對(duì)韭菜遲眼蕈蚊高活性的蘇云金芽胞桿菌JQD117發(fā)酵培養(yǎng)基及搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

宋 健，張海劍，豐 碩，程佳旭，柳健虎，郭瑋冰，曹偉平

（河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保定 071000）

韭菜遲眼蕈蚊Bradysia odoriphagaYangetZhang屬雙翅目、長角亞目、眼蕈蚊科、遲眼蕈蚊屬，幼蟲俗稱“韭蛆”。韭菜遲眼蕈蚊是我國特有的昆蟲，目前國外尚無相關(guān)的報(bào)道[1]。它嚴(yán)重為害百合科、菊科、藜科、十字花科、葫蘆科、傘形花科等7科30多種蔬菜的地下嫩莖、主根、地面附近的皮下組織等，對(duì)韭菜的為害最為嚴(yán)重[2-4]。目前生產(chǎn)上對(duì)韭菜遲眼蕈蚊的防治主要以化學(xué)防治為主[5]，由于韭菜是多年生宿根植物，長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致“毒韭菜”事件時(shí)有發(fā)生。隨著高毒農(nóng)藥的禁用，尋找環(huán)境友好、安全有效的防治措施，成為防治韭菜遲眼蕈蚊急待解決的問題。

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）屬革蘭氏陽性細(xì)菌，在生長代謝過程中，能夠在芽胞中形成伴胞晶體，也稱為殺蟲晶體蛋白（insectidal crystal proteins，ICPs）或δ-內(nèi)毒素[6]。Bt主要是經(jīng)過蟲口進(jìn)行感染，通過殺蟲蛋白晶體殺死昆蟲，一般認(rèn)為其殺蟲作用過程要經(jīng)過溶解、酶解活化、與受體結(jié)合、插入以及孔洞或離子通道的形成等環(huán)節(jié)[7]，最后導(dǎo)致幼蟲麻痹死亡或引起敗血癥死亡[8]。據(jù)報(bào)道，Bt還具有抑制作用的殺菌蛋白或多肽[9]，如BtentomocidusHD110 產(chǎn)生的Entomocin 110能夠有效的抑制單增李斯特菌Listeria monocytogenes[10]。Bt對(duì)環(huán)境友好，對(duì)人畜無害，目前已成為世界上產(chǎn)量最大的微生物農(nóng)藥，被廣泛用于防治農(nóng)業(yè)、森林、果樹等害蟲防治中[11-13]。

雖然蘇云金芽胞桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的要求不高[14]，但不同的Bt菌株所需營養(yǎng)條件不盡相同，不能使用某一特定配方作為所有Bt菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基[15-17]。因此，進(jìn)行 Bt 菌株發(fā)酵培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件的選擇和配比優(yōu)化對(duì)提高菌株發(fā)酵產(chǎn)量極其重要。

Bt菌株JQD117是本試驗(yàn)室前期篩選到的一種對(duì)韭蛆具有較強(qiáng)殺蟲活性作用的菌株[18]，本研究采用單因素和響應(yīng)面分析法，以發(fā)酵液中活芽胞含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行篩選與優(yōu)化，以提高該菌株產(chǎn)生量，從而提高其殺韭蛆效率，為該菌株今后的工業(yè)化生產(chǎn)及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用提供初步指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

BtJQD117菌株保存于河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所微生物殺蟲劑課題組。

1.2 Bt發(fā)酵培養(yǎng)基及搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件單因素爬坡試驗(yàn) 在初始培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基：大豆餅粉 3.50%，棉籽餅粉1.50%，可溶性淀粉1.50%，酵母粉1.00%，CaCO30.20%，MnSO40.04%，MgSO40.02%，K2HPO40.05%；培養(yǎng)條件：30 ℃，接種量1%，250 mL三角瓶裝液量100 mL，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，初始pH 7.0）的基礎(chǔ)上，固定其他因子，對(duì)其中一個(gè)因子的量設(shè)梯度，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算活芽胞數(shù)。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析 在單因素爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，得到 13個(gè)因素的最佳值，以最佳值作為中心點(diǎn)，以Bt芽胞產(chǎn)量作為響應(yīng)值，采用Box-Behnken Design（BBD）進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素?。?1，0，1）三個(gè)水平輸入Design-Expert響應(yīng)面分析軟件設(shè)計(jì)13因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)（表1）。分別按照試驗(yàn)安排進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算活芽胞數(shù)，將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得回歸方程，最終確定因素的最佳組合。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.3 平板菌落計(jì)數(shù)法 根據(jù)稀釋梯度計(jì)算每毫升發(fā)酵液中活菌數(shù)量。將被測(cè)樣品用無菌蒸餾水稀釋至10-7和10-8兩個(gè)稀釋梯度，將稀釋后的待測(cè)樣品定量均勻涂布到滅菌的細(xì)菌培養(yǎng)平板上，每個(gè)處理重復(fù)3次，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并根據(jù)稀釋倍數(shù)和取樣量計(jì)算樣品的活芽胞數(shù)[19]。

1.2.4 模型驗(yàn)證 用軟件分析得出的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方和最佳發(fā)酵條件進(jìn)行4次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算活芽胞數(shù)，取得平均值。與預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較以驗(yàn)證模型的可靠性，進(jìn)而得出最終優(yōu)化結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素爬坡試驗(yàn)結(jié)果

芽胞產(chǎn)量同培養(yǎng)基濃度和發(fā)酵條件的關(guān)系研究表明，Bt芽胞產(chǎn)量隨著培養(yǎng)基濃度增加呈先增加后減少的趨勢(shì)。發(fā)酵培養(yǎng)基各因素的最佳值：棉籽餅粉2.00%，大豆餅粉1.00%，酵母粉1.50%，可溶性淀粉2.00%，CaCO30.30%，MnSO40.04%，MgSO40.1%，K2HPO40.04%；Bt芽胞產(chǎn)量隨著發(fā)酵條件的變化呈先增加后減少的趨勢(shì)，發(fā)酵條件各因素的最佳值：接種量3%、裝液量60 mL、溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min、初始pH 7.59（圖1，2）。

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基各成分不同濃度對(duì)Bt產(chǎn)芽胞量的影響Fig. 1 Effect of different concentration of components in fermentation medium on the number of Bt spores

圖2 不同發(fā)酵條件對(duì)Bt產(chǎn)芽胞量的影響Fig. 2 Effect of different flask fermentation conditions on the number of Bt spores

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

以芽胞產(chǎn)量為響應(yīng)值，應(yīng)用回歸分析對(duì)方程和各因子進(jìn)行方差分析（表2），結(jié)果表明回歸方程顯著性檢測(cè)P＜0.0001，說明該方程模型屬于極顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著；回歸方程模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合性較好，實(shí)驗(yàn)誤差小，模型是可行的，數(shù)據(jù)是可信的，證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化菌株Bt JQD117的發(fā)酵培養(yǎng)基及搖瓶發(fā)酵條件是可行的，具有參考性。各因素對(duì) Bt芽胞產(chǎn)量的影響次序?yàn)椋好拮扬灧郏狙b樣量＞K2HPO4＞轉(zhuǎn)速＞大豆餅粉＞溫度＞pH＞接種量＞MnSO4＞酵母粉＞CaCO3＞可溶性淀粉＞MgSO4。經(jīng)回歸擬合后，根據(jù)回歸方程，考察擬合相應(yīng)曲面的形狀，通過分析碳源、氮源、無機(jī)鹽和發(fā)酵條件等13個(gè)因素對(duì)產(chǎn)芽胞量的影響，發(fā)現(xiàn)棉籽餅粉與其他 12項(xiàng)因素交互作用均顯著，其中，棉籽餅粉和裝樣量對(duì)Bt的產(chǎn)芽胞量影響最顯著（等高線較其他因素的等高線陡峭），K2HPO4、轉(zhuǎn)速和大豆餅粉次之（圖3）。通過Design Expect 8.0軟件分析確定最優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)Bt芽胞產(chǎn)量最大時(shí)，可求得各因素水平：A＝1.5%，B＝3%，C＝2.94%，D＝0.5%，E＝0.496%，F(xiàn)＝0.021%，G＝0.035%，H＝0.215%，J＝30.85 ℃，K＝122.23 r/min，L＝30 mL，M＝7.93，N＝1.28%；進(jìn)行編碼轉(zhuǎn)化后得到最佳固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：大豆餅粉 1.5%，棉籽餅粉3%，可溶性淀粉2.94%，酵母粉0.5%，CaCO30.496%，MnSO40.021%，K2HPO40.035%，MgSO40.215%，最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度30.85 ℃，轉(zhuǎn)速122.23 r/min，裝量30 mL/250 mL三角瓶，起始pH 7.93，接種量1.28%。在此理論最佳發(fā)酵條件下，回歸方程預(yù)測(cè)Bt JQD117理論芽胞產(chǎn)量可達(dá)到6.75×109芽胞/mL。

圖3 二因素交互影響B(tài)t產(chǎn)芽胞量等高線圖Fig. 3 Contour chart of two factors interaction affects Bt spores

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸方程方差分析Table 2 Analysis of variance of regression equation in response surface test

續(xù)表2

續(xù)表2

2.3 模型驗(yàn)證結(jié)果

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的可靠性，在上述理論最佳發(fā)酵條件下進(jìn)行4次重復(fù)平行驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Bt JQD117菌株實(shí)際芽胞產(chǎn)量平均值為5.97×109個(gè)/mL，與模型預(yù)測(cè)值6.75×109個(gè)/mL無顯著差異。這證明了方程模型數(shù)據(jù)的可靠性，證明響應(yīng)面分析法優(yōu)化 Bt發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件是有效的。相比于初始培養(yǎng)基的芽胞產(chǎn)量2.5×109個(gè)/mL，優(yōu)化后的工藝發(fā)酵水平提高138.8%。

3 討論

在微生物發(fā)酵生產(chǎn)過程中，發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化起著至關(guān)重要的作用，其不僅對(duì)發(fā)酵水平的提高有著舉足輕重的作用，而且也是決定該微生物能否成功商業(yè)化的關(guān)鍵所在。由于微生物發(fā)酵過程是十分復(fù)雜、高度非線性和非結(jié)構(gòu)化的，建立一個(gè)準(zhǔn)確適合的模型指導(dǎo)其發(fā)酵過程存在著許多困難[20]。因而選擇合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化方法對(duì)培養(yǎng)基的優(yōu)化十分關(guān)鍵。

響應(yīng)面分析法是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法并通過實(shí)驗(yàn)得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法。相較于傳統(tǒng)利用回歸正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)菌株培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，不僅克服了后者不能排除交互作用混雜影響的缺點(diǎn)，而且同時(shí)對(duì)試驗(yàn)各單因子及其交互作用做評(píng)價(jià)，建立連續(xù)變量曲面模型，能快速準(zhǔn)確地確定各發(fā)酵條件的最優(yōu)值，相較于同類研究中的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)最優(yōu)發(fā)酵條件篩選更加精確，優(yōu)化后的發(fā)酵水平提升也更加明顯。

Sumant等[21]利用響應(yīng)面分析法對(duì)一株產(chǎn)堿性蛋白酶的芽胞桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，使其堿性蛋白酶產(chǎn)量提高了2.6倍。周虓等[22]將單因子優(yōu)化與響應(yīng)面結(jié)合，優(yōu)化了產(chǎn)耐高溫蛋白酶 Bt FZ62的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵水平比初始設(shè)計(jì)提高了3.22倍；鄭毅等[23]將二水平Plackett-Burman設(shè)計(jì)與響應(yīng)面相結(jié)合優(yōu)化了產(chǎn)耐高溫蛋白酶Bt FS140的發(fā)酵培養(yǎng)基，F(xiàn)S140最終發(fā)酵產(chǎn)酶水平達(dá)918.91 U/mL；楊梅等[24]應(yīng)用上述方法對(duì)Bt LLB19的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，較初始培養(yǎng)基芽胞產(chǎn)量提高了24.6%；陳宇熹等[15]應(yīng)用此法優(yōu)化了高效殺蚊Bt BRC-LLP29的發(fā)酵培養(yǎng)基；張群林等[25]采用此法優(yōu)化了Bt BRC-ZQL3的發(fā)酵培養(yǎng)基，比初始發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)孢水平提高了60.66%；成飛雪等[16]采用此法優(yōu)化了Bt YC-10的發(fā)酵培養(yǎng)基，比優(yōu)化前提高了29.5%；李姝江等[26]利用響應(yīng)面法優(yōu)化貝萊斯芽胞桿菌ZJ20發(fā)酵參數(shù)，菌落數(shù)達(dá)769×107CFU/mL，比優(yōu)化前提高了17.71倍。本試驗(yàn)利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)相結(jié)合的方法，優(yōu)化出Bt JQD117菌株最佳培養(yǎng)基和發(fā)酵條件：大豆餅粉1.5%，棉籽餅粉3%，可溶性淀粉2.94%，酵母粉0.5%，CaCO30.496%，MnSO40.021%，K2HPO40.035%，MgSO40.215%；最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度30.85 ℃，轉(zhuǎn)速122.23 r/min，裝量30 mL/250 mL三角瓶，起始pH 7.93，接種量1.28 %。優(yōu)化后發(fā)酵理論芽胞產(chǎn)量達(dá)到6.75×109個(gè)/mL，驗(yàn)證后實(shí)際為5.97×109個(gè)/mL，產(chǎn)生此情況的原因可能是由于發(fā)酵培養(yǎng)基在實(shí)際發(fā)酵過程中，隨著細(xì)菌的生長和芽胞數(shù)量的逐漸增加，影響了發(fā)酵pH和氧氣濃度變化，造成最終芽胞產(chǎn)量的變化，但兩者無顯著性差異。說明利用響應(yīng)面分析法進(jìn)行Bt菌株JQD117發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化是合理可靠的。優(yōu)化后發(fā)酵水平相比于初始培養(yǎng)基的芽胞產(chǎn)量（2.5×109個(gè)/mL），提高了38.8 %。

目前，有關(guān)Bt培養(yǎng)優(yōu)化方面的研究已有不少文獻(xiàn)報(bào)道，基本都以發(fā)酵液中菌體濃度或活芽胞產(chǎn)量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，本文在 Bt培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究中，也是以發(fā)酵液中活芽胞產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)來進(jìn)行衡量的，該方法簡(jiǎn)便、快捷、易操作，同時(shí) Bt菌株在發(fā)酵過程中芽胞的產(chǎn)生與晶體蛋白含量具有一定的相關(guān)性。因此在今后菌株的開發(fā)和生產(chǎn)中以及對(duì)該菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)作用。