽防治效果Table 4 Control effect of strain ZF145 on bacterial angular leaf spot of cucumber

2.4.2 田間防效 貝萊斯芽胞桿菌 ZF145按 108CFU/mL濃度施用時(shí)對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的防治效果為61.30%，對(duì)照藥劑5%中生菌素可濕性粉劑按1000倍施用時(shí)對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的防治效果為54.48%（表5），同等條件下，貝萊斯芽胞桿菌ZF145的防治效果高于對(duì)照藥劑中生菌素的防治效果，表明菌株ZF145在田間也具有較強(qiáng)的抑菌活性。

表5 菌株ZF145對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的田間防治效果Table 5 Control efficacy of antagonistic bacteria strain ZF145 on bacterial angular leaf spot of cucumber

3 討論

近年來，黃瓜細(xì)菌性角斑病發(fā)生嚴(yán)重，對(duì)黃瓜產(chǎn)量造成嚴(yán)重的威脅。目前，對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病的防治方法主要采用化學(xué)防治，但化學(xué)藥劑存在種類單一、抗藥性等問題[15]。而生物防治能有效地避免這些問題，并且可以達(dá)到一菌多防的效果[16,17]。大量研究發(fā)現(xiàn)，土壤中存在大量的拮抗細(xì)菌，可以抑制多種病原菌的生長。從馬鈴薯根際土壤中篩選到一株解淀粉芽胞桿菌 Z17-2，對(duì)馬鈴薯立枯絲核菌具有明顯的抑制作用[18]。因此，本試驗(yàn)以篩選黃瓜細(xì)菌性角斑病的高效生防菌株為出發(fā)點(diǎn)，從黃瓜根際土壤中分離出384株細(xì)菌菌株，并成功篩選獲得了1株對(duì)黃瓜細(xì)菌性角斑病具有良好拮抗能力的貝萊斯芽胞桿菌ZF145。其離體抑菌率為62.22%，盆栽防治效果為71.10%，田間防治效果為61.30%。

大量研究表明，對(duì)1種病原菌具有明顯抑制作用的拮抗菌株可能會(huì)對(duì)多種病原菌具有抑制效果，研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌可以有效的抑制多主棒孢病菌[19]、小麥赤霉病、立枯絲核菌[20]等病原菌的生長，李新宇[21]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌ZF 57可以有效抑制密執(zhí)安棒桿菌番茄潰瘍致病型、丁香假單胞菌番茄致病變種、胡蘿卜軟腐果膠桿菌、青枯雷爾氏菌、茄匍柄霉菌、多主棒孢菌的生長。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌ZF145可以有效抑制胡蘿卜軟腐果膠桿菌、丁香假單胞菌流淚致病變種、丁香假單胞菌番茄致病變種、密執(zhí)安棒桿菌馬鈴薯環(huán)腐致病變種、茄匍柄霉菌、灰葡萄孢菌、尖孢鐮孢菌等多種病原菌的發(fā)生，表明貝萊斯芽胞桿菌ZF145應(yīng)用空間較為廣泛。因此，以生防菌的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)可作為防治真菌病害及細(xì)菌病害的有效拮抗菌株，這表明貝萊斯芽胞桿菌ZF145在黃瓜細(xì)菌性角斑病防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景。